Abstract
Selv om virkningene av sanguinarin, en benzophenanthridine alkaloid, på hemming av enkelte typer kreft celle vekst er etablert, de underliggende mekanismene er ikke helt forstått. Denne studien undersøkte mulige mekanismer som sanguinarin utøver sin kreft handling i dyrkede humane blærekreft cellelinjer (T24, EJ, og 5637). Sanguinarin behandling resulterte i konsentrasjons-respons vekstinhibering av blærekreft celler ved indusering av apoptose. Sanguinarin-indusert apoptose ble korrelert med oppregulering av Bax, nedregulering av bud og XIAP, aktivering av kaspaser (-3, -8 og -9), og genereringen av økte reaktive oksygenarter (ROS) . ROS gatefeier N-acetylcystein (NAC) helt snudd de sanguinarin-utløst apoptotiske hendelser. I tillegg sanguinarin effektivt økt aktivering av c-Jun N-terminal kinase (JNK) og ekspresjon av den tidlige vekstrespons gen-1 (EGR-1), som ble gjenvunnet ved behandling med NAC. Videre knockdown av
Egr-1
ekspresjon av små interfererende RNA dempes sanguinarin-indusert apoptose, men ikke JNK-inhibitor, noe som indikerer at avskjæring av ROS generasjon blokkerte sanguinarin-induserte apoptotiske effekter via deregulering av ekspresjonen av EGR-1 proteiner. Til sammen dataene dokumentere at sanguinarin er en potent antikreftmiddel, noe som hemmer veksten av blære kreft celler og induserer deres apoptose gjennom generering av frie radikaler
Citation. Han MH, Park C, Jin CY Kim GY, Chang YC, Moon SK, et al. (2013) apoptoseinduksjon of Human blæren kreftceller ved sanguinarin gjennom reaktive oksygen arter-mediert oppregulering av tidlig vekst Response Gene-en. PLoS ONE 8 (5): e63425. doi: 10,1371 /journal.pone.0063425
Redaktør: Subhash Gautam, Henry Ford Health System, USA
mottatt: 19 februar 2013; Godkjent: 01.04.2013; Publisert: May 22, 2013
Copyright: © 2013 Han et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av National Research Foundation of Korea (NRF) finansiert av Korea regjeringen (2012-0000476 og 2012046358) den. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Benzo [c] fenantridin alkaloider (Bas) er en forholdsvis liten gruppe isochinoline alkaloider, som har blitt påvist i mange plantearter familiene Papaveraceae, Fumariaceae, Ranunculaceae, og Rutaceae [1]. Sanguinarin er en kvartære ammonium salt som tilhører denne gruppen av forretningsområdene. Det har blitt hentet fra noen planter, inkludert bloodroot (
Sanguinaria canadensis
L.), den meksikanske stikkende valmue
Argemone mexicana
L.,
Chelidonium majus, etter og
Macleaya cordata
. [2], [3]. Sanguinarin har vist seg å ha kraftig antibakteriell og anti-inflammatoriske egenskaper [4] – [6]. Nyere data har også vist at denne forbindelse kan indusere apoptose i en rekke kreftcellelinjer
in vitro
; men det viser ikke noen giftige effekter på normale celler når det gis ved tilsvarende doser [7] – [16]
reaktive oksygenforbindelser (ROS) er svært reaktive molekyler.. De omfatter superoksydanion radikaler, hydrogenperoksid, singlett oksygen og hydroksyl-radikaler. ROS er generelt avledet fra den normale metabolisme av oksygen, og mitokondrier er den primære kilde til ROS. Selv om det basale nivåer av ROS tjene som en fysiologisk regulator i normal celleproliferasjon og differensiering, kan høye nivåer av ROS forårsake alvorlig skade på DNA og proteiner, noe som fører til apoptose [17] – [19]. I tillegg overdreven oksidativt stress rettet spesielt mitokondriene, forårsaker et tap av mitokondriemembranen potensial (
ΔΨm
) og mitokondrier-mediert apoptose [17] – [19]. Nyere studier tyder på at produksjonen av ROS etter sanguinarin initierer kaskader av celledød signaler i noen menneskelige kreftcellelinjer
in vitro product: [12], [13], [15].
