Abstract
Prostatakreft er en klinisk heterogen sykdom, alt fra lat asymptomatisk sykdom til svært aggressive metastatisk og livstruende former av sykdommen. Fjernmetastaser representerer den viktigste dødelig årsaken til prostatakreft. Den mest kritiske kliniske utfordringer i forvaltningen av pasientene er å identifisere de personer i risikosonen for å utvikle metastatisk sykdom. For å forstå de molekylære mekanismene for prostatakreft metastase og identifisere markører med metastatisk potensial, har vi analysert protein uttrykk i to syngene prostatakreftcellelinjer PC3-N2 og PC3-ML2 bruker isobariske koder for relativ og absolutt kvantifisering merking og flerdimensjonale protein identifikasjon teknologi væskekromatografi matriks assistert laserdesorpsjon ionisering tandem massespektrometri. PC3-N2 er ydmyk metastatisk mens PC3-ML2 svært metastatisk. Totalt 1,756 proteiner ble identifisert i analysene med 130 proteiner som viser forskjellige ekspresjonsnivåer (p 0,01) i de to cellelinjene. Av disse ble 68 proteiner funnet å være signifikant oppregulert, mens 62 er betydelig nedregulert i PC3-ML2 celler sammenlignet med PC3-N2 celler. Den oppregulering av plectin og vimentin som var de mest signifikant forskjellig uttrykt ble validert av Western blot og deres funksjonelle relevans i forhold til invasjonen og migrasjon ble bestemt av siRNA genet demping. Så vidt vi vet, er denne studien den første til å vise at oppregulering av vimentin og plectin uttrykk positivt korrelerer med invasjonen og metastasering av androgen-uavhengig PCA
Citation. Burch TC, Watson MT, Nyalwidhe JO ( 2013) Variable metastatisk Potentials Correlate med Differential Plectin og vimentin Expression i syngene androgen Uavhengige prostata kreft celler. PLoS ONE 8 (5): e65005. doi: 10,1371 /journal.pone.0065005
Redaktør: Gnanasekar Munirathinam, University of Illinois, USA
mottatt: 06.09.2012; Godkjent: 24 april 2013; Publisert: May 22, 2013
Copyright: © 2013 Burch et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av oppstartsmidler fra Eastern Virginia Medical School (EVMS) til Dr. Julius O. Nyalwidhe. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
i Europa og USA, Prostatakreft (PCA) er den vanligste kreftsykdommen blant menn og den tredje vanligste årsaken til kreftrelaterte-dødsfall. I 2011 var det anslagsvis 240,890 nye tilfeller og 33,720 dødsfall fra sykdommen i USA [1]. For de siste 2 årene, tidlig oppdagelse og screening av PCA har i hovedsak vært basert på påvisning av prostataspesifikt antigen (PSA) i serum i tillegg til digital endetarms eksamen (DRE), og histologisk vurdering av transrectal ultralyd (TRUS) veiledet biopsimateriale [2]. Selv om de fleste tilfellene blir detektert på et tidlig stadium, er sykdommen klinisk heterogene, strekker seg fra lat asymptomatisk sykdom til meget aggressiv metastatisk og livstruende former av sykdommen. Over 7% av tilfellene oppdages etter hvert utvikle fjernt metastatisk sykdom [3]. Prognosen for disse mennene er dårlig, og de har en gjennomsnittlig overlevelse på 24 til 48 måneder [3]. Den mest kritiske klinisk utfordring for PCa sykdom ledelse er å finne ut hvilke av disse to ulike former av sykdommen pasienten utvikler. Det vanligste stedet for PCa metastaser er beinet; ~90% Av pasientene med langt fremskreden PCa har skjelettmetastase [4]. Bone spredning PCa er nesten uhelbredelig og er forbundet med alvorlig sykelighet før døden, disse inkluderer skjelettsmerter, patologiske frakturer, nerve komprimering syndromer, og hyperkalsemi [4]. For tiden er tilgjengelige behandlingstilbud for pasienter med metastatisk sykdom er palliativ. Prognosen /diagnose av beinmetastatiske lesjoner er i dag bestemmes av tenkelig hjelp isotop bein skanning, computertomografi (CT) skanner, magnetic resonance imaging (MRI) skanning eller bein biopsi. Identifiseringen av prostatabiopsi eller serum basert biomarkør (er) for å forutsi mottakelighet av menn for å utvikle metastaser vil potensielt bedre diskriminere de mer aggressive metastatiske former av sykdommen og dermed gi bedre behandling og kliniske muligheter ledelse for sykdommen.
