Abstract
To viktige hendelser, nemlig adhesjon og invasjon, er sentralt i forekomst av metastaser. Viktigere, har 37 kDa /67 kDa laminin reseptoren (LRP /LR) vært innblandet i å forbedre disse to hendelsene og dermed tilrettelegge for kreft progresjon. I denne studien, rollen LRP /LR i adhesjon og invasjon av leverkreft (HUH-7) og leukemi (K562) celler ble undersøkt. Strømningscytometri viste at HÆ-7 celler viste signifikant høyere celleoverflate LRP /LR nivåer sammenlignet med dårlig-invasiv brystkreft (MCF-7) kontrollceller, mens K562-cellene viste signifikant lavere celleoverflate LRP /LR-nivåer i forhold til de MCF-7 kontrollceller. Men Western blotting og densitometrisk analyse viste at alle tre tumorigene cellelinjer ikke signifikant forskjellig med hensyn til totale LRP /LR nivåer. Videre behandling av leverkreftceller med anti-LRP /LR spesifikke antistoff IgG1-iS18 (0,2 mg /ml) reduserte signifikant klebe potensialet av celler til laminin-1 og invasive potensialet av celler gjennom ECM-lignende Matrigel, mens leukemi celler viste ingen signifikante forskjeller i begge tilfeller. I tillegg Pearsons korrelasjonskoeffisienter foreslo direkte proporsjonalitet mellom celleoverflate LRP /LR nivåer og limet og invasiv potensial for leverkreft og leukemi celler. Disse funnene tyder på mulig bruk av anti-LRP /LR spesifikt antistoff IgG1-iS18 som et alternativ terapeutisk verktøy for metastatisk lever kreft gjennom hinder av LRP /LR- laminin-en interaksjon
Citation. Chetty C, Khumalo T, Da Costa Dias B, Reusch U, Knackmuss S, Little M, et al. (2014) Anti-LRP /LR spesifikke antistoffer IgG1-iS18 hindrer adhesjon og invasjon av leverkreftceller. PLoS ONE 9 (5): e96268. doi: 10,1371 /journal.pone.0096268
Redaktør: Corinne Ida Lasmezas, The Scripps Research Institute Scripps Florida, USA
mottatt: 25 november 2013; Godkjent: 04.04.2014; Publisert: 05.05.2014
Copyright: © 2014 Chetty et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av National Research Foundation, Sør-Afrika og Medical Research Council, republikken Sør-Afrika. Eventuelle meninger, funn og konklusjoner eller anbefalinger uttrykt i dette materialet er de av forfatteren (e), og derfor ikke National Research Foundation ikke noe ansvar i denne forbindelse til dette. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:. S.F.T.W. er i dag en PLoS ONE Editorial Board Member. U.R., S.K. og M.L. er tilknyttet med eller anvendes ved Affimed Therapeutics A.G., et kommersielt selskap som produserer terapeutiske antistoffer for behandling av cancer og inflammatoriske sykdommer. Videre er anti-LRP /LR antistoffene som anvendes i denne studien for blokaden av invasjon og adhesjon er beskrevet i de to internasjonale patentskrifter som potensielle terapeutiske anticancer verktøy. Nemlig patent, EP0984987, med tittelen «A oppløselig laminin reseptor forløper og fremgangsmåter for å hemme dets interaksjon» har ende krav rettet mot en farmasøytisk sammensetning som omfatter en oppløselig reseptor laminin forløper eller funksjonelt derivat eller fragment derav og er eid av University of the Witwatersrand. Dette patentet er godkjent i Storbritannia og Tyskland. Den andre patent, EP1670826, er co-eid av University of the Witwatersrand og Affimed Therapeutics AG og har tittelen «enkelt kjede antistoff som virker mot 37 kDa /67 kDa laminin reseptoren som verktøy for diagnostisering og behandling av prionsykdommer og kreft, produksjon og anvendelse derav «. Dette innvilget europeiske patentet ble validert i Storbritannia, Frankrike, Tyskland, Sveits og Østerrike. Kravene er rettet til en enkelt kjede antistoff-molekyl er spesielt rettet mot LRP /LR for behandling av prionsykdommer eller kreft. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
Kreft er en global byrde som har vist seg å være den ledende dødsårsaken i økonomisk utviklede land og andre ledende dødsårsaken i økonomisk utviklingsland [1]. Ifølge World Cancer Research Fund (WCRF), ble anslagsvis 14,1 millioner tilfeller av kreft diagnostisert i år 2012, og det er spådd at cirka 24 millioner nye tilfeller av kreft vil bli diagnostisert innen år 2035, globalt (http: //www.wcrf.org/cancer_statistics/). Foreløpig har lungekreft blitt identifisert som den vanligste diagnosen kreft type, med de to krefttypene som er sentrale i denne studien nemlig leverkreft og leukemi, blir rangert som sjette og ellevte mest diagnostisert kreft typer, henholdsvis (GLOBOCAN). Det har blitt rapportert at ca 782 000 tilfeller av leverkreft og 352000 tilfeller av leukemi ble diagnostisert i år 2012 (https://www.wcrf.org/cancerstatistics/world kreft statistics.php), og dermed indikerer stort behov for å utvikle effektive behandling mot kreft.