reaktivt oksygen arter (ROS) er svært reaktive molekyler. De omfatter superoksydanion radikaler, hydrogenperoksid, singlett oksygen og hydroksyl-radikaler. ROS er generelt avledet fra den normale metabolisme av oksygen, og mitokondrier er den primære kilde til ROS. Selv om det basale nivåer av ROS tjene som en fysiologisk regulator i normal celleproliferasjon og differensiering, studier har vist at høye nivåer av ROS kan forårsake alvorlig skade på DNA og proteiner, noe som fører til apoptose [17] – [19]. I tillegg overdreven oksidativt stress rettet spesielt mitokondriene, forårsaker et tap av mitokondriemembranen potensial (
ΔΨm
) og mitokondrier-mediert apoptose [17] – [19]. Nyere studier har antydet at produksjonen av ROS etter sanguinarin initierer kaskader av celledød signaler i noen menneskelig kreft cellelinjer
in vitro product: [12], [13], [15].
Blant mange redoks-regulerte gener, er den tidlige vekstrespons-1 (EGR-1), en sink-finger transcriptional faktor, av interesse fordi den er hurtig og forbigående indusert av et antall ekstracellulære stimuli [20] – [22] og av alle indusere av ROS-mediert signalisering og inflammasjon [23] – [28]. Derfor kan Egr-en spille en avgjørende rolle i koordineringen av cellulære hendelser følgende oxidantive stresset [29] – [31]. Imidlertid har rollen som Egr-en i apoptose signalveier aktivert av ROS i kreftceller behandlet med sanguinarin ikke blitt avgrenset.
I denne studien brukte de menneskelige blærekreft cellelinjer, T24, EJ, og 5637, å undersøke cytotoksiske effekten av sanguinarin og å undersøke de molekylære mekanismene bak den apoptotiske aktivitet forårsaket av sanguinarin. Resultatene viste at sanguinarin-induserte apoptotiske signalveier modulerte aktiviteten av Bcl-2 og inhibitoren av apoptose protein (IAP) familie proteiner og førte til mitokondriell dysfunksjon, aktivering av kaspaser og induksjon av Egr-1. Resultatene har også antydet at ROS er kritiske regulatorer av sanguinarin-indusert apoptotiske hendelser.
Materialer og metoder
Cell Kultur og celleviabilitet analysen
Menneskeblærekreftcellelinjer ( T24, EJ, og 5637) ble oppnådd fra American Type Culture Collection (Rockville, MD, USA). Cellene ble dyrket i RPMI 1640 medium, supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS, Gibco-BRL, Gaithersburg, MD, USA) og 1% penicillin-streptomycin ved 37 ° C i et fuktig miljø inneholdende 5% CO
2. Sanguinarin (Sigma-Aldrich Chemical Co., St. Louis, MO, USA) ble oppløst i metanol som en stamoppløsning med en 10 mM konsentrasjon og ble lagret i alikvoter ved -20 ° C. For celleviabilitet studien, ble cellene sådd ut i 6-brønns plater ved en tetthet på 1 x 10
5 celler per brønn. Etter 24 timers stabilisering, ble cellene behandlet med forskjellige konsentrasjoner av sanguinarin i ytterligere 24 timer. Etter behandling, ble levedyktighet av cellene bestemt med 3- (4,5-dimetyltiazol-2-yl) -2,5-difenyltetrazoliumbromid (MTT, Sigma-Aldrich) assay, som er basert på omdannelsen av MTT til MTT-formazan ved mitokondrielle enzymer.
nukleær farging med DAPI
etter behandling av cellene med sanguinarin i 24 timer, ble de høstet, vasket i iskald fosfat-bufret saltvann (PBS), og fiksert med 3,7% paraformaldehyd (Sigma-Aldrich) i PBS i 10 minutter ved romtemperatur. De fikserte cellene ble vasket med PBS og farget med et 4,6-diamidino-2-fenylindol (DAPI, Sigma-Aldrich) oppløsning (2,5 ug /ml) i 10 minutter ved romtemperatur. Endringer i kjernemorfologi av cellene ble analysert ved hjelp av et fluorescens mikroskop (Carl Zeiss, Tyskland).