i løpet av årene nytten av PSA som en biomarkør for prostatakreft har vært kontroversielt i forhold til sin manglende evne til å skille lat fra aggressive former av sykdommen [5], [6]. PSA er også forbundet med høy forekomst av falske positive og falske negative testresultater, som nivåer kan være forhøyet i ikke-cancer forhold av prostata, deriblant godartet prostatahyperplasi (BPH) og prostatitt [7] – [10]. Nylig USA Preventive Services Task Force (USPSTF) anbefales mot PSA-basert screening for PCa i alle aldersgrupper om at fordelene ikke oppveier skadene av screening og behandling [11]. Denne manglende evne til å nøyaktig forutsi aggressivitet av prostatakreft basert utelukkende på standard clinicopathologic funksjoner klart understreker behovet for å utforske muligheten for kreftbaserte biomarkører for å forbedre utfallet prediksjon ved biopsi, og for å forstå den molekylære grunnlaget for prostatakreft metastaser. Derfor er flere biomarkører sterkt behov for å forbedre diagnostisk spesifisitet av PSA og forutsi potensialet for utvikling av sykdommen.
For bedre å forstå de molekylære mekanismene for prostata kreft metastaser, er det avgjørende å identifisere markører som er forbundet med metastaser. Proteomikk har vist seg å være en nyttig og vellykket tilnærming i screening tumor og metastaser relatert protein markører [12]. Det er flere proteomikk teknologi som er brukt i screening og identifisere potensielle kreftmarkører. The «isobariske tagger for Relative og absolutte Kvantitering» (iTRAQ) plattformen har fordeler av å være relativt høy gjennomstrømning, og det kan bli multiplekset for å gi informasjon om peptid /protein kvantifisering og identifikasjon, som rapportert i tidligere studier [13], [14] . I denne tilnærmingen av flere prøver fra forskjellige proteom reduseres, alkylert og proteolytisk spaltet for å generere peptider. Peptidene er merket med et sett av iTRAQ reagenser (i en 4 eller 8-plex-format), slått sammen og fraksjonert ved sterk kationbytter (SCX). Fraksjonene blir deretter analysert ved væskekromatografi tandem massespektrometri (LC-MS /MS), med de resulterende massespektra, ved å gi sekvensinformasjon (fra peptid-fragmenter), og relativ kvantifisering (fra rapportørgruppen ioner).
i et forsøk på å identifisere nye proteiner som er forbundet med metastatisk progresjon av human prostatakreft, har vi utført en 4-plex iTRAQ analyse ved hjelp av to syngeniske prostatakreftcellelinjer PC3-N2 og PC3-ML2 som har forskjellige metastatiske potensialer. PC3-N2 er ydmyk metastatisk mens PC3-ML2 er svært metastatisk. Etter sammenlignende kvantitative data-analyse, ble et antall kandidater funnet å være signifikant forskjellig uttrykt i PC3-ML2-celler sammenlignet med PC3-N2-celler. To av kandidatene identifisert som signifikant oppregulert i PC3-ML2 er plectin og vimentin. Disse proteinene ble videre undersøkt med Western blot og siRNA knockdown. Uttrykket nivåer korrelert til immunhistokjemi bilder fra normale og adenokarsinom prostata vevsprøver. De forskjellig regulert proteiner identifisert i studien, inkludert plectin og vimentin, er omtalt i sammenheng med deres betydning for prostatakreft progresjon.
