Abstract
Dendritic celle (DC) vaksiner rettet mot bare kreftcellene har produsert begrenset antitumor aktivitet i de fleste kliniske studier. Målretting av kreft-assosiert fibroblaster (kafeer) i tillegg til kreftceller kan forsterke antitumor-effekter, ettersom kafeer, den sentrale del av tumoren stroma, direkte støtte for tumorvekst og bidra til den immunsuppressive tumor mikromiljøet. Å co-målet kafeer og kreftceller vi utviklet en ny sammensatt DC vaksine som koder for en A20-spesifikk shRNA å forbedre DC funksjon, og er rettet mot fibroblast aktivering protein (FAP) uttrykt i kafeer og svulsten antigen tyrosin-relatert protein (TRP) 2 (DC-shA20-FAP-TRP2). DC-shA20-FAP-TRP2 vaksinering indusert robust FAP- og TRP2-spesifikke T-celle responser, noe som resulterer i økt antitumoraktivitet i B16 melanom-modell i forhold til monovalente vaksiner eller en vaksine som koder for antigenene og en kontroll shRNA. DC-shA20-FAP-TRP2 vaksinering forbedret tumor infiltrasjon av CD8-positive T-celler, og induserte antigen-spredning som resulterer i potent antitumoraktivitet. Således, co-målretting mot tumorceller og kafeer resulterer i induksjon av bred-baserte tumorspesifikke T-celle-responser, og har potensiale til å forbedre nåværende vaksine tilnærminger for kreft
relasjon:. Gottschalk S, F Yu Ji M, Kakarla S, Song XT (2013) en vaksine som Co-Targets tumorceller og kreft tilknyttede fibroblaster Resultater i Enhanced Antitumor aktivitet ved å indusere Antigen Sprer. PLoS ONE 8 (12): e82658. doi: 10,1371 /journal.pone.0082658
Redaktør: Nikolas K. Haass, University of Queensland Diamantina Institute, Australia
mottatt: 31. mai 2013; Godkjent: 25 oktober 2013; Publisert: 12.12.2013
Copyright: © 2013 Gottschalk et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Støttet av DAMD W81XWH-10-1-0281, gir NIH P50 CA126752 og 1R01CA148748-01A1. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Dendritic celle (DC) vaksiner har vist begrenset antitumor aktivitet i de fleste kliniske studier [1]. Denne mangel på effekt er mest sannsynlig på grunn av tilstedeværelsen av immundempende celler i tumoren, så vel som tumorbærende stroma begrense kryss presentasjon og induksjon av bred-baserte tumor antigen-spesifikke T-celle-responser [2], [3].
kreft assosiert fibroblaster (kafeer) er de viktigste cellulære komponent i tumoren stroma og er til stede i de fleste vanlige epiteliale cancere slik som lunge, bryst og prostata cancer, så vel som sarcom og melanom [4] – [7]. CAF medierer resistens overfor kjemo-, radio- og immunterapi, og CAF tumor innhold eller gener som uttrykkes i kafeer korrelerer med utfallet [5], [8] – [10]. Kafeer uttrykke fibroblaster aktive protein (FAP) [11] og målrettet sletting av FAP-positive kafeer i transgene musemodeller har potente antitumor effekt som fremhever deres sentrale rolle i tumorigenesis [12]. I tillegg FAP-målrettede vaksiner redusert svulst kollagen innhold og modulert svulsten immunmikromiljøet i prekliniske modeller [13], [14].
Vi har tidligere vist at stanse A20, en negativ regulator av NF- κb- mediert DC aktivering, forbedrer DC funksjon [15]. Hensikten med denne studien var nå å vurdere en vaksine som stiller A20, og co-mål FAP-positive kafeer samt tumorceller. Våre resultater viser at en slik forbindelse-vaksine har potent antitumoraktivitet, og at co-målretting av kafeer og tumorceller er kritisk for induksjon av cytotoksiske T-celler som er spesifikke for tumorantigener ikke kodet av vaksinen.