Flow Cytometry Analyse for sub-G1 fase
Cellene ble høstet og vasket en gang med PBS, fiksert i iskald 70% etanol og lagret ved 4 ° C. Før analyse ble cellene vasket en gang med PBS, suspendert i 1 ml av en kald propidiumjodid (PI, Sigma-Aldrich) oppløsning inneholdende 100 mg /ml RNase A, 50 ug /ml PI, 0,1% (w /v) natriumcitrat og 0,1% (volum /volum) NP-40 og videre inkubert på is i 30 min i mørket. Flow-cytometriske analyser ble utført ved anvendelse av et strømningscytometer (FACS Calibur; Becton Dickinson, San Jose, CA, USA), og celle-Quest pro programvare ble benyttet for å bestemme den relative DNA-innhold basert på tilstedeværelsen av rød fluorescens [19].
Påvisning av apoptose av Annexin V-FITC Farging
cellene ble vasket med PBS og resuspendert i et annexin-V-bindingsbuffer inneholdende 10 mM HEPES /NaOH (pH 7,4), 140 mM NaCl og 2,5 mM CaCl
2. Alikvoter av cellene ble inkubert med annexin V-fluorescein-isotiocyanat (FITC, R Amersham Corp., Arlington Heights, IL, USA) i henhold til den anbefalte prosedyren. De primære antistoffer ble innkjøpt fra Santa Cruz Biotechnology Inc. (Santa Cruz, CA, USA) og Cell Signaling Technology Inc. (Boston, MA, USA). Peroksidasemerket esel antikanin immunoglobulin og peroksidase-merket sau-anti-immunglobulin ble kjøpt fra Amersham Corp.
In vitro caspase aktivitet analysen
caspase aktiviteter ble bestemt av kolorimetriske analyser ved hjelp av caspase-3, -8 og -9 aktiveringssett i henhold til produsentens protokoll (R 0,05 ble akseptert som en indikasjon på statistisk signifikans
Resultater
Effekter av sanguinarin på Cell Livskraftig og apoptoseinduksjon
Å. undersøke om sanguinarin inhiberte proliferasjonen av blærecancerceller, tre blærecancercellelinjer (T24, EJ, og 5637) ble stimulert med de angitte konsentrasjoner av sanguinarin i 24 timer, og en MTT-analysen ble utført. Som vist på fig. 1, ved behandling med sanguinarin redusert levedyktighet blærekreftceller i en konsentrasjonsavhengig måte. Således ble ytterligere eksperimenter utført for å bestemme hvorvidt denne inhiberende effekt av sanguinarin på levedyktigheten av cellene var resultatet av apoptotisk celledød. Først DAPI farging bestemt morfologiske forandringer i cellene, som vist i fig. 2A. Behandling med 1,5 uM sanguinarin resulterte i et signifikant antall celler med kromatin kondensasjon, tap av nukleær konstruksjon, og dannelse av apoptotiske legemer, mens disse funksjonene ikke ble observert i kontrollceller. For det andre, flowcytometrisk analyse for påvisning av hypodiploid cellepopulasjoner bestemt grader av apoptose i celler behandlet med sanguinarin. Som indikert i fig. 2B, tilsetning av 1,5 pM sanguinarin til blæreceller resulterte i økte ansamlinger av celler i sub-G1 fase. For det tredje, analyserer strømningscytometri med annexin V og PI farging bestemmes av størrelsen av apoptose fremkalt av sanguinarin. Som vist på fig. 2C, antallet annexin-V-positive celler viste en markert økning i den sanguinarin-behandlede celler sammenlignet med ubehandlede kontrollceller. Følgelig tyder disse data på at blærecancerceller kan gjennomgå apoptose etter eksponering for sanguinarin.