eksperimentelle prosedyrer
Material
Dulbeccos modifiserte Eagle medium (DMEM) og føtalt bovint serum (FBS), antibiotika-antimykotika, 4-12% NuPAGE® Bis-Tris-geler og 2 x Laemmli-buffer var fra Invitrogen (Carlsbad, CA). Komplett ™ proteasehemmere ble kjøpt fra Roche Applied Sciences (Indianapolis, IN), sekvense klasse trypsin var fra Promega (Madison, WI), og Immobilon-FL PDVF membran var fra Millipore (Billerica, MA). BCA proteinkonsentrasjonen analysesett og proteinfritt blokkering buffer var fra Thermo Scientific (Rockford, IL). De primære antistoffer for vimentin (ab20346), plectin (ab83497) var fra Abcam (Boston, MA), og plectin (sc-7572), GAPDH (sc-25778), perk 1/2 (Thr 202 /Tyr 204) SC- 16982, ERK 1/2 (MK1) sc-135900, og CDC2 p34 (sc 53) var fra Santa Cruz Biotechnology Inc. (Santa Cruz, California). CDC2 (Cat # 9112) antistoff var fra Cell Signaling Technology. IRDye konjugerte sekundære antistoffer (Goat anti-mus IR680 Kat. Nr 926-3220, geit anti kanin IR800CW Kat. Nr 926-32211, geit anti kanin IR680 (Kat. Nr 926-32221), Donkey anti-geit IR680 (Kat. Nr 926-32224), Goat anti- mus IR800CW (Kat. nr 926-3220) var fra Li-COR biovitenskap (Lincoln, PA) og Alexa Fluor sekundære antistoffer for immunfluorescens konfokalmikroskopi var fra Invitrogen (Carlsbad, California). Kontroll siRNA- A (sc-37007), vimentin (h) (sc-29522) og plectin siRNA (h) (sc-29453) var fra Santa Cruz Biotechnology Inc. (Santa Cruz, California).
Cellelinjer linjer~~POS=HEADCOMP og Cell Culture
Foreldre PC3 ble opprinnelig hentet fra en skjelettmetastaser hos en pasient med primær prostata adenokarsinom. De to PC3-N2 og PC3-ML2 underlinjer var velvillig donert til oss av Dr. Stearns «gruppe ved Drexel University og ble utviklet som beskrevet av Wang og Stearn [15] de cellelinjer ble utviklet på grunnlag av deres invasivitet
in vitro Hotell og metastatisk potensial
in vivo
. Begge cellene tumorigent når injisert subkutant. i SCID-mus. Imidlertid, N2-celler var ikke i stand til å migrere gjennom en matrigel belagt membran
in vitro
så vel som induserer metastaser i SCID-mus, mens ML2 celler var meget inngripende
in vitro og induserte
skjelettmetastaser i mer enn 80% av tilfellene [15] – [17]. PC3-N2 og PC3-ML2-celler ble dyrket i DMEM-medium supplert med 10% FBS og 1% antibiotika ved 37 ° C med 5% CO
2. Celler ble deretter dissosiert fra plastoverflaten ved bruk av 5 mM EDTA i PBS. Den ikke-enzym-dissosiasjon buffer opprettholder celleoverflatemolekyler og celleviabilitet.
Protein Extraction Fordøyelse og ITRAQ merking
For de totale celle lysat eksperimenter PC3-N2 og PC3-ML2-celler ble dyrket i fullstendig vekstmedium opptil 80% samløpet. Cellene løsnet ved bruk av 5 mM EDTA i PBS og vasket med PBS og pelleten resuspendert i 160 pl oppløsning buffer inneholdende 100 mM NH
4HC0
3 og TFE (01:01 v /v). Prøvene ble lydbehandlet i 20 sekunder tre ganger og inkubert ved 60 ° C i 1 time. Lysatene ble sentrifugert for å fjerne cellerester og ubrutte celler før oppsamling av supernatanten. Proteinkonsentrasjonen ble bestemt ved BCA-analyse og normalisert for hver prøve. 100 ug porsjoner av prøvene ble tørket i en speedvac og underkastet trypsin fordøyelse og peptid merking med iTRAQ reagenser ifølge produsentens instruksjoner (iTRAQ Reagenser Multiplex Kit; ABSciex, Foster City, CA). I korthet ble 100 ug protein ble vakuumtørket og resuspendert i 20 ul oppløsningsbuffer og 1 ul av denatureringsmiddel ved RT. Prøvene ble redusert, alkylert og trypsinert med 5 pg modifisert trypsin sekvense klasse (Promega, Madison, WI, USA) i 18 timer ved 37 ° C. Trypsin fordøyde prøver ble merket med fire forskjellige iTRAQ reagenser oppløst i 70 mL etanol ved romtemperatur i 1 time. Reaksjonene ble stanset med 10 mM glycin. Prøvene var som følger: PC3-N2 celler prøver med 114 og 115 koder og PC3-ML2 prøver med 116 og 117 koder. Denne strategien gir interne tekniske replikater for de to typer prøver. Alle de fire merkede prøver ble samlet, vakuumtørket og fraksjonert ved bruk av en sterk kationbytter (SCX) kolonne.