Materialer og metoder
DC immunisering og tumormodeller
Denne studien ble godkjent av Institutional Animal Care og bruk komiteene~~POS=HEADCOMP Baylor College of Medicine (BCM). C57BL /6J ble kjøpt fra Jackson Laboratories og vedlikeholdes på en patogen-frie mus anlegget på BCM henhold til institusjonelle retningslinjer. DC ble vasket i PBS og injisert i bakre fotbladet av naive C57BL /6 på 1 × 10
6 celler /mus. Musene ble avlivet på dager indikert; inguinal lymfeknuter og milt ble fjernet for intracellulær farging og ELISPOT, henholdsvis. For svulsten modellen, ble C57BL /6 mus injisert med 5 × 10
5 B16, B16-OVA, eller EG7-OVA tumorceller subkutant. Fem dager senere ble mus tilfeldig delt inn i grupper (n = 5 per grupper) og injisert med 1 x 10
6 lentivirus-omsatte LPS-modnet DC. Tumor volum ble målt to eller tre ganger i uken med en verniercaliper.
Lentiviral vektor konstruksjon, produksjon og transduksjon
Hiv selv inaktivere (SIN) vektor brukt i denne studien var pSIH1- H1-shRNA vektor fra SBI. Mus A20 liten hårnål interfererende RNA-sekvens ble satt inn i pSIH1-H1-shRNA å generere pSIH1-H1-A20-shRNA som inneholder A20 shRNA (5′- CTACCTGAGTTCCTTCCCCTTCAAGAGAGGGGAAGGAACTCAGGTAGTTTTT-3 «). FAP eller TRP-2-cDNA ble innsatt i pSIH1-H1-shRNA under kontroll av CMV-promoteren for å generere pSIH1-H1-A20-shRNA-CMV-FAP, pSIH1-H1-A20-shRNA-CMV-TRP2, eller pSIH1-H1 -A20-shRNA-CMV-FAP-TRP2. Rekombinante pseudotyped lentiviral vektorer ble generert som tidligere beskrevet [15] og konsentrert ved PEG-it ™ virus nedbør løsning (System biovitenskap, Mountain View, California).
Dendritic kultur
Benmarg dendrittiske celler (DC) ble oppnådd som beskrevet [16] med de følgende modifikasjoner. Røde blodceller ble lysert ved inkubasjon ved romtemperatur i røde blodcellelyseringsbuffer (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) og celler ble holdt i HyClone RPMI 1640 supplert med 10% føtalt bovint serum (Summit, Fort Collins, CO) , ikke-essensielle aminosyrer, HEPES buffer, Glutamax, β-merkaptoetanol, IL-4 (20 ng /ml), og GM-CSF (20 ng /ml, Peprotech, Rocky Hill, NJ) i 5 dager. DC ble så transdusert med lentivirus i 8 timer, deretter dyrket i ytterligere 12-16 timer med LPS.
Strømningscytometri
Strømningscytometrisk analyse av DCS og T-celler, og ble utført som tidligere beskrevet [15], [17]. Inguinal lymfeknuter ble dissosiert og belagt i fullstendig RPMI med lentivirus-omformet DC for en overnatting stimulering ved 37 ° C, etterfulgt av intracellulær farging. Fargede celler ble analysert på en FACSCalibur instrument (Becton Dickinson (BD), Mountain View, CA) ved hjelp Cellquest programvare (BD) for all flow-cytometri analyser.