T24, 5637, og EJ celler ble behandlet med de angitte konsentrasjoner av sanguinarin i 24 timer, i henhold til målinger av cellelevedyktighet med en MTT analyse. Data er rapportert som gjennomsnitt ± SD fra tre uavhengige eksperimenter. Signifikant forskjellig fra kontrollen, *
p
. 0,05
(A) Cellene ble inkubert med 1,5 mikrometer sanguinarin i 24 timer og deretter farget med DAPI. De fargede kjerner ble så observert under et fluorescerende mikroskop (forstørrelse x 400) ved bruk av et blått filter. (B) For å kvantifisere graden av apoptose indusert av sanguinarin, ble cellene evaluert for sub-G1 DNA-innhold ved hjelp av et strømningscytometer. (C) Cellene ble farget med FITC-konjugert annexin-V og PI for strømningscytometri-analyse. Den apoptotiske celler ble bestemt ved telling av prosentandelen av annexin V (+), PI (-) celler, og prosentandelen av annexin V (+), PI (+) celler. Data er rapportert som gjennomsnitt ± SD fra tre uavhengige eksperimenter. Signifikant forskjellig fra kontrollen, *
p
. 0,05
Modulation av Bcl-2 og IAP Familie Proteiner, og aktivering av caspase av sanguinarin
rollen til Bcl-2 og IAP-familieproteinene ble bestemt ved Western-blotting for å undersøke hvilke mekanismer som var involvert i den sanguinarin-indusert apoptose i blærekreftceller. Som vist på fig. 3A, fikk behandling av blære kreft celler med 1,5 mikrometer sanguinarin ikke føre til vesentlige endringer i uttrykket av antiapoptotic proteiner Bcl-2 og Bcl-XL. Nivåene av proapoptotiske Bax økt og de av antiapoptotic protein XIAP redusert som svar på sanguinarin. I tillegg reduksjonen i proapoptotiske Bud proteiner viste en markant økning med sanguinarin behandling i alle blære kreft cellelinjer. For å bestemme hvorvidt sanguinarin-indusert apoptose var assosiert med aktivering av kaspaser, ble ekspresjon og aktivitet av kaspaser i sanguinarin-behandlede celler undersøkt. Resultatene viste at sanguinarin behandling nedregulert nivåene av de procaspase-3-proteiner og økte nivåer av aktiv caspase-3. Nivåene av procaspase-8 og -9-proteinene ble også nedregulert i sanguinarin-behandlede celler (fig. 3B). For ytterligere kvantifisering av den proteolytiske aktivering av procaspase-3, -8 og -9, ble lysatene utlignet av proteinet fra cellene behandlet med sanguinarin analysert med hensyn til deres enzymatiske aktiviteter. Som vist på fig. 3C, den sanguinarin behandling markant økt sine caspase aktiviteter. Påfølgende Western blot-analyser viste progressiv proteolytisk spaltning av poly (ADP-ribose) polymerase (PARP) protein, som er en nedstrøms mål for den aktiverte caspase-3 [33], i cellene etter at sanguinarin behandling (Fig. 3B) .
(A og B) etter 24 timers inkubering med sanguinarin, de cellulære proteiner ble separert ved SDS-polyakrylamidgeler og overført på nitrocellulosemembraner. Membranene ble probet med de angitte antistoffer, og proteinene ble visualisert ved anvendelse av en ECL-påvisningssystem. For å bekrefte lik belastning, aktin ble benyttet som en intern kontroll. (C) For å analysere
in vitro
kaspase-aktivitet, aliquoter ble inkubert med DEVD-pNA, IETD-pNA, og LEHD-pNA som substrat for caspase-3, -8, -9 og, henholdsvis, og da de frigitte fluorescens produktene ble målt. Hvert punkt representerer gjennomsnitt ± SD av de representative eksperimenter utført minst tre ganger. En Student
t
-test (*
p
0,05 vs. ubehandlet kontroll). Ble brukt til å analysere statistisk signifikans av resultatene
Sanguinarine- indusert apoptose er knyttet til generasjon av ROS
for å finne ut om sanguinarin-indusert apoptose var assosiert med ROS-mediert oksidativ stress, ble intracellulær ROS produksjon målt med DCFH-DA fluorescens analysen bruker en strømningscytometer. Som indikert i fig. 4A, når cellene ble utsatt for sanguinarin, nivået av intracellulær ROS drastisk økning på 30 minutter (mer enn en 8-gangers økning sammenlignet med kontrollen), og det ble redusert med tid deretter. Forutgående behandling av cellene med et velkjent ROS scavenger, N-acetylcystein (NAC), sterkt redusert dette økt ROS nivået i sanguinarin-behandlede celler. Produksjonen av intracellulær ROS ble også overvåket av fluorescensemisjonen fra DCFH-DA i T24-celler ved å bruke et fluorescerende mikroskop. Den økte intensiteten av DCF-DA-farging observert i sanguinarin-behandlede celler var tidsavhengig opphevet for å styre nivåene i nærvær av NAC (Fig. 4B). For å bestemme hvorvidt sanguinarin-induserte ROS produksjon kunne tilskrives den apoptose-induksjon, ble cellene behandlet med NAC i 1 time og ko-inkubert med sanguinarin i ytterligere 24 timer. Som vist på fig. 5A, de inhiberende virkninger av NAC på sanguinarin-indusert ROS produksjon korrelerte med en markert hemming av apoptotisk celledød målt ved flowcytometer. Videre blokkerer genereringen av ROS ved forbehandling av cellene med NAC forhindret sanguinarin-indusert aktivering av kaspaser, spalting av PARP, og modulering av Bcl-2 og IAP-familie proteiner (fig. 5B og C). Samlet utgjør disse data tyder på at en ROS-genererer systemet spiller en avgjørende rolle i sanguinarin-indusert apoptose i blæren kreftceller.