2D-LC-separasjoner
I den første dimensjonen, SCX separasjoner ble utført på en passivert Waters 600E HPLC system, ved hjelp av en 4. x 250 mm polysulfoethyl aspartamide kolonne (PolyLC, Columbia, MD) ved en strømningshastighet på 1 ml /min. Buffer A inneholdt 10 mM ammoniumformiat, pH 2,7, i 20% acetonitril /80% vann. Buffer B inneholdt 666 mM ammoniumformiat, pH 2,7, i 20% acetonitril /80% vann. Stigningen var Buffer A ved 100% (0-22 minutter etter prøveinjeksjon), 0% → 40% Buffer B (16-48 min), 40% → 100% Buffer B (48-49 min), deretter isokratisk 100% buffer B (49-56 min) og deretter ved 56 min byttet tilbake til 100% A til re-ekvilibrering i den neste injeksjon. De første 26 ml elueringsmiddel (inneholdende alle gjennomstrømnings fraksjoner) ble kombinert i en fraksjon, og deretter 14 ytterligere 2 ml fraksjoner ble oppsamlet. Alle 15 disse SCX fraksjoner ble tørket ned fullstendig for å redusere volumet og for å fjerne de flyktige ammonium- formiatsalter, deretter resuspendert i 9 ul 2% (v /v) acetonitril, 0,1% (v /v) trifluoreddiksyre og filtrert før omvendt fase C18 nanoflow-LC separasjon. For den andre dimensjonen separasjon ved omvendt fase nanoflow LC ble hver SCX brøkdel automatisk injisert på en Chromolith CapRod kolonne (150 × 0,1 mm, Merck) med en 5 mL injektor sløyfe på en Tempo LC MALDI Spotting system (ABI-MDS /Sciex) . Buffer C var 2% acetonitril, 0,1% trifluoreddiksyre, og buffer D var 98% acetonitril, 0,1% trifluoreddiksyre. Den elueringsgradient var 95% O /5% D (2 mL per minutt strømningshastighet 0-3 min, deretter ble 2,5 mL per minutt 3 til 8,1 min), 5% D → 38% D (8,1 til 40 minutter), 38% D → 80% D (41-44 min), 80% D → 5% D (44-49 min) (startbetingelsene). Strømningshastigheten var 2,5 pl /min i løpet av gradienten, og en lik strøm av MALDI matriseoppløsning ble tilsatt post-kolonne (7 mg /ml rekrystallisert CHCA (α-cyano-hydroxycinnamic syre), 2 mg /ml ammonium-fosfat, 0,1% trifluoreddiksyre syre, 80% acetonitril). Den kombinerte elueringsmiddel ble automatisk prikket inn en rustfri MALDI sikteplate hver 6 sekunder (0,6 mL per spot), for totalt 370 plasser pr opprinnelige SCX brøkdel.
massespektrometri Analyse
prøve flekker ble tørket og kalibrerings flekker (ABI 4700 Mix) ble tilsatt til hver plate manuelt. MALDI målplater (15) ble analysert i en dataavhengig måte på en ABI 5800 MALDI TOF-TOF etter kalibrering. Massespektrometri (MS) spektra ble kjøpt fra hver prøve stedet ved hjelp av den nylig oppdaterte standard kalibrering, ved hjelp av 500 laser skudd per spot. En plate bred tolkning ble automatisk utført for å velge den høyeste toppen av hver observert m /z verdi for påfølgende tandem MS /MS-analyse. Opptil 2500 laser skudd på laser makt 4200, med kollisjon indusert dissosiasjon (CID) gass luft ved 01.02 til 01.03 × 10
-6 Torr ble akkumulert for hver MS /MS spekteret. Etter at MS og MS /MS oppkjøp, ble spektra fra alle 15 plater i utvalget som brukes for protein identifikasjon og kvantifisering ved hjelp av Paragon algoritme som gjennomføres i Protein Pilot 4.0-programvaren (ABI-Sciex) [18]. Spektrene ble søkt mot den menneskelige undergruppe (pluss vanlige forurensninger) av NCBI ikke overflødig database sammenkjedet med en omvendt «lokkedue» versjon den samme databasen ved hjelp av den nyeste av disse fasta databaser, hentet fra http: //www.ncbi.nlm. nih.gov/sites/entrez?db=Taxonomy cmd = search term =. . (Ref Seq Menneskelig database 20120204 sekvenser som inneholder 29766 proteinsekvenser, pluss 389 vanlige lab forurensninger proteinet Pilot søkeparametere var: Methyl methanethiosulfonate (MMTS) alkylerte cysteinrester, 4-Plex iTRAQ modifisering av lysin og N-terminal med et identifikasjons fokus på biologiske modifikasjoner og aminosyresubstitusjoner ved hjelp av grundige søk innsats. den Falske Discovery Rate (FDR) estimering ble bestemt ved samtidig å søke i sammensatt decoy databasen [19].
