Abstract
Heat-sjokk proteiner (HSP) er molekylære anstand som beskytter proteiner fra skader. HSP27 ekspresjon er assosiert med kreft transformasjon og invasjon.
Ginkgo biloba
ekstrakt (EGb761), verdens mest solgte herbal supplement, har antiangiogenic effekter og induserer svulst apoptose. Data vedrørende effekten av EGb761 på HSP ekspresjon er begrenset, spesielt i kreft. HSP27 uttrykk i sammenkoblede svulster og normal lunge vev av 64 pasienter med ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) ble oppdaget av real-time PCR, western blotting, og immunhistokjemi. NSCLC cellelinjer (A549 /H441) ble brukt for å undersøke trekkende evner
in vitro
. NSCLC vev viste høyere HSP27 uttrykk enn normalt lungevev. Kaplan-Meier-overlevelsesanalyse viste at NSCLC pasienter med lav HSP27 uttrykk forhold (mindre enn 1) hadde signifikant lengre overlevelsestid enn de med en høy ekspresjon forhold ( 1) (p = 0,04). EGb761 hemmet HSP27 ekspresjon og migrerende evne til A549 /H441-celler, som er det samme som HSP27-siRNA transfeksjon effekt. Videre EGb761 behandling aktivert AKT og p38 trasé og ikke påvirke uttrykket av PI3K, ERK, og JNK veier. HSP27 er et dårlig prognostisk indikator på NSCLC. EGb761 kan redusere migrasjon evne til A549 /H441 ved å hemme HSP27 uttrykk mest sannsynlig gjennom AKT og p38 MAPK trasé aktivering
Citation. Tsai JR, Liu PL, Chen YH, Chou SH, Yang MC, Cheng YJ, et al. (2014)
Ginkgo biloba
Pakk Reduserer ikke-småcellet lungekreft Cell migrasjon av Downregulating metastaser-Associated Factor Heat-Shock Protein 27. PLoS ONE 9 (3): e91331. doi: 10,1371 /journal.pone.0091331
Redaktør: Prasad S. Adusumilli, Memorial Sloan-Kettering Cancer Center, USA
mottatt: 29 oktober 2013; Godkjent: 09.02.2014; Publisert: 11 mars 2014
Copyright: © 2014 Tsai et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet delvis av tilskudd KMU-Q098022 fra Kaohsiung Medical University, og gi NSC102-2314-B-037-067 fra National Science Council, Taiwan. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Lungekreft er den ledende årsak til kreftdødelighet i verden. Selv med forbedringer i både diagnostiske og terapeutiske teknikker, er den samlede fem års overlevelse fortsatt dårlig. Dårlig prognose for lungekreft er hovedsakelig forårsaket av tidlig tilbakefall, metastaser, og dårlig respons på behandlinger som kirurgi, cellegift og strålebehandling [1] – [2]. Mangel på gode prognostiske biomarkører som kan forutsi behandlingsrespons og prognose, også påvirker behandlingsplaner og pasientens utfall.
Heat-sjokk proteiner (HSP) er en stor familie av proteiner som har viktige hemostatiske funksjoner i cellene under fysiologiske forhold. I henhold til molekylvekter, er HSP gruppert i flere underfamilier: små (HSP 20-30 kDa), HSP40, hsp60, hsp70, HSP90, og HSP100. Den viktigste funksjonen til HSP er å beskytte celler mot skader i stressende forhold [3]. I tillegg til deres cellebeskyttende effekter, kan HSP fremme carcinogenese ved å hemme apoptose [4] – [8] og ved å forsterke motstand mot behandling [9] – [10]. Imidlertid er rollen til HSP i forskjellige tumorer komplisert [4], [9].
HSP27 er et cytoplasmisk protein som er konstitutivt uttrykt i flere normale vev og maligniteter. Dets ekspresjon er blitt assosiert med dårlig prognose i eggstokk [11], bryst [9], [12], gastrisk [13] – [14], lever [15], og prostata-kreft [16] samt osteoscarcomas [7] . I hode- og halskreft [3] og urogenitalsystem tumor [17], har HSP27 uttrykk ingen effekt på prognosen. Men den prognostiske rolle HSP27 uttrykk i lungekreft er under debatt. Zimmermann et al. [18] rapporterte at serum HSP27-nivå var positivt korrelert med avanserte stadier lungekreft. HSP27 uttrykk kan øke chemoresistance av ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) og er en dårlig indikator på prognose [10], [19]. I kontrast er HSP27 overekspresjon forbundet med bedre overlevelse hos pasienter med NSCLC ifølge en studie ved Malusecka et al. [20]. Immunhistokjemisk farging viste at HSP27 uttrykk i lungekreft vevet ikke er korrelert med T (primærtumor) N (lymfeknuter) M (metastase) og stadier [21].