Enzyme-linked immunosorbent øye (ELISPOT) assay
ELISPOT-analyser av isolerte T-celler ble utført som beskrevet tidligere beskrevet [15], [17]. Miltene ble dissosiert og splenocytter ble renset ved hjelp av MACS CD4 (L3T4) eller CD8 (Ly-2) mikroperler (Miltenyi Biotec, Auburn, CA). Celler ble sådd ut i triplikat med OT-II eller OT-I peptid (10 pg /ml) eller anti-CD3 /CD28 for positiv kontroll. Platene ble inkubert over natten, deretter IFN-γ sekresjon ble bestemt (antistoffer: MABTECH). Resultatene ble evaluert i en blindet måte ved ZellNet Consulting, Inc. (New York, New York) med en automatisert ELISPOT leser system, ved hjelp av KS ELISPOT 4.3 software.
Cvtotoksisitetsmålinq
Cytolytiske aktivitet T-celler ble vurdert med en standard kromfrigjøringsanalyse, som måler evnen til in vitro-restimulert splenocyttene til å lysere målceller (20, 50). Splenocytter samlet fra immuniserte mus ble restimulert in vitro i RPMI-1640 som inneholdt B16-OVA tumor lysat og IL-2 i 4-6 dager. B16 og B16-OVA-celler ble merket med natrium
51Cr-kromat-løsning i 60 minutter ved 37 ° C med risting. Forskjellig antall effektorceller ble inkubert med en konstant antall målceller (5 x 10
4 /brønn) i 96-brønners U-bunn-plater (200 ul /brønn) i 4 timer ved 37 ° C. Supernatantene fra triplikate kulturer ble oppsamlet. Prosent lysering ble beregnet som (eksperimentell frigjøring – spontan frigjøring) /(maksimum frigjøring – spontan frigjøring). × 100
Statistisk analyse
For statistisk analyse, brukte vi t-test med en 95 % tillitsgrense, definert som p 0,05. Resultatene er vanligvis presentert som betyr ± SEM. For dyreeksperimenter, ble 5 mus planlagt for å detektere en stor effekt størrelse på 2, som forutsatt at minst 80% effekt med 5% Type-I-feil. For muse eksperimenter, overlevelse, fastsatt fra tidspunktet for tumorcelle injeksjon, ble analysert ved log-rank test.
Resultater
Funksjonell karakterisering av lentiviral vektorer som koder shA20, FAP og TRP2
Vi bygget 4 lentiviral vektorer som koder shA20 og FAP (Lv-shA20-FAP), shA20 og TRP2 (Lv-shA20-TRP2), shA20, FAP og TRP2 (Lv-shA20-FAP-TRP2), eller en kontroll shRNA, FAP, TRP2 (Lv-shCo-FAP-TRP2) (fig. 1a). Transgene uttrykk, og å stanse all A20 ble bekreftet ved RT-PCR i benmarg avledet DC transdusert med VSV-G pseudotyped lentivirale vektorer (fig. 1B, C).
(A) reaksjonsskjema av lentivirale konstruksjoner. (B og C) Mus BM-DC ble transdusert med lentivirus og FAP og TRP2 uttrykket (B) og A20 uttrykket (C) ble påvist ved RT-PCR eller PCR-Q individuelt. (D og E) Mus ble immunisert med 1 x 10
6 lentivirus-transduserte BM-DC i 25 ul steril PBS eller PBS kontroll via fotputen 14 dager etter vaksinasjon splenocytter ble fremstilt og CD8 + (D) og CD4 + (E) T celler valgt. Hyppigheten av FAP- og TRP2-spesifikke T-celler ble bestemt ved hjelp av IFN-y ELISPOT-analyser (n = 2; analysen ble utført i tre paralleller). AF, lentiviral vektor coexpressing en A20-spesifikke kort hårnål RNA (shRNA) og FAP; AT, lentiviral vektor coexpressing A20-shRNA og TRP2; AFT, lentiviral vektor coexpressing A20-shRNA, FAP, og TRP2; CFT, lentiviral vektor coexpressing GFP-shRNA, FAP, og TRP2; GAPDH, glyseraldehyd 3-fosfat dehydrogenase; PBS, fosfat-bufret saltvann.