(A) Cellene ble inkubert med 1,5 mikrometer sanguinarin i de angitte tidsrom, eller de ble forbehandlet med 10 mM NAC i 1 time og videre behandlet med 1,5 uM sanguinarin i de angitte tidsrom. De ble deretter farget med DCFH-DA. ROS generasjonen ble målt ved anvendelse av et flowcytometer. Hvert punkt representerer middelverdien av representative eksperimenter utført to ganger. (B) DCFH fluorescens i T24-celler dyrket under de samme betingelser som (A) ble bestemt i henhold til fluorescens ved hjelp av et grønt filter. Minst fem felter ble vist i hvert av eksperimentene.
(A) Cellene ble behandlet med eller uten NAC (10 mM) i 1 time før utfordring med 1,5 uM sanguinarin i 24 timer. De ble samlet og farget med FITC-konjugert annexin-V og PI for strømningscytometri-analyse. Data er rapportert som gjennomsnitt ± SD fra tre uavhengige eksperimenter. En Student
t
-test (*
p
0,05 vs. ubehandlet kontroll;
#
p
0,05 vs. sanguinarin-behandlede celler) var brukes til å analysere den statistiske signifikans av resultatene. (B) De ble deretter høstet, og de angitte proteiner ble påvist ved Western blot-analyse. Aktin ble anvendt som en intern kontroll. (C) For å analysere
in vitro
kaspase-aktivitet, aliquoter ble inkubert ved 37 ° C i 1 time, og de frigitte fluorescens-produktene ble målt. Hvert punkt representerer gjennomsnitt ± SD av representative eksperimenter utført minst tre ganger. En Student
t
-test (*
p
0,05 vs. ubehandlet kontroll;
#
p
0,05 vs. sanguinarin-behandlede celler) var brukes til å analysere statistisk signifikans av resultatene.
sanguinarin-indusert apoptose er ikke forbundet med aktivering av JNK
Mange tidligere rapporter tydet på at cytotoksiske ROS signale syntes å være formidlet, delvis ved aktivering av c-Jun-N-terminal kinase (JNK) kaskade i stedet for p38 mitogen-aktivert proteinkinase (MAPK) eller det ekstracellulære signalregulerte kinase (ERK) [34] – [36]. Dermed studien undersøkte involvering av JNK i sanguinarin-indusert apoptose. Som vist på fig. 6A, fosforylering av JNK var påvisbar etter så lite som 15-30 min av sanguinarin behandling og vedvarte i minst 1-4 h av behandlingen. Imidlertid ROS-passiveringsmidlet NAC blokkerte fullstendig den forbedrede fosforylering av JNK (fig. 6B). Disse resultatene indikerte at JNK-reaksjonsveien ble aktivert i en ROS-avhengig måte i respons til nærværet av sanguinarin. For å avgjøre om aktivering av JNK deltok i apoptose, ble effekten av en bestemt JNK-hemmer, SP600125, på sanguinarin-behandlede celler testet. Resultatene viste at SP600125 forbehandlingen ikke dempe akkumuleringen av apoptotiske celler i forhold til celler behandlet med SP600125 alene (Fig. 6C). Dataene indikerer at ROS-avhengig fosforylering JNK ikke oppstår oppstrøms for sanguinarin-indusert apoptose i blærecancerceller.