Utdrag fra bladene av
Ginkgo biloba
har vært brukt i Kina og vestlige land i århundrer på grunn av sin antioksidantegenskaper [22]. En standard
G. biloba
ekstrakt, EGb761 (kommersielt navn), inneholder 22% -27% flavonoider og 5% -7% terpenoids, som er de viktigste virkestoffene [23]. EGb761 kan skattekart frie radikaler og nøytralisere ferge ion-indusert peroxidants [24]. Derfor er nyttig for forebygging og behandling av degenerative prosesser i forbindelse med oksidativt stress EGb761 [25] – [26]
Selv om kjemoterapi er fremdeles den primære behandling som brukes for lungekreft, er skadelige bivirkninger relatert til dette. behandling begrense bruken. Komplementære medisiner som urtemedisin har blitt mer populært de siste tiårene. Dessuten har flere eksperimenter rapportert at EGb761 har antitumor effekt. De anticancer egenskaper EGb761 er tilskrevet sin antioksidant, antiangiogen og gen-regulerende effekt [24]. EGb761 kan hemme tumor spredning via apoptose i tykktarmskreft [27] og munnhule kreft [28]. Fase II kombinert behandling som involverer 5-fluorouracil (5-FU) og EGb761 har blitt testet på pasienter med bukspyttkjertel eller tykktarmskreft [29] – [30] og har vist lovende resultater. I denne studien undersøkte vi HSP27 ekspresjon hos pasienter med NSCLC og analyseres forholdet mellom HSP27 ekspresjon og kliniske resultater. I tillegg ble effekten av EGb761 for HSP27 uttrykk utforsket. Vi håper at resultatene av denne studien vil gi klinikere med en ny kombinasjon av legemiddelregimer og tjene som en prediktor for å forbedre NSCLC prognose.
Resultater
Demografiske data og HSP27 uttrykk hos pasienter med NSCLC
i alt 64 pasienter med NSCLC ble inkludert i denne studien. Av disse ble 47 (73%) histologisk identifisert som å ha adenokarsinom og 17 (27%) pasienter ble identifisert som å ha plateepitelkarsinom. Gjennomsnittsalderen for pasientene var 61,2 ± 9,5 år (variasjon 36-78 år). TNM staging og HSP27 uttrykk status i NSCLC pasienter er oppsummert i tabell 1. Den gjennomsnittlige HSP27 uttrykk ratio var 2,05 ± 1,95. Pasienter med NSCLC med spredning og avansert stadium (stadium IIIb-IV) kreft hadde høyere HSP27 uttrykk forhold enn de uten metastase og tidlig stadium kreft (p = 0,03 og p = 0,009, henholdsvis). Kaplan-Meier-overlevelseskurve viste NSCLC med en lav HSP27 uttrykk forholdet hadde signifikant bedre overlevelse tid enn de som har en høy ekspresjon forholdet (p 0,05, Fig. 1). De multivariate Justert risikoforhold ble beregnet ved hjelp av Cox regresjon med flere variabler av kjønn (mannlige kontra kvinnelige), alder (år), metastaser, svulst og spredning til lymfeknuter (tabell 2). Ved å gjøre dette, fant vi at pasienter med høy HSP27 uttrykk hadde 2,30 ganger høyere dødsrisiko (p = 0,04) enn pasienter med lav HSP27 uttrykk.
HSP27 uttrykk i pasienter med NSCLC
HSP27 ekspresjon hos pasienter med NSCLC ble analysert (fig. 2). Immunhistokjemisk farging og Western blot analyse av lungekreft vevet viste høyere HSP27 ekspresjon i lungekreft vev enn i den normale lungevevet (fig. 2A-B).