For å vise at Lv-transduserte DC indusere FAP- og TRP2-spesifikke T-celle responser ble mus vaksinert med 1 × 10
6 DC-shA20- FAP, DC-shA20-TRP2, DC-shA20-FAP-TRP2, eller DC-shCo-FAP-TRP2. Fjorten dager etter vaksinasjon CD4- og CD8-positive miltceller ble isolert, og tilstedeværelsen av FAP- og TRP2-spesifikke T-celler ble bestemt ved IFN-y ELISPOT analyser. Mus vaksinert med A20-forstummet DC vaksiner forårsaket betydelig høyere FAP- og TRP2-spesifikke CD4 og CD8-positive T-celle responser (p 0,05) enn mus vaksinert med DC-shCo-FAP-TRP2, bekrefter våre tidligere funn at silencing av A20 i DC fremmer induksjon av robuste CD4- og CD8-positive antigen-spesifikke T-celle-responser
in vivo plakater (fig. 1D, E) [15]. Det var ingen signifikant forskjell (p 0,05) i induksjon av FAP- eller TRP2-spesifikke T-celler reaksjoner etter vaksinering av mus med DCs uttrykker individuelle (DC-shA20-FAP eller DC-shA20-TRP2) eller begge antigener (DC-shA20 -FAP-TRP2), noe som indikerer fravær av antigen konkurranse når begge antigener er co-uttrykt.
DC-shA20-FAP-TRP2 vaksine har potent antitumor aktivitet
B16 melanoma modell gjør det enkelt å vurdere om målretting FAP-positiv tumor stroma forsterker antitumor effekter siden B16 celler uttrykker ikke FAP [18]. Vi bekreftet induksjon av FAP uttrykk innen 5 dager etter tumorimplantasjon B16 ved hjelp av RT-PCR (fig. 2A). Mus med 5 dager gamle B16 svulster ble vaksinert med en enkelt dose av en × 10
6 DC-shA20-FAP, DC-shA20-TRP2, DC-shA20-FAP-TRP2, eller DC-shCo-FAP- TRP2 vaksine. Alle A20-forstummet vaksiner hadde antitumor aktivitet, mens ikke-A20 forstummet DC vaksine hadde ingen (Fig. 2B). Det var ingen forskjell i antitumoraktivitet av DC-shA20-FAP og DC-shA20-TRP2 vaksiner, noe som indikerer at T-celle respons mot et antigen alene stroma kan ha betydelig antitumor virkning (fig. 2B). Målrette FAP og TRP2 samtidig med DC-shA20-FAP-TRP2 vaksine resulterte i den største antitumor aktivitet (DC-shA20-TRP2 vs DC-shA20-FAP-TRP2, p 0,05; DC-shA20-FAP vs DC-shA20- FAP-TRP2, p 0,05). Dette resulterte i en betydelig økning i overlevelse av mus som mottok DC-shA20-FAP-TRP2 vaksine i forhold til de andre vaksinegrupper (Fig.2C). Overlegen antitumor aktivitet av et tumor- og stroma-målrettet vaksinen ble bekreftet ved hjelp av en DC-shA20-FAP-OVA vaksinen i B16-OVA og EG7-OVA-modeller (fig. S1 A, B).
(A) RT-PCR for FAP og GAPDH av B16 cellelinje, og dag 5 B16 tumorer. (B, C) Mus ble inokulert med B16 etterfulgt av immunisering med 1 × 10
6 DC-shA20-FAP (AF), DC-shA20-TRP2 (AT), DC-shA20-FAP-TRP2 (AFT), DC-shCo-FAP-TRP2 (ACT) eller PBS på dag 5 (n = 5 per gruppe). (B) Cotargeting FAP og TRP2 med AFT resulterte i den største antitumorrespons (AF vs AFT, p 0,05; AT vs AFT, p 0,05). (C) Kaplan-Meier overlevelseskurve (AF vs AFT, p 0,05; AT vs AFT, p 0,05).