celler er i stor grad avhengig av den ekstracellulære matriks (ECM), som er den ikke-cellulær komponent i alle vev og organer som gir en fysisk stillas til cellekomponentene og også hjelper til med initiering av vesentlig biokjemisk prosesser som trengs for riktig vev differensiering, homeostase og morphogenesis [2]. Celler holder seg til ECM via virkningen av ECM reseptorer [2]. Spesielt, den ikke-integrin 37-kDa /67-kDa laminin-reseptor (LRP /LR) er en viktig komponent av den ekstracellulære matriks, bistå i en rekke fysiologiske prosesser [3], [4], [5]. Det er foreslått at 37-kDa LRP er forløperen til det 67-kDa høy affinitet laminin-reseptoren LR, men den nøyaktige mekanisme ved hvilken forløperen danner reseptoren er ukjent [6].
LRP /LR er hovedsakelig en transmembran reseptor, men det er også tydelig i kjernen og cytosol [7], [8]. I kjernen, spiller LRP /LR en avgjørende rolle i opprettholdelsen av atomstrukturer mens i cytosol, hjelper det i translasjonsforskning prosesser [8]. Som et transmembran reseptor, tjener LRP /LR flere funksjoner slik som cellevandring [9], celle-matrise-adhesjon [10], celle-levedyktighet og proliferasjon [3], [4], [5].
LRP /LR er blitt vist å ha en høy bindingsaffinitet for laminin-1. Laminin-1 er en del av en familie av laminins, som er ekstracellulære matriseproteiner som utgjør flere ikke-kollagenholdige glykoproteiner som finnes i basalmembranen [11], [12]. Dette glykoprotein er antatt å spille kritiske roller i celleadhesjon [11], montering av basalmembran [11], cellevekst og differensiering [13], cellevandring [11], [14], neurittutvekst [11], [15 ] og angiogenese [16]. Laminin-1 har også vist seg å fremme invasive fenotype av tumorigene celler [17].
LRP /LR er blitt funnet å være overuttrykt på overflaten av flere tumorigene celler [18]. Resultatet av denne overekspresjon er en øket interaksjon mellom LRP /LR og laminin-1, og denne interaksjonen har vist seg å være viktig i å forbedre adhesjon og invasjon – to viktige komponenter av metastasering [19]. I hovedsak laminin-1 i basalmembranen samvirker med LRP /LR på overflaten av tumorigene celler som fører til adhesjon [19]. Dette, i sin tur, resulterer i sekresjon av proteolytiske enzymer så som type IV kollagenase for å hydrolysere type-IV-kollagen i basalmembranen, for derved å tillate tumorigene celler til å invadere og til slutt translocate til en sekundærside [19].