(A) Lunge prøver (lungekreft og tilsvarende normal tilstøtende lungevev) ble analysert med antistoff mot varmesjokkprotein 27 (HSP27) i immunhistokjemisk farging (DAB farging og hematoxylin kontra). For negative kontroller ble antistoffet erstattet med kontroll IgG. HSP 27 ble overuttrykt i NSCLC vev enn normalt lungevev. (B) Western blotting-analyse av HSP 27 ekspresjon i NSCLC vev og normalt vev. Representative data fra fire forskjellige pasienter med NSCLC er vist (T = tumor; N = normal). Ekspresjonen av HSP27-protein-ekspresjon ble betydelig økt i NSCLC vev sammenlignet med normalt lungevev (* p 0,05).
Effekt av EGb761 på cytotoksisitet og HSP27 ekspresjon i BEAS-2B og NSCLC cellelinjer (A549 og H441)
Vi har behandlet 3 cellelinjer (BEAS-2B, A549, og H441) med ulike konsentrasjoner av EGb761. MTT-analysen viste at EGb761 ikke har cytotoksisk effekt på disse 3 cellelinjer selv ved høyere konsentrasjoner (fig. 3A). DNA-fragmentering analysen viste også at EGb761 induserte ikke apoptose i BEAS-2B, A549, og H441 cellelinjer ved forskjellige konsentrasjoner (Fig. 3B). HSP27 ekspresjon i A549 og H441 cellelinjene signifikant redusert på en doseavhengig måte med en økning i EGb761 konsentrasjon, bestemt ved western blot-analyse (Fig. 3C). Imidlertid har HSP27-ekspresjon i normale bronkiale epitelceller (BEAS-2B) ikke endres når EGb761 konsentrasjonen var under 500 ug /ml.
(A) EGb761 har ikke innlysende cytotoksisk virkning på lungecancer cellelinjer ( A549 og H441) og normale bronkiale epitelceller (BEAS-2B). (B) DNA fragment analyse viste EGb761 fremkalte ikke BEAS-2B, A549 og H441 celle apoptose. (C) Den HSP27 mRNA /protein uttrykk for BEAS-2B celler ikke endres vesentlig når konsentrasjonene av EGb761 var under 500 [0-9] [A-z] ug /ml. I tillegg kan HSP27 mRNA /protein-ekspresjon av A549 /H441-celler være sunket betraktelig med økende konsentrasjon EGb761 på en doseavhengig måte. Representative bilder av tre uavhengige forsøk. *
P
0,05 versus kontroll. Analysene ble utført i tre eksemplarer.
Effekt av EGb761 og HSP27-siRNA transfeksjon på HSP27 uttrykk
Vi transfektert den A549 /H441 celler med HSP27-siRNA plasmid. Den HSP27-siRNA plasmid transfeksjon betydelig redusert HSP27 uttrykk i A549 /H441-celler, som ble bekreftet ved hjelp av real-time PCR og Western blotting (fig. 4A-B). EGb761 også hadde samme effekt som HSP27-siRNA transfeksjon i betydelig redusere HSP27 mRNA og protein uttrykk i A549 /H441 (Fig. 4A-B). Selv om både HSP27-siRNA og EGb761 behandling kan nedregulere HSP27 uttrykk, betyr det ikke at det er en effektor forholdet mellom dem. Ytterligere studier er nødvendig for ytterligere å undersøke dette forholdet.
(A) HSP27 mRNA ekspresjon av A549 /H441-celler ble redusert med EGb761 behandling eller HSP27-siRNA transfeksjon 24 timer senere sammenlignet med kontrollgruppen. (B) Den HSP27-proteinet ekspresjon av A549 /H441-celler ble også redusert med EGb761 behandling og HSP27-siRNA transfeksjon 24 timer senere sammenlignet med kontrollgruppen. *
P
0,05 versus kontroll. Analyser ble utført i tre eksemplarer. NC-siRNA er den negative kontrollen.
Effekter av EGb761 og HSP27-siRNA transfeksjon på trekk evne til A549 /H441
A549 /H441-celler ble brukt for å evaluere effekten av HSP27 på NSCLC celle trekkfugl evne
in vitro
. Cellulær migrering ble analysert ved hjelp av sår bunnen av analysen. Sammenlignet med den vandrende evne til kontrollgruppen, ble den vandrende aktiviteten av A549 /H441-celler inhiberte signifikant etter HSP27-siRNA transfeksjon eller EGb761 behandling. (P 0,05) (figur 5A-B.)