Pathway Analysis
data~~POS=TRUNC generert fra proteomikk massespektrometrisk analyse ble analysert ved hjelp av oppfinnsomhet Pathway Analysis (IPA, Oppfinnsomhet System, Redwood city, CA, www.ingenuity.com) Oppfinnsomhet Knowledge Base verktøyet ble brukt til å identifisere biologisk funksjon og kanoniske trasé som inkluderer og involverer forskjellig regulert proteiner.. IPA er en jevnlig oppdatert database som bruker dagens kunnskap tilgjengelig på gener, proteiner, normale cellulære og patologiske prosesser, signaliserer og metabolske veier, som er nødvendig for veien konstruksjon.
Protein Forberedelse til validering
PC3-N2 og PC3-ML2-celler ble dyrket til 80% konfluens og frittliggende ved anvendelse av 5 mM EDTA i PBS. For proteinekstraksjon, ble cellene vasket to ganger med PBS og lysert i modifisert RIPA-buffer [50 mM Tris-HCl (pH 7,4), 1 mM EDTA, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 0,25% natriumdeoksycholat] inneholdende en protease inhibitor cocktail (Complete, Mini, Roche) ved 4 ° C i 15 min. Prøvene ble sonikert i 1 min og sentrifugert ved 14000 g i 15 minutter ved 4 ° C, og supernatanten ble oppsamlet. Like mengder protein (BCA Protein Assay Kit, Pierce) fra hver prøve ble separert på en 4-12% Tris-glysin natriumdodecylsulfat-polyakrylamidgel ved elektroforese (SDS-PAGE), fulgt av Western blot overføring til PVDF. For Western-analyse, ble underkastet elektroforese proteinene overført til PVDF-membran, blokkert med Odyssey blokkeringsbuffer (Rockland immunokjemiske, Gilbertsville, PA), probet med de primære antistoffene over natten ved 4 ° C. Etter vasking ble membranene inkubert med de respektive IRDye konjugerte sekundære antistoffer og visualisert ved hjelp av en Odyssey infrarød bildesystem (Li-COR biovitenskap, Lincoln, Nebraska).
Transfeksjon og lyddemping av Plectin og vimentin av siRNA
siRNA tomannsboliger ble brukt til taushet plectin og vimentin uttrykk. En ikke-målsøkende 20-25 siRNA dupleks ble anvendt som den negative kontroll. SiRNA tomannsboliger ble transfektert inn i PC3 cellelinjer med siRNA transfeksjon reagens i henhold til produsentens instruksjoner Santa Cruz Biotechnology Inc. (Santa Cruz, California). Etter transfeksjon i 72 timer, ble cellene underkastet Western blot og immunofluorescensanalyse for å påvise effektiviteten av vimentin og plectin knockdown og for å bestemme effektene av den knockdown på migrasjon og invasive egenskaper av cellene.
Konfokalmikroskopi analyse
PC3-N2 og PC3-ML2 celler ble sådd ut på 6-brønners plater inneholdende glass dekkglass og dyrket i 10% FBS /DMEM i 2 dager. Cellene ble vasket med iskald PBS, fiksert med iskald metanol i 5 min. Deretter ble de fikserte cellene ble vasket med PBS og farget med primære antistoffer mot plectin, vimentin, og CDK2 over natten ved 4 ° C. De primære antistoffer ble fjernet og cellene ble vasket med iskald PBS før farging med Alexa Fluor konjugerte sekundære antistoffer i 1 time ved romtemperatur. TOPRO flekken ble levert med de sekundære antistoffer for nukleær farging. De sekundære antistoffer og atom flekker ble vasket bort og dekkglass montert på lysbilder med Vector Shield medium som inneholder DAPI flekken (Vector Labs, Burlingame, CA), og forseglet med neglelakk. Fluorescent bilder ble undersøkt og tatt med et konfokal mikroskop (Carl Zeiss, Thornwood, New York).