Siden LRP /LR-laminin-1-interaksjonen har blitt identifisert som viktige arrangementet i adhesjon og invasjon, blokkering av denne interaksjon kan bli ansett som en viktig mekanisme for å behandle metastatisk kreft. Dette impliserer LRP /LR som et mål for behandling av metastatisk kreft. Videre har flere studier vist at anvendelse av anti-LRP /LR spesifikke antistoffer reduserer klebemidlet og invasive potensialet av visse tumorigene celler, slik som HT1080 fibrosarkom [18], lunge betydelig [4], cervical [4], tykktarm [4] , prostata [4], bryst [20] og [20] i øsofagus kreftceller. Spesielt, har anti-LRP /LR spesifikke antistoff IgG1-iS18 blitt foreslått for å avbryte LRP /LR-laminin-1 interaksjon [4], således IgG1-iS18 kan anses som en mulig terapeutisk verktøy ved behandling av metastatisk kreft.
i denne studien ble evnen til anti-LRP /LR-spesifikke antistoff IgG1-iS18 for å hindre klebemidlet og invasive potensialet av leukemi og leverkreftceller ble undersøkt. På grunn av den høye forekomsten og dødeligheten av disse to krefttyper, alternative behandlingsalternativene blitt en nødvendighet. Det er bemerkelsesverdig at lignende studier har blitt utført, men det er mulig at ikke alle metastatisk kreft celletyper kan være lydhør overfor IgG1-iS18 behandlinger. Det blir derfor nødvendig å utføre disse metastatiske undersøkelser av forskjellige krefttyper, for å få innsikt i anvendelsen av antistoffet som et alternativ bredt spektrum terapeutiske antistoff for behandling av forskjellige krefttyper. Således ble denne undersøkelse utført med sikte på å bestemme hvorvidt IgG1-iS18 er i stand til i betydelig grad å redusere klebemidlet og invasive potensialet av leukemi og leverkreftceller, derfor gir mulighet for antistoffet som skal brukes som et alternativ terapeutisk verktøy ved behandling av disse to krefttypene.
Materialer og metoder
Cell kultur og forholdene
Menneske bryst adenokarsinom (MCF-7), leverkreft (HUH7) og leukemi (K562) cellelinjer erholdt fra ATCC ble kultivert i Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM) med høy glukose (4,5 g /l) supplert med 10% føtalt kalveserum og 1% penicillin /streptomycin ved 5% CO
2 og 37 ° C.
Reagenser og antistoffer
Matrigel brukes for celle invasjon analyser er avledet fra Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) mus sarkom og ble innhentet fra BD Biosciences.
Laminin-1used for celle-adhesjons-analyser ble erholdt fra Sigma-Aldrich.
kloramfenikol acetyl transferase (CAT) antistoff ble erholdt fra Sigma-Aldrich.
IgG1-iS18 ble rekombinant fremstilt i et pattedyr ekspresjonssystem som rapportert av
Zuber et al., (2008)
konfokalmikroskopi
for å visualisere plasseringen av LRP /LR på celleoverflaten, ble konfokalmikroskopi ansatt. Celler ble først sådd på Dekkglass og tillatt å nå 70% konfluens. Celler ble fiksert i 4% paraformaldehyd i PBS i ca. 15 minutter, fulgt av flere vaskinger med PBS. Cellene ble blokkert i 0,5% BSA i PBS i 5-10 minutter. Etter en PBS vask, ble overflødig PBS utslettet av. Dekkglass inneholdende cellene ble plassert på et objektglass (med celler vendt oppover), og dette ble etterfulgt av tilsetning av primært antistoff IgG1-iS18 (1:100) fortynnet i 0,5% BSA. Post en overnatting inkubasjon ved 4 ° C, ble dekk skylles tre ganger i PBS /BSA. Etter tilsetning av FITC-koplet sekundære antistoff som var blitt fortynnet i 0,5% BSA, ble inkubering i mørket tillatt i 1 time. Etterfulgt av tre vaskinger som tidligere, ble DAPI fortynnet i PBS og deretter administreres i 5-10 minutter for å tillate for farging av cellekjernen. Cellene ble til slutt vasket en gang i PBS alene og montert på en ren glide ved hjelp GelMount (Sigma-Aldrich). En periode på 45 minutter ble avsatt for å tillate innstilling kan finne sted.