DC-shA20-FAP-TRP2 vaksine øker FAP- og TRP2-spesifikke CD8-positive T-celler i svulster
for å undersøke mekanismene bak forbedringen av antitumoreffekter, må vi først bestemt frekvens av CD4 og CD8-positive T-celler i B16 svulster 3 uker etter vaksinasjon. Mens det ikke var noen signifikant forskjell i prosentandelen av CD4-positive T-celler i tumorer mellom grupper av vaksinerte mus (data ikke vist), var det et signifikant (p 0,05) 4-ganger økning i prosentandelen av CD8-positive T-celler etter DC-shA20-FAP-TRP2 vaksinering sammenlignet med kontrollmus (fig. 3A, B). I motsetning til dette ble de monovalente vaksiner eller den ikke-dempet FAP /TRP2 DC vaksine ikke øke hyppigheten av intratumorale CD8-positive T-celler i forhold til kontrollene. For å undersøke spesifisiteten av infiltrere CD8-positive T-celler, ble tumor-infiltrerende lymfocytter (Tīlss) isolert 3 uker etter vaksinasjon. Intracellulær cytokin farging for IFN-γ ble utført etter stimulering med FAP- eller TRP2-uttrykke DC. DC-shA20-FAP-TRP2 vaksinering induserte den høyeste frekvensen av FAP- og TRP2-spesifikke T-celler i forhold til de andre vaksiner (fig. 3C), speiling den tidligere observert generell økning i antall CD8-positive T-celler i tumorer .
Mus ble inokulert med B16 svulster etterfulgt av immunisering med 1 × 10
6 DC-shA20-FAP (AF), DC-shA20-TRP2 (AT), DC-shA20-FAP-TRP2 ( AFT) eller PBS på dag 5. Tumor vev ble dissekert 3 uker etter vaksinering (n = 5). (A) Representative FACS-analyse av infiltrerende CD8 + T-celler. (B) Oppsummering av data for alle mus som viser en signifikant økning (p 0,05) av CD8 + T-celler i mus vaksinert med AFT (n = 8 per gruppe). (C) Tīlss ble restimulert med DC transdusert med FAP (DC-Lv-FAP) eller TRP2 (DC-LV-TRP2) etterfulgt av intracellulær farging av IFN-γ. En av 2 representative eksperimenter i vist.
DC-shA20-FAP-TRP2 vaksine induserer antigen sprer
I forrige forsøket vi merke til at DC-shA20-FAP vaksine indusert TRP2 -spesifikke T-celle-responser (fig. 3C), som tyder på epitop spredning og induksjon av antigen spredning. For ytterligere å undersøke dette funnet, ble B16 tumor-bærende mus vaksinert på dag 5 med DC-shA20-FAP, DC-shA20-TRP2, DC-shA20-FAP-TRP2, eller PBS. Etter 3 uker frekvens av T-celler som er spesifikke for B16-assosierte tumor-antigener tyrosinase-relatert protein 1 (TRP1), tyrosinase (Tyr), gp100, og melanom-assosiert antigen som gjenkjennes av T-celler (MART1) blant splenocytter og tumor-infiltrerende lymfocytter ble bestemt. Mens alle vaksiner induserte en signifikant økning av TRP1-, Tyr-, gp100-, og MART1-spesifikke T-celler i Tīlss i forhold til PBS-injiserte mus (fig. 4A), frekvensen av melanom-spesifikke T-celler var høyest i DC -shA20-FAP-TRP2 vaksinerte mus (p 0,05). Bare DC-shA20-FAP-TRP2 vaksine indusert systemiske T-celle responser mot TRP1, Tyr, gp100, og MART1 (Fig.4B). Disse resultater indikerer at målsøking av tumor stroma, så vel som tumor muliggjør induksjon av antigen spredning.