(A) Cellular migrering ble bestemt av enkeltlag denudasjon analysen og analysert av Wimasis WimScratch programvare. Den vandrende evne til A549 /H441-celler ble inhibert med EGb761 (100 ug /ml) behandling sammenlignet med kontrollgruppen. Dempe den HSP27 uttrykk av HSP27-siRNA transfeksjon, den vandrende evne også gått ned i A549 /H441. NC-siRNA er den negative kontroll. Representative bilder av tre uavhengige forsøk. Dataene er hentet fra tre uavhengige forsøk. *
P
0,05 versus kontroll. Analysene ble utført i tre eksemplarer.
Den regulerende effekt av EGb761 på HSP27 uttrykk gjennom AKT og p38 MAPK veien
De intracellulære signalveier som MAPKs og PI3K /AKT er viktige determinanter av kreft migrasjon [31] – [33]. Men de intracellulære regulatoriske signalveier mellom EGb761 og HSP27 uttrykk er fortsatt uklart. Vi analyserte ekspresjonen av forskjellige spredningsveier proteiner etter behandling av A549 /H441-celler med forskjellige konsentrasjoner EGb761. Ekspresjonen av p-AKT og p-P38 ble signifikant økt etter EGb761 behandling sammenlignet med kontrollgruppen, og ekspresjon av PI3K, ERK, og JNK endret seg ikke etter EGb761 behandling (fig. 6A, D) Vi behandlet den A549 ytterligere /H441-cellelinjen med AKT-inhibitor (API-59, 3 mM) og p38 MAPK-inhibitor (SB203580, 10 mM). Den inhiberende virkning av EGb761 på HSP27-ekspresjon ble blokkert av AKT eller p38 MAPK-inhibitor (fig. 6B, E). Videre migrering evne til A549 /H441-celler også gjenvinnes etter AKT eller p38 inhibitor behandling, selv i nærvær av EGb761 (fig. 6C, F). Disse resultatene antydet at EGb761 regulert HSP27 uttrykk, mest sannsynlig gjennom AKT og p38 MAPK signalveier.
(A, D) Uttrykkene av AKT /Pakt, P38 /pP38, PI3K /pPI3K, ERK /Perk, JNK /pJNK av A549 /H441 ble analysert ved western blotting etter behandling med EGb761 (100 ug /ml). Uttrykket av Pakt og p-p38 ble forsterket av EGb761 behandling signifikant (p 0,05) (B, E). A549 /H441-celler linje ble behandlet med inhibitorer av AKT (API-59) (3 mM), ble p38 MAPK (SB203580) (10 mM) i 1 time og EGb761 (100 ug /ml) ble behandlet senere. Den AKT-inhibitor eller p38-inhibitor kan blokkere den inhiberende virkning av EGb761 i HSP27 proteinekspresjon. (C, F) Cellular migrering ble bestemt ved monolag denudasjon analyse og analysert ved hjelp av den Wimasis WimScratch programvare. Med AKT-hemmer eller p38 inhibitor, ble den cellulære vandrende evne til A549 /H441 ikke svekket ved EGb761. Representative bilder av tre uavhengige forsøk. Dataene er hentet fra tre uavhengige forsøk. *
P
0,05 versus kontroll. Analysene ble utført i tre eksemplarer.
Diskusjoner
HSP er allestedsnærværende molekylære anstand stede i alle levende celler. De beskytter cellene mot miljømessig stress skader [34]. Den lille HSP27 spiller en rolle i signaloverføring, vekstregulering, utvikling, differensiering og tumorigenesis [35]. Økende nivåer av HSP27 har blitt observert i flere maligniteter som brystkreft [36], tykktarmskreft [37], prostata kreft [16], og lungekreft [10], [21]. I vår studie har vi undersøkt uttrykk for HSP, inkludert HSP10, HSP27, HSP30, hsp60, HSP70 og HSP90 hos NSCLC vevsprøver (data ikke vist). Bare HSP27 ble funnet å være overuttrykt i NSCLC vev. Koordinerende med pasient kliniske parametre, synes overekspresjon av HSP27 å øke metastatisk potensial av NSCLC og er et dårlig prognostisk prediktor. Blokkering HSP27 uttrykk ved EGb761 redusert den vandrende evne NSCLC cellelinjer.
HSP27 har fått mye oppmerksomhet de siste tiårene på grunn av sin rolle i tumorkreftutvikling, prognostiske, prediktive og behandling implikasjoner [4]. I spiserørskreft, reduserer HSP27 uttrykk under kreft til adenokarsinomer, men øker i kreft til plateepitel karsinom [38]. HSP27 ekspresjon er korrelert med graden av differensiering i huden [39], [40] endometriale, og livmor kreft [41]. HSP27 overekspresjon induserer også chemoresistance i prostata kreft [42] og spiserørskreft [43], men forbedret respons på behandlingen i hode og nakke kreft [44]. I sammendraget, er rollen til HSP27 variabel og er avhengig av ulike krefttyper.