Cell Proliferation Assay
PC3-N2 og PC3-ML2 celler i 24-brønners retter på en tetthet av 2 x 10
4 celler og transfektert med ikke-målretting og plectin /vimentin spesifikk siRNA ved en sluttkonsentrasjon på 20 nM. Begge er bundet til og flytende celler ble oppsamlet etter sentrifugering med lav hastighet og trypsination. Cellene ble farget med trypanblått, og antall trypanblått-positive celler ble talt opp på dag 2, 4, 6 etter transfeksjon.
Scratch analysen /Wound Healing Invasion analysen
migrasjon evnen til de to cellelinjer ble evaluert ved en sårheling assay. Kort sagt ble PC3-N2 og PC3-ML2 cellene sådd ut i 6-brønners skåler i en tetthet på 2 x 10
5-celler og transfektert med ikke-målretting og plectin /vimentin spesifikk siRNA ved en sluttkonsentrasjon på 20 nM i 72 timer. En kunstig sår ble nøye opprettet ved 0 h ved hjelp av en 200 mL pipette tips å skrape i konfluent celle monolag i tre eksemplarer for hver tilstand. Cellene ble vasket med PBS, og dyrket i 10% FBS-DMEM med 5% CO2 og 37 ° C. Et mikrofotografi ble tatt umiddelbart etter skraping (tid 0 h), og 24 timer senere i henhold til 10 x objektivlinsen ved hjelp av et invertert Zeiss AxioObserver.A1 fase-kontrast mikroskop (Zeiss, Oberkochen, Tyskland). Migrasjons avstander i triplikatbrønner ble målt og gjennomsnitt og standardfeilverdier sammenlignet mellom kontroll og plectin og vimentin knockdown celler.
Trans-vel Migrasjon Analyser
For å undersøke invasivitet av de to cellelinjer, en membran invasjon kultursystem ble anvendt som følger. Celler som forbehandlet med kontroll siRNA eller vimentin og plectin sirnas ble sultet over natten i DMEM media med 0,5% FBS, deretter ble trypsinert og suspendert på nytt i DMEM inneholdende 0,5% bovint serumalbumin. -Celler (1 x 10
5) ble tilsatt til de beste kamrene i 24-brønners plater (Corning Transwell, 8 um porestørrelse), og DMEM med 10% FBS og LPS ble tilsatt til de nederste kamre. Nedre kammer ble fylt med kulturmedium inneholdende enten 0,5% FBS som en kontroll eller inneholdende 10% LPS som et lokkemiddel. Platene ble inkubert ved 37 ° C i 24 timer. Ved slutten av inkubasjonsperioden, ble den øvre overflaten av membranen tørket med en bomullsspiss applikator for å fjerne ikke-migrerende celler. Celler som migrerte til bunnsiden av membranen ble fiksert og farget med hematoksylin å visualisere kjerner. Cellene ble kvantifisert ved å telle fem høy drevet felt under 100 x forstørrelse, og midlene for hvert kammer ble bestemt i triplikat. Prosent invasjonen var representert som gjennomsnitt antall celler migrerer gjennom membranen for plectin og vimentin silenced celler i forhold til ikke-måls siRNA.
Korrelasjon av Plectin og vimentin uttrykk med bruk av menneskelige Proteome Atlas
The human protein Atlas database viser uttrykk og lokaliseringsmønstre proteiner i en stor del av menneskelig vev og organer med vekt på strategier for å validere immunhistokjemi basert protein expression mønstre for kreft forskningsprosjekter. Den ultimate mål for prosjektet er å skape en informasjonsdatabase protein uttrykk mønstre i normal menneskelig vev, i celler og i kreft, og utnytte genererte antistoffer og protein uttrykk data som verktøy for å identifisere klinisk anvendelige biomarkører [20], [21] sikret database inneholder bilder med høy oppløsning kommentert av en sertifisert patologer. The Human Protein Atlas ble brukt til å screene for uttrykket av plectin og vimentin fokus på immunhistokjemi av normal og kreft prostata vev. Disse komparative analyser i kombinasjon med data generert i denne studien vil gi grunnlag for fremtidige hypotese drevet undersøkelser av rollen til disse proteinene i prostatakreft sykdomsprogresjon.