Strømningscytometri
Kvantifisering av celleoverflate nivåer av LRP /LR ble utført ved hjelp av flow cytometri. EDTA (5 mM) i PBS ble anvendt for å lette løsgjøring av adherente celler, som ble etterfulgt av sentrifugering ved 1200 rpm, 10 min. Celler ble deretter fiksert ved å re-suspendeceller i PFA i 10 minutter ved 4 ° C. Celler ble på nytt sentrifugert i 1 x PBS som er tillatt for fremstilling av fem cellesuspensjoner, en hvor det ikke antistoff ble tilsatt (og dermed tjene som de ufargede kontroll), en til som anti-CAT-antistoff ble tilsatt (som tjener som en isotype-kontroll) og en som anti-LRP /LR spesifikt antistoff IgG1-iS18 ble lagt. De resterende to cellesuspensjoner ble inkubert bare i PBS for å bli brukt som negative kontroller for den lgG1-iS18 og anti-CAT-antistoff. Alle Suspensjonene ble inkubert ved romtemperatur i 1 time. Etter tre vasketrinn med 1 x PBS, geite-anti-humant fykoerytrin (PE) -koblet sekundært antistoff (Beckman Coulter) ble tilsatt til cellesuspensjonen inneholdende det IgG1-iS18 primære antistoff, så vel som en av suspensjonene som ble inkubert i PBS bare . Cellesuspensjonen ble inkubert med anti-CAT-antistoff, så vel som den gjenværende cellesuspensjonen ble inkubert bare i PBS, ble begge supplert med et geit-anti-kanin allofykocyanin (APC) -koblet sekundært antistoff, etterfulgt av ytterligere 1 times inkuberingsperiode av alle cellesuspensjoner. Videre ble tre post-ruge vasker utføres og cellesuspensjoner ble analysert ved bruk av BD Accuri C6 strømningscytometer. Forsøk ble utført in triplo og gjentas minst tre ganger.
SDS-PAGE og Western blotting
Sum LRP /LR-nivåer ble bestemt ved hjelp av natriumdodecylsulfat polyakrylamidgel-elektroforese (SDS-PAGE ). For å utføre SDS-PAGE, ble 10 ug av totalt protein anvendes. Proteinene som ble separert i henhold til størrelse ved hjelp av SDS-PAGE ble så identifisert ved anvendelse av spesifikke antistoffer i ferd med Western blotting. Proteinene oppløst på polyakrylamidgelen ble overført til en polyvinyliden fluorid (PVDF) membran ved hjelp 1X overføringsbuffer (20% metanol i 192 mM glycin og 25 mM Tris) i 45 minutter ved 350 mV og et semi-tørr overføring apparat. Blokkeringsbuffer (3% BSA i 1 x PBS Tween) ble deretter anvendt for å blokkere utslettet membranen i 1 time. Når blokkert, ble membranen probet med anti-LRP /LR spesifikt primært antistoff IgG1-iS18 (1:10000) i 1 time. Før inkubering av membranen med geit-anti-human-peroksidase (1:5000) sekundært antistoff, ble tre vaskinger med 1 x PBS Tween utført. En ytterligere tre vaskinger i 1X PBS Tween ble utført etter inkubasjon i det sekundære antistoff, etterfulgt av påvisning av HRP ved anvendelse av en forbedret kjemiluminescerende substrat (Thermo Scientific). Den resulterende fluorescens ble utviklet og fiksert på en røntgenfilm. Forsøkene ble utført i tre eksemplarer og gjentas minst 3 ganger.
Heft analysen
For å kunne vurdere limet potensialet i varierende tumorigene cellelinjer til basalmembran
in vitro
, laminin-1 (10 ug /ml) (BD Biosciences) ble anvendt for å belegge 96 mikrobrønnplater, og etterlater ikke-belagte brønner å bli brukt som negative kontroller. Etter at belegget av brønnene i 1 time og vasking med 0,1% BSA i DMEM, ble andre proteinbindingsseter på den mikrobrønnplate blokkert ved bruk av 100 mL av 0,5% BSA i DMEM i en time. Cellene ble suspendert i serumfritt kulturmedium og tilsatt til brønner med en tetthet på 4 x 10
5 celler /ml for å vurdere adhesjonen potensial. Videre er celler som har blitt pre-inkubert med IgG1-iS18 (0,2 ug /ml) og med anti-CAT (Sigma, 0,2 ug /ml) antistoff som negativ kontroll ble tilsatt til de aktuelle brønner for å undersøke effekten av antistoffene på adhesjonen potensial av cellene. Platene ble inkubert ved 37 ° C i 1 time og deretter ble ikke-adherente celler ble vasket bort med PBS og adherente celler ble fiksert med 4% paraformaldehyd i 10 minutter. Adherente celler ble farget med 0,1% krystallfiolett. Flekken ble ekstrahert ved anvendelse av 1% SDS og absorbansen av den ekstraherte prøven ved 550 nm ble analysert som et mål på klebemiddelpotensialet. Forsøk ble utført in triplo og gjentas minst tre ganger.