I vår studie, HSP27 var en dårlig prognostisk indikator hos pasienter med NSCLC etter justering for andre faktorer. Økt ekspresjon forholdet av HSP27 ble observert hos pasienter med NSCLC med fremskreden kreft, som var lik den som er rapportert i en studie av Zimmermann et al. [18]. Serum HSP27-nivå er en nyttig biomarkør for å diskriminere friske røykere og pasienter med kreft med tidlig og avansert stadium NSCLC [18]. Men en rapport fra Malusecka et al. viste at HSP27 ekspresjonen kan være en gunstig prognostisk faktor i NSCLC [20]. Subgruppeanalyse viste at HSP27 beholdt sin prognostisk betydning i plateepitelkarsinom, men ikke i adenokarsinom. To tredjedeler av pasientene hadde plateepitelkarsinom i Malusecka studien, men prosentandelen av plateepitelkarsinom var bare 27% i vår studie. Vår subgruppeanalyse viste ingen prognostisk forskjell mellom pasienter med adenokarsinom og plateepitelkarsinom. Små utvalgsstørrelser og heterogenitet er våre begrensninger. Videre den vandrende evne til A549 og H441
in vitro
ble betydelig redusert etter stanse HSP27 uttrykk, som var i tråd med vår klinisk observasjon at HSP27 uttrykk kan øke metastatisk potensial. Selv om HSP27 hadde blitt identifisert som en metastase-assosierte protein i NSCLC [45] – [46], s assosiasjon mellom HSP27 og den metastatiske mekanisme krever videre undersøkelser
Kjemoterapi medikamenter vanligvis påvirke både patologisk tumorceller og normale. celler og forårsake alvorlige komplikasjoner og toksisitet. Cisplatin, en effektiv cytostatikum, er hovedelementet i lungekreft kjemoterapi. Sensorinevralt hørselstap og nefrotoksisitet er de viktigste negative effektene av cisplatin, som kan innebære overdreven dannelse av frie radikaler [24]. Gjennom scavenging og forhindrer dannelsen av frie radikaler, kan EGb761 indusere beskyttende virkning mot cisplatin-indusert toksisitet. I et forsøk på rotter, EGb761 hell redusert cisplatin-assosiert toksisitet uten demping av sin antitumor aktivitet [47]. Manglende respons eller overlevelse av kreft stamceller etter behandling kan være ansvarlig for tilbakefall og motstand av lungekreft til moderne terapi [48]. HSP27-aktivering har blitt observert i kjemoresistent lungekreft stamcelle-lignende celler [10]. Vår studie viste at EGb761 hemmet HSP27 uttrykk i NSCLC celler. Derfor kan EGb761 ha et stort potensiale i lungecancerterapi på grunn av sin hemmende virkning på HSP27 uttrykk.
Cellular varmesjokkrespons vanligvis utvikler seg raskt, noe som er relatert til aktivering av større signaloverføringsveier som involverer mitogen-aktivert protein (MAP) kinaser, ekstracellulære signalregulerte kinaser (ERK), c-Jun N-terminal kinase (JNK), og p38 [49]. Disse signal kaskader spille en sentral rolle i å regulere og bestemme celle skjebne som vekst, differensiering eller apoptose i en rekke fysiologiske så vel som stress forhold [50]. AKT /PI3K-avhengig signaloverføringsreaksjonsveier er celleoverlevelsessignaler stimulert av vekstfaktorer, cytokiner, og oncoproteiner. Overaktiv AKT /PI3K veien kan redusere tumor celle apoptose og øke spredning [51]. Imidlertid er det regulatoriske forhold mellom HSP27, PI3K /AKT, og MAP kinase pathways kompleks. For eksempel vil p38MAPK-MAPKAPK2-HSP27 veien aktiveres av kjemoterapi agenten ciplastin pluss gemcitabin i lungekreft stamceller [10]. I motsetning til dette, HSP27 induserer cisplatin motstand ved å trykke p38-aktivering og øke AKT aktivering i lungekreftceller [52]. Denne forskjellen kan skyldes forskjellige celletyper og studiedesign. Guo et al. viste at en tidlig, forbigående aktivering av JNK og p38 MAPK (eller begge) er vanligvis forbundet med celleoverlevelse eller differensiering, mens et forsinket, vedvarende aktivering av disse kinaser er vanligvis forbundet med apoptose [53]. I kolorektal kreft, er HSP27 overekspresjon KRAS mutasjon avhengig [54], men både A549 og H441 er KRAS mutasjon cellelinjer. Forholdet mellom KRAS mutasjon og HSP27 uttrykk i lungekreft trenger videre etterforskning. I vår rapport, EGb761 dempes HSP27 uttrykk i A549 /H441 cellelinjer ved å aktivere p38 MAPK og AKT trasé, men ikke ERK eller JNK veien. På grunn av kombinasjonen av AKT og p38 inhibitor behandling kan redusere cellulær levedyktighet, kan de synergistiske effekten av kombinasjonsbehandlingen på ekspresjon av HSP27 behov for videre analyse. Dessuten, fordi aktiverings (fosforylering) status er ustabil og defosforylering inntraff hurtig under fysiologiske betingelser, er det vanskelig å observere den virkelige resultater fra AKT og p38-aktivering
in vivo
i den lave HSP27 uttrykket pasientgruppen.