Statistical Analysis
Hver av disse forsøk ble utført i tre eksemplarer. Data er uttrykt som gjennomsnitt ± standard feil av gjennomsnittet (S.E.M.). Statistisk analyse ble utført ved hjelp av SPSS 13.0 statistisk programvare (SPSS, Inc. Chicago, IL, USA).
P
. 0,05 ble betraktet som signifikant
Resultater
Identifikasjon av forskjellig uttrykt proteiner i PC3-N2 og PC3-ML2 cellelinjer Bruke iTRAQ Merking og 2D LC-MS /MS
Vi har analysert proteomet av syngene prostatakreft celle PC3-N2 og PC3-ML2 av 2D LC-MS /MS ved hjelp iTRAQ, for å generere data av forskjellig uttrykt proteiner. Den generelle eksperimentelle arbeidsflyt er vist i Tilleggs figur S1. Totalt 1756 ikke-redundante proteiner ble gjentatte ganger identifisert av duplikat iTRAQ merking og 2D LC-MS /MS analyser, hvorav 95% ble identifisert med 2 peptid kamper. Den falske funnrate (FDR) for proteiner identifikasjon basert på å søke mot en reversert database var 1%. Den detaljerte informasjonen, inkludert informasjon av peptidsekvenser, protein kvantifisering dato, gjennomsnittlig iTRAQ forhold, og distinkte og vanlige peptider med en gruppe proteiner for disse identifiserte proteiner er vist i tabell S1. For å identifisere differensielt uttrykte proteiner i PC3-N2 og PC3-ML2 som kan være relatert til invasjon og metastase, ble protein ekspresjonsprofiler mellom de to cellelinjer sammenlignet. Proteinene som oppfylte disse kriterier ble trygt betraktet som differensielt uttrykte proteiner: (i) proteiner ble gjentatte ganger identifiseres av de duplikate eksperimenter; (Ii) proteiner ble identifisert basert on≥2 peptider; (Iii) proteiner viste en gjennomsnittlig ratio-fold change≥1.5 or≤0.667 i de dupliserte eksperimenter mellom de to cellelinjene (
t
test,
p
0,05). Ved hjelp av disse kriterier, ble 130 proteiner funnet å bli uttrykt forskjellig i PC3-N2 og PC3-celler ML2. Av disse proteinene, 62 ble funnet å være oppregulert mens 68 ble nedregulert. Navnene til disse 130 proteiner og deres ekspresjonsnivåer er vist i tabell S1. Noen av de MS /MS-spektra som brukes for identifikasjon og kvantifisering av PLEC1 og VIM med betydelig høy andel gangers endring i PC3-ML2-celler sammenlignet med PC3-N2 linjer er vist i figurene 2A og S S 2B. MS /MS-spektrum for GAPDH som ikke har fold endringer i de to cellelinjene er vist i Figur 2C S. EphA2 er et eksempel på et protein som er nedregulert i PC3-ML2 vs PC3-N2, og dette er vist i figur S 2D. En høy overensstemmelse ble observert mellom de to reporter ioneintensitetene for et gitt peptid for praktisk talt alle peptider identifisert. Den gjennomsnittlige fold-endring for et protein som ble oppnådd ved å bruke alle de peptider som identifiserer dette protein. Derfor er våre protein identifikasjoner og kvantifisering er konsekvente og av høy tillit. Denne undergruppe av 130 differensielt regulerte proteiner ble brukt for all senere bioinformatikk analyse, biologiske merknader og tolkning.