Invasion assay
In vitro
analyse av evnen som tumorigene cellelinjer for å invadere basalmembran utført ut ved hjelp av ECM-lignende Matrigel. Serumfritt kaldt kulturmedium (DMEM) ble anvendt for å fortynne den Matrigel og dette fortynnede gel ble dispensert på det øvre kammer i en 24 transwell plate (BD Falk, 8 um porestørrelse). Denne gelen ble deretter tillatt å størkne i ca. 5 timer ved 37 ° C. Etter å ha blitt høstet, ble cellene resuspendert i serumfritt kulturmedium med en tetthet på 1 x 10
6 celler /ml. Antistoff behandlinger som kreves for celler som skal inkubert med IgG1-iS18 (0,2 ug /ml) eller den negative kontroll anti-CAT (Sigma, 0,2 ug /ml) antistoff. Celler ble deretter applisert på den øvre Matrigel-dekket kammeret og inkubert i 18 timer. Det nedre kammer ble fylt med 500 ul kulturmedium inneholdende 10% FCS (for testen) og ingen FCS (for kontroll), og inkubert ved 37 ° C i 18 timer. Dette ble etterfulgt av aspirasjon av media i nedre og øvre kammer. Ikke-invasive celler ble deretter fjernet ved anvendelse av en bomullspinne. De gjenværende invasive Cellene ble deretter vasket med 300 ul av PBS og fiksert ved hjelp av 300 ul av 4% paraformaldehyd, 10 min. Celler ble farget med 0,5% toluidin blått fargestoff og etter ekstraksjon av fargestoffet ved bruk av 1% SDS, absorbansen ble deretter målt ved 620 nm ved anvendelse av en ELISA-leser. Forsøk ble utført i triplikat og gjentas minst tre ganger.
statistiske evalueringer
to-halet t-test med et konfidensintervall på 95% ble anvendt for å analysere dataene , med p-verdier på mindre enn 0,05 ble betraktet som signifikant. Omfanget eller grad av sammenheng mellom LRP /LR nivåer på celleoverflaten og invasive /lim potensiale ble målt ved hjelp av Pearsons korrelasjonskoeffisient. Pearsons korrelasjonskoeffisient ble også brukt til å måle korrelasjon mellom limet og invasiv potensialet i de cellelinjer. En positiv koeffisient var en indikasjon på direkte proporsjonalitet mellom de to variablene, mens en negativ koeffisient forstått invers proporsjonalitet.
Resultater
leverkreft og leukemi celler avdekke LRP /LR på celleoverflaten
Som utgangspunkt for forekomsten av metastase er samspillet mellom laminin-1 og LRP /LR på celleoverflaten. Derfor var det nødvendig å visualisere celleoverflate LRP /LR som et middel for bekreftelse på at cellene faktisk gjøre skjermen LRP /LR på deres overflate. Begge tumorigene cellelinjer, så vel som dårlig-invasiv brystkreft kontroll, viste LRP /LR på celleoverflaten som vist i figur 1 a). Den grønne fluorescens i bildene nedenfor er en indikasjon på celleoverflaten LRP /LR som celler var ikke-permeabilisert og det sekundære antistoff ble vist å ikke binde ikke-spesifikt, som vist med kontrollene som er avbildet i figur 1 b) og Fig.1 c) nedenfor. Anti-CAT-antistoff ble anvendt som en negativ kontroll på grunn av sin evne til å bindes spesifikt til kloramfenikol-acetyltransferase (CAT), som er et bakterielt protein, og er derfor fraværende i pattedyrceller.