i konklusjonen, er HSP27 en dårlig prognostisk faktor på NSCLC, og EGb761 har stort potensial til å bli brukt som et supplement terapi for behandling av NSCLC grunn av sin hemmende effekt på HSP27 uttrykk.
Materialer og metoder
Tumor prøvetaking
NSCLC og tilsvarende normale vev ble samlet fra 64 pasienter som gjennomgikk kirurgisk reseksjon ved Divisjon for Thoracic Surgery, kirurgisk avdeling, Kaohsiung Medical University Hospital, 2004-2010 . Vevsprøver ble umiddelbart plassert i flytende nitrogen for forsendelse til laboratoriet, og deretter lagret i -80 ° C fryseboks til RNA isolering og utvinning protein ble utført. Komplett staging prosedyrer, inkludert bryst radiografi, bronkoskopi, hjerne og thorax computertomografi, sonography, og bein scintigrafi ble utført for å bestemme nøyaktig karakteristikk av TNM hos pasienter med NSCLC i henhold til TNM International Staging System for Lungekreft [55]. Alle pasientene ble fulgt opp fram til mars 2011, og detaljer om deres demografiske og overlevelsesdata ble oppdatert.
Etikk uttalelse
Studiet ble godkjent av Ethical Review Board for forskning (KMUH-IRB 990 358) av Kaohsiung Medical University Hospital, Kaohsiung, Taiwan. Deltakerne gi sine skriftlig informert samtykke til å delta i denne studien.
RNA ekstraksjon og real-time polymerase chain reaction (PCR)
Total RNA ble isolert fra frosne lunge svulst vev av pasienter med NSCLC og tilsvarende normale tilstøtende lunge vev. RNA fra normalt lungevev, lungetumorvevet, og lungekreftceller ble analysert ved hjelp av sanntids-PCR. Total RNA ble isolert ved hjelp av en RNeasy Mini kit og en RNase-fritt DNase Set (Qiagen, Valencia, CA, USA). Total RNA (2 mikrogram) ble revers-transkribert ved hjelp av Super ™ og First-Strand Synthesis System for RT-PCR Kit (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). En 1:05 fortynning av den resulterende cDNA ble anvendt som standard, og en 01:10 mal fortynning av den resulterende cDNA ble brukt som standard for å kvantifisere den relative innhold av mRNA ved hjelp av sanntids-PCR (LightCycler Faststart DNA Master SYBR grønn I, Roche, Mannheim, Tyskland). Følgende primere for real-time PCR ble utformet med Primer Express-programvaren (RealQuant, Roche, Mannheim, Tyskland) ved hjelp av publiserte sekvenser: human HSP27 (GenBank: tiltredelse Nummer: AB020027.1) forstand primer: 5′-GTC CCA CGA GAT CAC CAT-3 «, human HSP27 antisense-primer: 5′-GGT GGT TGC TTT GAA CTT TAT T-3′, human GAPDH forstand primer: 5»-AGC CAC ATC GCT CAG ACA-3 «, og GAPDH antisense primer: 5»-GCC CAA TAC GAC CAA ATC C-3 «. Fluorescens data ble kjøpt i slutten av utvidelsen. Smelte-analyse ble utført for alle produkter for å bestemme spesifisiteten til forsterkning. I tillegg ble PCR-produktene elektroforese på 1% agarosegeler for å bekrefte hvorvidt de korrekte båndstørrelsene var til stede. Relativ ekspresjon ble beregnet som et forhold av uttrykket i tumoren sammenlignet med ekspresjon i normalt tilstøtende vev (høy ekspresjon: tumorlesjon /normalt vev 1; lav ekspresjon: tumorlesjon /normalt vev 1) [56] – [57]
Immunhistokjemisk farging
vevsprøver ble dissekert fra humant lungevev, fiksert i 4% bufret formalin løsning over natten, i parafin, og delt i 5-mikrometer tykkelse.. De parafinsnitt ble deparaffinized med xylen og farget med antihuman-HSP27 (Santa Cruz, Dallas, TX, USA) antistoff. Etter PBS-vasking ble seksjonene inkubert med pepperrot-peroksidase-konjugert sekundært antistoff i 1 time ved romtemperatur. For fargereaksjoner, ble diaminobenzidine (DAB) brukt og teller farget med hematoksylin. For negative kontroller ble antistoffet erstattet med kontroll IgG.