Pathway Analysis
Ved hjelp av oppfinnsomhet programvaren de differensielt regulerte proteinene ble tildelt en subcellulære lokalisering, molekylær og cellulære funksjoner, og deres mulig involvering i sykdommer og forstyrrelser. Tall 1A, B og C viser deres sub-cellulær lokalisering, deres cellulære og molekylære funksjoner, samt de viktigste sykdommer og lidelser som de representerer henholdsvis. Tabeller S2 og S3 oppsummere de ulike funksjonskategorier og deres p-verdier. Våre resultater tyder på at forskjellig regulerte proteiner mellom de to syngene prostatakreftcellelinjer er hovedsakelig involvert i kreft, hudsykdom, genetiske lidelser, gastrointestinal sykdom, og immunologisk sykdom. Bruke IPA kunnskapsbase verktøy, har vi identifisert de beste nettverk og kanoniske trasé som tyder på de viktigste mulige funksjoner av proteiner som er forskjellig uttrykt i de to cellelinjer. Som angitt i tabell S4 og S3 figur, er den øverste nettverk cellemorfologi, utvikling og funksjon bindevev, og cellulær bevegelse.
oppfinnsomhet kunnskapsbasen analyse ble brukt for å bestemme den sub-cellulær lokalisering, molekylære og biologiske funksjoner og andre sykdommer som er forbundet med proteiner som blir differensielt regulert mellom PC3-N2 og PC3-celler ML2. Antallet proteiner er vist i x-aksen og i tabell S2 og S3.
Validering av forskjellig uttrykt Proteiner Identifisert av proteomikk
Blant de 130 proteiner med endret uttrykk, vi fokusert på to proteiner plectin og vimentin, som ble meget signifikant oppregulert i PC3-ML2 vs PC3-N2. I tillegg er deres ekspresjonsnivåer er ikke blitt godt undersøkt i prostata kreft. Western blotting ble utført for å påvise den uttrykksnivåene for de to proteiner i triplikate eksperimenter. Som vist i figur 2, blir PLEC1 og VIM ekspresjonsnivåene signifikant økt i PC3-ML2 vs PC3-N2, som er forenlig med MS-analyse av data. De relative uttrykk nivåer av plectin normalisert og vimentin med GAPDH nivå er indikert ved siden av Western blotting bildet. I komplementære analyser, immunfluorescens-analyser bekrefter effektiv banket ned i plectin og videre validere massespektrometri data som vist i figur 3 panel A hvor intensiteten av plectin farging er vist å være signifikant sterkt uttrykt i PC3-ML2 sammenlignet med PC3-N2. Det samme ble observert for de vimentin knockdown-celler (figur S4)
Totale cellelysater (40 ug) av N2 og ML2 celler ble underkastet SDS-PAGE. De separerte proteiner ble analysert ved hjelp av Western blot-analyse for å detektere plectin og vimentin som beskrevet. GAPDH påvisning ble inkludert som en lasting kontroll.
Celler ble behandlet med kontroll siRNA eller Plectin genet bestemt siRNA i 3 dager og deretter fast, inkubert med kanin polyklonale anti-plectin og mus monoklonalt anti-CDK2 primær antistoffer før «flekker» med Alexa Fluor konjugert esel anti-kanin sekundære antistoffer (grønn), geit anti-mus sekundære antistoffer (rød) og den kjernefysiske flekken TOPRO (blå). Panel A viser bildene for kontroll siRNA transfekterte celler og Panel B viser Plectin siRNA transfekterte celler.
Plectin og vimentin Knockdown hemmer spredning av PC3-ML2 cellelinjer
Vi undersøkte om plectin og vimentin bidra til celleproliferasjon i prostata kreft ved hjelp av RNAi teknikk. Etter innføring av plectin og vimentin siRNA inn i PC3-ML2-celler i 72 timer, ble undertrykkelse av plectin og vimentin bekreftet ved Western-blotting, mens kontrollen ikke-målsøkende siRNA hadde ingen signifikant effekt på endogen plectin og vimentin uttrykket (figur 4). Ekspresjonen av plectin og vimentin ble redusert med 72% og 99,9% henholdsvis i forhold til kontrollene (
p
0,05). Den relative uttrykk for GAPDH i kontrollene og plectin /vimentin målrettet siRNA knockdowns er identiske. Spredning av PC3-ML2 celler ble undersøkt av celle telle 2-6 dager etter siRNA behandling. Våre data viser at celleformering ble signifikant redusert ved både plectin og vimentin knockdown (figur 5). Data fra utfyllende analyser viser ingen signifikante forskjeller i levedyktigheten til begge cellelinjer (figur S5).
Celler ble behandlet med kontroll siRNA, plectin eller vimentin genet bestemt siRNA. Totale cellelysater (40 ug) fra ML2 celler ble underkastet SDS-PAGE. De separerte proteiner ble analysert ved hjelp av Western blot-analyse for å detektere plectin og vimentin som beskrevet.