(A) Cellene ble behandlet med sanguinarin i de angitte tidsrom, eller (B) de ble forbehandlet med NAC i 1 time og utfordret med sanguinarin i 24 timer. De ble deretter høstet, og de angitte proteiner ble påvist ved Western blot-analyse ved anvendelse av anti-p-JNK, anti-JNK-antistoffer, og en ECL påvisningssystem. (C) Cellene ble behandlet med eller uten SP600125 i 1 time før utfordring med sanguinarin i 24 timer. Cellene ble analysert ved hjelp av et strømningscytometer for å bestemme annexin-V. Data er rapportert som gjennomsnitt ± SD fra tre uavhengige eksperimenter. For statistisk analyse,
t
-test ble utført (*
p
0,05 vs. ubehandlede celler).
Association of ROS-avhengige Up regulering av Egr-en med sanguinarin-indusert apoptose
til slutt, den potensielle forholdet mellom sanguinarin-indusert apoptose og Egr-1 uttrykk ble undersøkt. Som vist på fig. 7A, tidsforløpet analyser viste at 1,5 uM av sanguinarin indusert Egr-1-proteiner innen 2 timer, og dette førte ikke vende tilbake til basislinjen i 4 timer. Som sanguinarin generert ROS i 0,5 timer, nivåer av ROS sank etter 2 timer (fig. 4), og ekspresjon av Egr-1 av sanguinarin maksimalt økte over 2-4 timer behandlingsperioden, potensiell ROS-indusert regulering av induksjons av EGR-1 ble undersøkt. Immunoblotting data indikerte at blokkerer genereringen av ROS ved forbehandling av cellene med NAC markert elimineres sanguinarin-indusert Egr-1-proteiner i de tre cellelinjer (Fig. 7B). For å undersøke hvilken rolle Egr-1 i sanguinarin-indusert apoptose, Egr-en genekspresjon var vellykket nedregulert ved hjelp Egr-en siRNA (Fig. 7C). Dens effekt på PARP-spaltning, så vel som på apoptose-induksjon, ble deretter evaluert. Som vist på fig. 7D og E, inhibering av Egr-1-ekspresjon effektivt dempet sanguinarin-induserte nedbrytning av PARP og akkumuleringen av apoptotiske sub-G1-celler. Resultatene bekrefter at induksjon av apoptose av sanguinarin forekommer i en egr-1-avhengig måte og at en økning i ROS generering er nødvendig for aktivering av Egr-1 og forekomsten av sanguinarin-indusert apoptose i blærecancerceller.
cellene ble behandlet med sanguinarin i de angitte tidsrom (A) eller behandlet med eller uten NAC i 1 time før utfordring med sanguinarin i 2 timer (B). Deretter ble like mengder av proteiner (30 ug) separert på SDS-polyakrylamidgeler og overført til nitrocellulosemembraner. Membranene ble probet med anti-Egr-1-antistoff, og proteinene ble visualisert ved anvendelse av en ECL-påvisningssystem. (C-E) Cellene ble transfektert med siRNA mot human Egr-en ved hjelp av en transfeksjon reagens. Etter 24 timer med transfeksjon ble cellene behandlet med sanguinarin i ytterligere 2 timer (C) eller 24 timer (D og E). De ble deretter høstet, og de angitte proteiner ble påvist ved Western blot-analyse (C og D). Videre ble cellene evaluert ved en strømnings-cytometer for annexin-V (D). Resultatene er uttrykt som gjennomsnitt ± SD fra tre uavhengige eksperimenter. Den statistiske signifikans av resultatene ble analysert med en Student
t
-test (*
p
0,05 vs. ubehandlet kontroll;
#
p
0,01 vs. sanguinarin-behandlede celler).