Mus ble inokulert med B16 tumorer etterfulgt av immunisering med 1 x 10
6 DC-shA20-FAP ( AF), DC-shA20-TRP2 (AT), DC-shA20-FAP-TRP2 (AFT) eller PBS på dag 5. Tīlss og Splenocytter ble utarbeidet 3 uker etter vaksinasjon (n = 5). (A) Tīlss ble restimulert med DC-Lv-TRP2, DC-Lv-TRP1, DC-Lv-TYR, DC-Lv-gp100, DC-Lv-MART1 eller håne transduced DC (PBS) etterfulgt av intracellulær farging av IFN γ. FACS-analyse og en kumulativ søylediagram er vist. Tīlss isolert fra AFT vaksinert mus hadde den høyeste frekvensen av B16-speciifc T-celler (p 0,05). (B) Splenocytter ble utsatt for IFN-y ELISPOT analyser. DC-Lv-TRP2, DC-Lv-TRP1, DC-Lv-TYR, DC-Lv-gp100, DC-Lv-MART1 eller håne transduced DC (PBS) ble brukt som APC. Det var en betydelig økning (p 0,05). T-celler spesifikke for TRP1, TYR, gp100, og MART1 bare i AFT vaksinerte mus
Antigen spre resultater i forbedret antitumor aktivitet
Etter å ha vist at de utviklede sammensatte vaksinene indusert B16-antigenet sprer vi ønsket å bestemme om disse antigen-spesifikke T-celler har anti-tumoraktivitet. Mus ble inokulert med B16-OVA og B16 på deres høyre eller venstre flankene, og etter 5 dager vaksinert med DC-shA20-FAP, DC-shA20-OVA, DC-shA20-FAP-OVA eller PBS. DC-shA20-OVA vaksinering bare hemmet veksten av B16-OVA, mens DC-shA20-FAP vaksine hemmet B16 samt B16-OVA tumorvekst (Fig. 5A, B). Den DC-shA20-FAP-OVA vaksine hadde den største antitumoraktivitet mot begge tumorcellelinjer (p 0,05, Fig. 5A, B). Dette er i tråd med vår observasjon at co-målretting svulst antigen og FAP induserer systemiske T-celler responser mot tumor antigen ikke er tilstede i vaksinen (Fig.4B). Mens DC-shA20-OVA vaksinasjon ikke resulterte i en økning i total overlevelse, på grunn av antigen negative B16 svulster, DC-shA20-FAP eller DC-shA20-FAP-OVA vaksinering resulterte i en betydelig økning i total overlevelse sammenlignet med DC-shA20-OVA (p 0,05; fig 5.C).
(AC) Mus ble inokulert med B16-OVA eller B16 svulst på høyre eller venstre flanke separat etterfulgt av immunisering med 1 × 10
6 DC-shA20-FAP (AF), DC-shA20-OVA (AO), DC-shA20-FAP-OVA (AFO) eller PBS 5 dager senere (n = 5 per gruppe). B16-OVA (A) og B16 (B) tumorveksten ble målt. Den AFO og AF vaksinen hadde anti-B16 aktivitet med AFO være overlegen (p 0,05). (C) Kaplan-Meier overlevelseskurve (AO vs AF, p 0,05; AO vs AFO, p 0,05). (D, E) Mus ble inokulert med B16-OVA etterfulgt av immunisering med 1 × 10
6 AF, AO, AFO og PBS 5 dager senere. 3 uker senere, splenocytter ble fremstilt og dyrket in vitro i nærvær av B16-OVA tumor lysat og IL-2 i 5 dager, og deres cytolytisk aktivitet ble evaluert i standard kastet
51Cr frigivelse analyse mot B16-OVA (D) eller B16 ( E). Splenocytter isolert fra AF og AFO vaksinert mus hadde betydelig cytolytisk aktivitet B16. * AFO vs AF og AO, p 0,05; ** AF og AO vs PBS, p 0,05; *** AFO og AF vs AO, p. 0,05)
For ytterligere å bekrefte den systemiske induksjon av T-celler spesifikke for antigener ikke foreligger i vaksinen, mus ble injisert med B16-OVA og vaksinert etter 5 dager med DC-shA20-FAP, DC-shA20-OVA, DC-shA20-FAP-OVA eller PBS. Etter 3 uker splenocytes av vaksinerte mus ble isolert og restimulert i 5 dager
ex vivo
før du utfører en cytotoksisitet analysen med B16-OVA og B16 celler som mål. Splenocytter høstet fra DC-shA20-FAP eller DC-shA20-FAP-OVA vaksinert mus viste betydelig drap på B16-OVA og B16-celler (fig. 5D, E), der han som den DC-shA20-OVA vaksine først og fremst forårsaket OVA-spesifikke T-celle responser.