Cellene var ikke-permeabilisert for å kunne muliggjøre visualisering av celleoverflaten. a) Celler ble merket med primært antistoff IgG1-iS18 og et FITC-koblet sekundært antistoff. b) Celler ble merket med anti-kloramfenikol acteyltranferase (CAT) antistoff som negativ kontroll. c) Cellene ble merket bare med FITC-koblet sekundært antistoff for å bekrefte at det sekundære antistoff ikke binder ikke-spesifikt.
høye prosenter av tumorigene celler vise LRP /LR på celleoverflaten
Selv om konfokal mikroskopi bekreftet at cellelinjene gjør faktisk skjerm LRP /LR på deres celleoverflate, ble ytterligere kvantifisering av celleoverflate nivåene av LRP /LR er nødvendig. Strømningscytometri ble anvendt for kvantifisering.
Som vist i figur 2 A, C og E, alle tre tumorigene cellelinjer avdekket høye prosenter av celler innenfor en bestemt populasjon som viser LRP /LR på celleoverflaten, med forskyvning mellom de to toppene i hvert diagram er indikativ for en forandring i fluorescensintensitet på grunn av celleoverflatefarging av cellene med anti-LRP /LR spesifikke antistoff IgG1-iS18 og den fluorkrom-koblet sekundært antistoff. HUH-7 leverkreftceller viste en høyere prosentandel av celler som oppviser LRP /LR på celleoverflaten i forhold til K562-leukemi-celler, så vel som dårlig-invasiv brystkreft (MCF-7) kontrollcellelinje. Fig. 2 B, D og F i tillegg omfatte de ufargede kontroll og denne kontroll tjente til å vise at den PE sekundære antistoff ikke binder ikke-spesifikt. Skiftene i fluorescens intensitet av ufargede, APC bare og anti-CAT-APC merkede celler (negative kontroller) er representert i figur S1. Det er også verdt å merke seg å legge til at cellerester og celleaggregater ble ekskludert fra analysen som de var utenfor de definerte gate (Fig. S3).
Den første toppen i grafer A, C og E er representativ for ikke- merkede celler, dvs. celler merket med geite-anti-human PE-koblet sekundært antistoff bare, mens den andre topp er indikativ for celler merket med både anti-LRP /LR spesifikke antistoff IgG1-iS18 og det sekundære antistoff, begge ved en konsentrasjon på 30 ug /ml. Grafer B, D og F viser at inkluderingen av en unstained kontroll for å vise ingen ikke-spesifikk sekundær antistoffbinding. Forsøk ble utført i triplikat og gjentatt minst tre ganger med 20 000 celler telles per prøve.
leverkreftceller vise signifikant høyere og leukemiceller vise signifikant lavere celleoverflate LRP /LR nivåer sammenlignet dårlig-invasiv brystkreft celler
i tillegg til prosentandelen av celler som oppviser LRP /LR på deres celleoverflate, ble den faktiske celleoverflate LRP /LR nivåer i en bestemt cellepopulasjon analysert ved hjelp av strømningscytometri. Det samme antall celler (20000 celler) i løpet av spesifikke populasjoner av de tre tumorigene cellelinjer ble merket med den samme konsentrasjon (30 ug /ml) av tidligere nevnte primære og sekundære antistoffer i løpet av den samme tidsperioden. Således, jo mer LRP /LR som er til stede på overflaten av tumorigene celler, ville mer primære antistoff IgG1-iS18 bindes til LRP /LR og deretter, ville flere IgG-specifc fluorkrom-koblet sekundært antistoff bindes til det primære antistoffet . Dermed vil de midlere fluorescensstyrkene (MFI) varierer mellom de tre cellelinjer (tabell 1), og kan derfor brukes som en indikator på celleoverflate LRP /LR nivåer. Det ble observert at, i forhold til den dårlig-invasiv, MCF-7 brystkreftcellelinje kontroll, leverkreftceller (hæ-7) utviste høyere nivåer av LRP /LR på deres celleoverflate (Fig.3). I tillegg K562-leukemi-celler viste nedre celleoverflate LRP /LR-nivåer i forhold til MCF-7-celler (fig.3).