Western blot-analyse
Celler ble lysert med lysebuffer [0,5 M NaCl, 50 mM Tris, 1 mM EDTA, 0,05% SDS, 0,5% Triton X-100, 1 mM fenylmetylsulfonylfluorid (PMSF), pH 7,4] i 30 minutter ved 4 ° C, og cellelysatene ble sentrifugert ved 4000
g
i 30 minutter ved 4 ° C. Proteinkonsentrasjoner i supernatantene ble målt ved anvendelse av en BioRad proteinbestemmelse kit (BioRad, Hercules, CA, USA). Supernatantene ble utsatt for 12% SDS-PAGE og deretter overført til polyvinylidendifluorid (PVDF) membraner (NEN) i 1 time ved romtemperatur. Membranene ble deretter behandlet med PBS inneholdende 0,05% Tween 20 og 2% skummet melk i 1 time ved romtemperatur og inkubert separat med mus anti-humant HSP27, AKT /pakt, P38 /pP38, PI3K /pPI3K, ERK /Perk, JNK /pJNK eller α-tubulin (Abcam, Cambridge, MA, USA) i 1 time ved romtemperatur som intern kontroll. Etter vasking ble membranene inkubert i med pepperrot peroksidase-konjugert kanin antigoat eller muse-IgG ved romtemperatur. Immundeteksjon ble utført ved hjelp chemiluminescence reagent pluss NEN og eksponering for Biomaks MR Film (Kodak, Rochester, NY, USA).
Culture of NSCLC celler
Lung adenokarsinom A549 /H441-celler (ATCC CCL- 185 /ATCC HTB-174) ble dyrket i kolber i F12K vekstmedium supplementert med 5% føtalt bovint serum (FBS), 100 enheter /ml penicillin og 100 pg /ml streptomycin. Cellene ble dyrket ved 37 ° C i en fuktig atmosfære med 95% luft og 5% CO
2. BEAS-2B-celler (ATCC CRL- 9609), som er normale bronkiale epitelceller, ble anvendt som kontroll.
HSP27 stanse i A549 /H441-celler
Små interfererende RNA (siRNA), en spesifikk dobbeltkjedet 21-nukleotid RNA-sekvens som er homolog til den mål-genet, ble brukt til å avstille HSP27 uttrykk. Menneskelig HSP27 siRNA følelse primer: 5′-GCG Ugu CCC UGG august UCA ATT-3 «og antisense primer: 5′-UUG ACA UCC AGG GAC ACG CGC-3». SiRNA for HSP27 og negativ kontroll (NC-siRNA) ble designet og syntetisert ved hjelp av et dataprogram fra Ambion (Austin, Texas, USA) og Silencer ™ siRNA byggesett fra Ambion, i henhold til produsentens instruksjoner. Hemming av HSP27 mRNA og protein uttrykk ble vurdert ved hjelp real-time PCR og immunoblot analyse etter transfeksjon av A549 /H441 med HSP27-siRNA. I korthet ble cellene dyrket i 6 brønner og transient transfektert med 20 nM siRNA ved anvendelse av 8 mL SIPORT Amine (Ambion, Austin, TX, USA) i en total transfeksjon volum på 0,5 ml av medium. Etter inkubering ved 37 ° C, 5% CO
2 i 5 timer, 1,5 ml av den normale vekstmedium ble tilsatt, og cellene ble inkubert i 48 timer.