Diskusjoner
Våre resultater viser at en DC vaksine der antigenpresenterende demperen A20 hemmes, og som er rettet mot FAP-positive kafeer og svulsten antigen TRP2 har potent antitumor effekter, gjør at cross-presentasjon av tumorantigener av intratumorale APC resulterer i bred induksjon av T-celler spesifikke for tumorantigener som ikke inngår i vaksinen.
svulstens mikromiljø er et komplekst miljø og spiller en viktig rolle i startfasen, progresjon og formidling terapeutisk motstand [9], [10]. Målretting av ikke-maligne celler til stede i tumorer i tillegg til kreftceller kan derfor øke effektiviteten av kreft-målrettede terapier [7], [19], [20]. FAP-positive kafeer, den sentrale cellulære komponenten av svulsten stroma, har dukket opp som sentrale aktører i å fremme ekstracellulære matriks (ECM) ombygging, vaskularisering og immunsuppresjon [21]. For eksempel, i transgene mus, i hvilken difteri-toksin-reseptoren blir uttrykt under kontroll av FAP-promoteren, kan administrering av difteri-toksin, som kun dreper tumorassosierte FAP-positive stromale celler, resulterte i fullstendig ablasjon av faste tumorer [12] .
FAP er et membranbundet aminopeptidase, som er involvert i ECM-remodellering [22]. Hemming av aminopeptidase aktiviteten av FAP resulterte i redusert tumorvekst og er forbundet med en akkumulering av kollagen, redusert antall myofibroblasts, og redusert tumor vaskularisering i prekliniske modeller [21], men ingen objektive kliniske responser ble observert i kliniske studier [23] . Målrette FAP med et humanisert monoklonalt antistoff, sibrotuzumab, viste også ingen objektive kliniske respons; Men imaging studier viste at antistoffet fortrinnsvis lokalisert til metastatiske tumor nettsider etter administrasjon [24].
Flere grupper har gjennomført vaksinestudier utelukkende rettet mot FAP, viser at S. typhimuirum-, plasmidfritt, eller DC-baserte FAP-vaksiner har antitumoraktivitet i preventive eller terapeutiske tidlig innstillinger, modulere tumormikromiljøet ved å fremme Th1 polarisering og styrke infiltrasjon av CD8-positive T-celler [13], [14], [18], [25]. Mens cotargeting av FAP-positive kafeer og tumorceller med DC vaksine viste en betydelig forsinkelse i tumorvekst i en preklinisk studie ble ingen mekanistiske studier utført [18].