Celler ble merket med primært antistoff IgG1-iS18 (01:25) og anti- human fykoerytrin (PE) sekundært antistoff. 20000 celler ble analysert på tvers av alle tre cellelinjer, og de midlere fluorescensstyrkene (MFI) ble anvendt som en indikator på celleoverflate LRP /LR nivåer. MFI-verdier som er angitt i den siste kolonnen i tabell 1 ble brukt for å konstruere denne figur og det er bemerkelsesverdig at MFI-verdien som svarer til den MCF-7-cellelinjen ble satt til 100%. Forsøk ble utført in triplo og gjentas minst tre ganger. ** P = 0,0025, *** p. 0,0001
Median fluorescensstyrkene innhentet post anti-CAT merking og gjenkjenning vise at det ikke er noen signifikant forskjell i graden av celle- overflate CAT farging i alle tre cellelinjer (fig. S2)
Total LRP /LR nivåene ikke signifikant forskjellig mellom de tumorigene cellelinjer
Som tidligere nevnt, LRP /LR ikke utelukkende forekommer på celleoverflaten, men er i tillegg sett i kjernen og cytosol, ble utført derav Western blot-analyse for å vurdere total LRP /LR nivåer. Forsøk ble utført in triplo og gjentatt tre ganger. En representativ blot er vist i Fig.4. Det er bemerkelsesverdig å fastslå at bare en 37 kDa reseptor laminin forløper kunne påvises ved anvendelse av anti-LRP /LR spesifikke antistoff IgG1-iS18.
Anti-LRP /LR spesifikke antistoff IgG1-iS18 ble anvendt som primære antistoff i forbindelse med en sekundær HRP-koblet antistoff. β-actin ble ansatt som en lasting kontroll.
Etter påvisning av LRP, kvantifisering av totalt LRP nivåer var nødvendig og densitometry ble ansatt for å oppnå dette. Fig.5 viser densitometrisk analyse, som viste at statistisk sett, det var ingen signifikant forskjell ble observert i totalt LRP nivåer mellom de tre tumorigene cellelinjer.
Kvantifisering ble utført ved bruk av densitometri og data er representativt for forsøk utført i triplikat og gjentatt tre ganger. Ikke-signifikante (NS): p. 0,05
IgG1-iS18 hindrer limet potensialet av leverkreftceller
Som utgangspunkt for oppstart av invasjonen er heft tumorigent betydelig celle til basalmembranen gjennom LRP /LR-laminin-1 interaksjon som gjør det mulig for andre interaksjoner å forekomme som letter nedbrytningen av basalmembranen. Celler ble inkubert med IgG1-iS18 og anti-CAT antistoff (0,2 mg /ml) og etter en time, avlesninger av den resulterende oppløsning var en indikasjon på graden av celleadhesjon til laminin-1-belagte plater.
som vist i Figur 6, er ingen antistoffkontroll tillatt for bestemmelse av klebemiddelpotensialet av cellelinjene og det ble observert at både leverkreft (HÆ-7) såvel som leukemiceller (K562) var mer enn vedheftende de dårlig-invasiv brystkreft (MCF-7) kontrollceller. Imidlertid IgG1-iS18 var bare effektive til å hindre eller vanskeliggjøre den klebende potensialet av leverkreftceller og ingen signifikant reduksjon i adhesjon ble observert for leukemiceller behandlet med anti-LRP /LR spesifikke antistoff IgG1-iS18. Som ventet ble det av anti-CAT kontroll antistoff ikke ha en betydelig effekt på limet potensialet i tumorigene cellelinjer
p-verdier er vist i rødt (* p = 0,0238; *** p = 0,0002). indikerer økningen i klebe potensialet av leverkreft (HÆ-7) og leukemi (K562-celler) sammenlignet med brystkreft (MCF-7) kontrollcellelinje. p-verdier vist i svart (** p = 0,0031; *** p = 0,0005) representerer reduksjonen i klebemiddelpotensial etter behandling av celler med passende antistoffer. En reduksjon på 63,35% i klebemiddelpotensialet ble observert ved administrering av IgG1-iS18 til de HÆ-7 leverkreftceller. Dataene representerer eksperimenter utført in triplo og gjentas minst tre ganger.
invasjon av Matrigel av leverkreftceller (Huh-7) er betydelig hindret ved hjelp av anti-LRP /LR spesifikke antistoff IgG1-iS18
invasjon av basalmembranen er ansett som en forutsetning for utviklingen av et metastatisk kreft, derav invasjon analyser ved anvendelse av en Matrigel, som etterligner komponentene i basalmembranen, ble utført for å bestemme den invasive potensialet i tumorigene cellelinjer. På samme måte som klebetest, ingen antistoff-kontroll tillates for bestemmelse av invasiv potensialet i de cellelinjer. Videre ble cellene behandlet med anti-LRP /LR spesifikke antistoff IgG1-iS18 og anti-CAT-antistoff (0,2 mg /ml).