MTT-assay for celle-levedyktighet
3- (4,5-dimetyltiazol-2-yl) -2,5-difenyltetrazoliumbromid (MTT, Sigma, Louis, MO, USA) assay ble brukt for å måle cellelevedyktighet [58]. Prinsippet for denne analyse er at mitokondrie-dehydrogenase i levende celler reduserer MTT til en blå formazan. I korthet ble cellene dyrket i 96-brønners plater og inkubert med forskjellige konsentrasjoner av EGb761. Etter vasking av cellene to ganger med PBS, 100 ul av medium inneholdende MTT (0,5 mg /ml) ble tilsatt til hver brønn, og cellene ble inkubert ved 37 ° C i ytterligere 4 timer. Mediet ble deretter omhyggelig fjernet for derved å ikke forstyrre formazankrystaller dannet. Neste 100 ul DMSO, noe som oppløseliggjør de formazankrystaller, ble tilsatt til hver brønn, og absorbansen av det oppløste blå formazan ble avlest ved 540 nm ved anvendelse av en mikroplateleser (Multiskan Ex, ThermoLabsystems), med DMSO som blindprøven. Reduksjonen i optisk densitet av medikamentene ble benyttet som måling av cellenes levedyktighet, normalisert til celler inkubert i kontrollmedium, noe som ble ansett som 100% levedyktighet.
Kvantifisering av DNA-fragmentering
Cellular DNA fragmentering ELISA-analyser ble utført ved anvendelse av et kit i henhold til produsentens protokoll (Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Tyskland). Celler ble inkubert i 12 timer ved 37 ° C med en ikke-radioaktivt tymidin analog 5-brom-2-deoksyuridin (BrdU), som kan innarbeides i genomisk DNA. Deretter ble cellene inkubert med eller uten EGb761 i 6 timer. Cellene ble deretter lysert, overført til en mikrotiterplate belagt med en anti-DNA-antistoff, og inkubert i 90 minutter ved romtemperatur. Platen ble vasket 3 ganger, og oppvarmet i 5 minutter i en mikrobølgeovn. Anti-BrdU-peroksidase-konjugat ble tilsatt til hver brønn, og platen ble inkubert i 90 minutter ved romtemperatur. Etter at platen var vasket 3 ganger, ble substratløsning tilsatt, og platen ble inkubert i mørke på en inntil farvefremkall var tilstrekkelig. Reaksjonen ble deretter stoppet ved tilsetning av 25 ul 0,56 M H
2SO
4. En mikroplateleser (BioRad, Hercules, CA, USA) ble brukt til å måle absorbans ved 450 og 655 nm for hver brønn.
In vitro
migrasjonsanalyser
Den vandrende evnen til celler ble analysert i et monolag denudasjon assay som tidligere beskrevet [59]. Den konfluente celler ble såret ved å skrape med en 100-mL pipette tips, som ribbet en stripe av monolaget som var 300 mikrometer i diameter. Kulturene ble vasket to ganger med PBS; deretter et medium supplert med 5% FBS ble tilsatt, og hastigheten for sårheling ble observert etter 24 timer. Cellene som migrerte inn i ribbet området ble fotografert, og de områder ble analysert ved anvendelse av Wimasis WimScratch programvare. Wimasis WimScratch er en ny generasjon web-basert image verktøy for celle migrasjon analyse. Edge deteksjonsteknikker kan lett gjenkjenne forkanten og gapet området. Brukere kan laste opp bildene og analysen vil starte automatisk.
EGb761 og sti hemmere
AKT og p38 MAPK hemmere, API-59 (Santa Cruz, Dallas, TX, USA) og SB203580 ( Selleckchem, Radnor, PA, USA), henholdsvis, ble brukt i vår studie. De EGb761 brukt i vår studie ble forfulgt fra Dr. Willmar Schwabe GmbH Co, Karlsruhe, (Tyskland).
Statistiske analyser
statistiske forskjeller i HSP27 uttrykk forhold og kliniske parametere ble testet ved hjelp av studentens
t
-test eller enveis analyse av varians (ANOVA) test. Overlevelseskurver ble trukket ved hjelp av Kaplan-Meier metoden. Resultatene er uttrykt som gjennomsnitt ± SEM.