Våre studier nå utvide disse funnene og viser at stanse den ubiquitin ligase A20, en antigenpresenterende attenuator i DC, resulterer i en betydelig økning i hyppigheten av FAP-spesifikke T-celler i forhold til en DC-vaksine med en kontroll shRNA. Dette understreker den viktige rollen stanse negative regulatorer som A20 i APC å indusere T-celle responser mot selvantigener som FAP [15]. Vi observerte ingen forskjell i antitumor aktivitet av DC-shA20-FAP og DC-shA20-TRP2, noe som indikerer at målretting kafeer ved FAP vaksinering kan indusere antitumor effekter som ligner på vaksiner som er rettet mot ondartede celler. Imidlertid vaksinering med DC-shA20-FAP-TRP2 resulterte i den største antitumoraktivitet. Mekanistisk studerte viste at cotargeting av kafeer og tumorceller resulterte i en økt prosentandel av CD8-positive T-celler i tumorer og induksjon av T-celler som er spesifikke for antigener som ikke er tilstede i vaksinen med potent antitumoraktivitet. DC-shA20-FAP, DC-shA20-TRP2, og DC-shCo-FAP-TRP2 vaksineinduserte sammenlignbare nivåer av CD8-positice Tīlss (Fig. 3B), men bare DC-shA20-FAP og DC-shA20-TRP2 vaksiner hadde antitumoraktivitet (fig. 2B). Vi hadde tidligere vist at A20-siRNA-adjuvans DC vaksiner indusere potent tumor antigen-spesifikke cytotoksiske T-celler og T-hjelpeceller som er motstandsdyktige overfor Treg hemming [15]. Således, mens alle tre vaksiner indusert sammenlign TIL responser, DC-shA20-FAP og DC-shA20-TRP2-indusert Tīlss er mest sannsynlig mer effektive i å hemme tumorvekst.
Vaksine studier ved brystkreft, nyrekreft, og melanom pasienter tyder på at grense presentasjon og epitop sprer korrelater med forbedret total overlevelse [26] – [28]. I tillegg, induksjon av bred-baserte tumorspesifikke T-celle-responser etter adoptiv overføring av T-celler i en pasient melanom resulterte i en fullstendig reaksjon [29]. Selv om disse studiene markere betydningen av epitop spredning, er de faktorer som bestemmer effektivt indusere kryss presentasjon og epitop sprer for tiden syk definert. Mens alle vaksiner indusert lave nivåer av Tīlss som var spesifikke for antigener som ikke er tilstede i vaksinen, er det bare tumor- og stroma-målrettede vaksine-indusert systemisk T-celle-responser på alle testede ikke-vaksine antigener. Målretting bare tumoren stroma med DC-shA20-FAP resulterte i induksjon av TRP2-spesifikke Tīlss og systemiske TRP2-spesifikke T-celle-responser som var høyere (men ikke vesentlig) i forhold til DC-sh-TRP2 vaksine. Disse resultater antyder at målretting FAP-positive stromaceller resulterer i ødeleggelse av B16 celler og reversering av den immunsuppressive svulsten mikromiljøet.
Viktigere er de induserte tumor-spesifikke T-celler var cytotoksisk og hadde antitumoraktivitet mot antigen-tap varianter (ALVs), som allerede har blitt observert hos pasienter som er registrert på vaksine eller T-celle immunterapi studier som kun er rettet mot tumorantigener [30], [31]. Mens andre grupper har vist i prekliniske modeller som krysser presentasjon av antigener på stromale celler er kritisk for eliminering av ALVs ved hjelp av et sterkt uttrykt modell antigen [32], våre resultater indikerer at målretting stromale celler er nødvendig for å indusere en bred anti-tumor responser, som skal minimere risikoen for ALVs.
i sammendraget, det sammensatte vaksinen vi har utviklet induserer CAF- og tumor-spesifikke immunresponser og utløser bred-baserte T-celle responser mot tumorantigener. Dermed rettet mot kafeer i tillegg til ondartede kreftceller har potensial til å forbedre dagens vaksine tilnærminger for kreft.
Hjelpemiddel Informasjon
Figur S1.
DC-shA20-FAP-OVA vaksine har potent antitumor aktivitet
doi:. 10,1371 /journal.pone.0082658.s001 product: (PDF)
Takk
takker Cliona M Rooney og Malcolm K Brenner for nyttige diskusjoner og råd.