Diskusjoner
for å studere mekanismer som sanguinarin behandling induserer apoptose i blæren kreftceller, denne studien undersøkte en rekke markører assosiert med apoptotisk celledød. Mekanismen av apoptose er delt i to veier: en ytre død-reseptor-mediert apoptotiske reaksjonsvei og en indre mitokondrier-mediert apoptotiske reaksjonsvei. Caspaseaktivering er generelt ansett som en viktig kjennetegn på apoptose i disse banene. Den ytre vei aktiveres på celleoverflaten når en spesifikk død ligand binder seg til den tilsvarende celleoverflatereseptoren. I denne reaksjonsveien, caspase-8 fungerer som en initiator caspase, som aktiverer nedstrøms effektor kaspasene, såsom caspase-3, -6 og -7. På den annen side, har den indre vei et apoptotisk signal som kommer fra inne i cellene, og det er avhengig av den permeabiliseringen av mitokondrielle membraner for å frigjøre apoptogenic mitokondrielle proteiner inn i cytosol, for derved å aktivere initiatoren caspase-9. Den aktiverte caspase-9 initierer nedstrøms hendelser ved direkte spaltning og aktivering av effektorceller kaspaser, genererer et fragment som aktiverer den mitokondrielle veien [37], [38]. Apoptose kan også reguleres ved flere genprodukter, slik som Bcl-2-familien av antiapoptotic og proapoptotiske proteiner, og IAP-familie proteiner, som er i stand til å binde og inhibere caspaser [39], [40]. I den mitokondrielle død veien, forholdet mellom ekspresjon av proapoptotiske proteiner som Bax og Bak og de antiapoptotic proteiner, slik som Bcl-2 og Bcl-xL slutt bestemmer celledød eller overlevelse. I tillegg, caspase-8 medierer den intrinsiske vei via spalting av proapoptotiske Bid protein, et BH3-bare protein, til en avkortet Bud (tBid) ved translokasjon fra cytosol til mitokondriene, utløser mitokondriell dysfunksjon, etterfulgt av aktivering av caspase- 9 [41]. Denne studien viste at uttrykket av proapoptotiske Bax viste en økning i sanguinarin-indusert apoptose, mens mengden antiapoptotic Bcl-2 og Bcl-xL holdt seg relativt uendret (fig. 3A). Dataene viste også at sanguinarin behandling indusert apoptose ved aktivering av to initiator kaspaser, caspase-8 og -9, som var involvert i den ytre og indre baner, henholdsvis, i tillegg til effektor caspase-3 (fig. 3B og C), som ble assosiert med samtidig spaltning av PARP, et aktivert caspase-3-target-substrat-protein (fig. 3B) [33]. I tillegg sanguinarin behandling reduserte ekspresjon av XIAP, et medlem av IAP-familien av proteiner (Fig. 3A), som har blitt rapportert å utøve antiapoptotic effekter fordi de fungerer som direkte inhibitorer av caspaser aktiverte [37], [39]. Videre eksponering av celler til sanguinarin førte til en betydelig reduksjon i hele Bud, noe som indikerer at proapoptotiske protein, Bud, ble avkuttet (fig. 3A). Foreliggende data indikerer at både ytre og indre baner kan ha bidratt, i det minste delvis, til den sanguinarin-indusert apoptose av humane blærecancerceller.
Monterings bevis tyder på at skadede mitokondrier stimulere ROS generasjon og den uforholdsmessig produksjon av ROS induserer apoptose via den indre reaksjonsvei ved å forårsake skade på mitokondriene gjennom aktivering av kaspaser [17] – [19]. Dataene viste at sanguinarin behandlingen resulterte i signifikant øket ROS generasjon tidlig i prosessen. Ko-kultur med NAC, en vanlig brukt ROS-passiveringsmidlet, effektivt blokkert ROS generasjon (fig. 4). I tillegg blokkerer genereringen av ROS fullstendig forhindret apoptose (Fig. 5A) og gjenvinnes den sanguinarin-indusert aktivering av kaspaser, nedbrytning av PARP, og nedregulering av XIAP og hele Bud ekspresjon (Fig. 5B og C). Disse resultatene indikerte at ROS generering av sanguinarin er nødvendig for induksjon av apoptose i blærecancerceller.
Nylige studier har indikert at forskjellige apoptotiske stimuli hurtig kan aktivere MAPK, som inkluderer JNK, ERK, og p38MAPK. Blant dem, JNK-reaksjonsveien, som en oppstrøms signalveien av caspase-3, kan spille en viktig rolle i å utløse apoptose i respons til frie radikaler generert av ultrafiolett stråling eller direkte anvendelse av H
2o
2 [42] [43]. Dermed studien undersøkt om denne signalveien var involvert i apoptotiske effekt av sanguinarin i blæren kreftceller. Dataene indikerte at JNK fosforylering skjer raskt, i løpet av 30 min av sanguinarin behandling, og vedvarer i minst 1-6 timer etter eksponering sanguinarin (Fig. 6A).