Som vist i Figur 7, leverkreft (hæ-7) celler er betydelig mer invasive i forhold til dårlig-invasiv brystkreft (MCF-7) kontrollcellelinje, mens leukemi (K562) celler viste en betydelig lavere invasiv potensiale sammenlignet med kontrollen. Videre IgG1-iS18 hell hemmet invasiv potensialet av leverkreft (HÆ-7) celler, mens ingen signifikant resultat ble observert for de leukemiceller. Som ventet ble det av anti-CAT antistoff kontrollen ikke påvirke invasiv potensialet i tumorigene cellelinjer
p-verdiene angitt i rødt (* p = 0,0485; ** p = 0,0053). Representerer endringene i invasiv potensialet av cellelinjer i forhold til MCF-7-kontroll, mens p-verdier vist i sort (* p = 0,0214; ** p = 0,0091) er indikativ for effekten av egnede antistoffer på invasiv potensialet i de cellelinjer. Ved administrasjon av IgG1-iS18 til HUH-7 leveren kreftceller, ble en reduksjon på ca 39,75% observert om invasiv potensialet i cellene. Data er representativt for forsøk utført i triplikat og gjentas minst tre ganger.
diskusjon
Flere studier har vist at, på celleoverflaten, forskjellige tumorigene cellelinjer oppviser en overekspresjon av det 37 kDa /67 kDa LRP /LR, således som tyder på at LRP /LR-laminin-1 interaksjon kan være svingbar for kreftceller til å gjennomgå metastase [21]. Det kan derfor være nyttig for å hemme denne interaksjonen som et middel for å hindre adhesjon og invasjon – to hendelsene ble funnet å være avgjørende for forekomsten av prosessen med metastasering. En studie utført av Zuber
et al
har vist at IgG1-iS18 antistoff er svært spesifikk for LRP /LR [18]. Videre har nyere forskning har vist at anti-LRP /LR spesifikke antistoff IgG1-iS18 hindrer klebemidlet og invasive potensialet for cervical [4], lunge [4], prostata [4], tykktarm [4], bryst [20] betydelig øsofagus [20] kreftceller. Den foreliggende studien undersøkte rollen til LRP /LR i adhesjon og invasjon av leverkreft (HÆ-7) samt leukemi (K562) celler, og forsøkte å etablere om anvendelse av anti-LRP /LR spesifikke antistoff IgG1-iS18 signifikant reduserer klebemidlet og invasive potensialet i disse to tumorigene cellelinjer.
å begynne med konfokal mikroskopi viste at alle tre tumorigene cellelinjer som faktisk skjerm LRP /LR på deres celleoverflate (fig. 1a). Imidlertid er denne teknikk begrenset av det faktum at det ikke er kvantitativ og er nødvendig for ytterligere analyse for å etablere de nivåene hvor LRP /LR er vist på celleoverflaten av disse tumorigene cellelinjer.
Betydelig høy prosenter ( 87%) av alle tre tumorigene cellelinjer, nemlig HUH-7, K562, og MCF-7 (dårlig-invasiv brystkreft kontroll) celler vist LRP /LR på deres celleoverflate (fig.2). Videre ble det observert ved analyse av forskjeller i median fluorescensintensiteter som, i forhold til MCF-7-kontroll-cellelinjen, leverkreftceller (Huh-7) viste betydelig høyere og leukemi-celler (K562) viste signifikant lavere celleoverflate LRP /LR nivåer (figur 3). Som tidligere nevnt, spiller LRP /LR viktige roller i adhesjon, invasjon, migrering og proliferasjon av celler [9]. Ser at den HÆ-7-cellelinjen er kjent for å være invasiv og K562 forstås å være et suspensjonscellelinje (ATCC), kan celleoverflate nivåene av LRP /LR som er observert å korrelere med den invasiv potensialet til disse celle
