Abstract
Bakgrunn
Nyere data har antydet at det kan være en feilregulering av endocannabinoid stoffskifte i kreft. Her har vi undersøkt uttrykk for endocannabinoid enzymet fettsyre (FAAH) i en godt karakterisert vev microarray fra pasienter diagnostisert med prostatakreft ved transurethral reseksjon for ugyldig problemer.
metodikk /hovedfunnene
FAAH immunoreaktivitets (FAAH-IR) ble vurdert i formalinfiksert parafin-embedded ikke-maligne og tumorkjerner fra 412 pasienter med prostatakreft. CB
1 reseptoren immunoreaktivitets (CB
1IR) score var tilgjengelig for dette datasettet. FAAH-IR ble observert i epitelceller og blodårevegger, men ikke i stroma. Tumor epitel FAAH-IR var positivt korrelert med sykdommens alvorlighetsgrad ved diagnose (Gleason score, tumor stadium,% av prøven som inneholdt tumor) for tilfeller med mellomtoner CB
1IR score, men ikke for de med høy CB
1IR score. For de 281 tilfellene som bare mottok palliativ terapi ved ende stadier av sykdommen, ble en høy tumor epitelial FAAH-IR assosiert med en dårlig sykdomsspesifikk overlevelse. Multivariat Cox proporsjonal farer regresjonsanalyser viste at FAAH-IR ga ytterligere prognostisk informasjon til det som tilbys av CB
1IR når en mellomtone, men ikke en høy CB
grenseverdi 1IR ble brukt. Interleukin-4 (IL-4) reseptoren IR ble funnet på kreft epitelceller og inkubasjon av prostatakreft PC-3 og R3327 AT1 celler med IL-4 økt sin FAAH aktivitet.
Konklusjon /Betydning
Tumor epitel FAAH-IR er assosiert med prostatakreft alvorlighetsgrad og utfall på mid-range, men ikke høy, CB
1IR score. Korrelasjonen med CB
1IR i svulstvev kan være relatert til en felles lokal feilregulering av en komponent av svulsten mikromiljøet
Citation. Thors L, Bergh A, Persson E, Hammarsten P, Stattin P , Egevad L, et al. (2010) fettsyreamid hydrolase i Prostate Cancer: Association med sykdommens alvorlighetsgrad og utfall, CB
1 Receptor Expression og forskrift av IL-4. PLoS ONE 5 (8): e12275. doi: 10,1371 /journal.pone.0012275
Redaktør: Joseph Alan Bauer, Bauer Research Foundation, United States of America
mottatt: 26 april 2010; Godkjent: 27 juli 2010; Publisert: 19 august 2010
Copyright: © 2010 Thors et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Forfatterne takker den svenske Science Council (Grant ingen 12158, medisin, CJ Fowler.); den svenske Cancer Society (Grant ingen CAN 2007/712, Anders Bergh.); Lions Cancer Research Fund ved Umeå Universitet /Cancer Research Fund Norrland og forskningsmidlene av Det medisinske fakultet, Universitetet i Umeå (C.J. Fowler) for økonomisk støtte. Den finansieringskilde for antistoff (Dr. Mackie) var innvilge NIH DA11322. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Prostatakreft er den vanligste kreftformen hos menn. Ifølge US National Cancer Institute (https://www.cancer.gov/cancertopics/types/prostate), antall nye tilfeller av prostatakreft i USA i 2009 var 192 280, og antall dødsfall som følge av sykdom var 27 360. Behandlingsalternativene spenner fra forventning til prostatektomi, hormonbehandling og stråling avhengig av naturen av kreft.
I de senere årene har bevis akkumulert som tyder på at det endocannabinoid system, bestående av cannabinoid CB
1 og CB
2-reseptorer, ligander deres endogene Anandamid og 2-arachidonoylglycerol, og deres syntetiske og nedbrytende enzymer, spiller en rolle i patogenesen og mulig behandling av krefttyper, inkludert prostata cancer (for nyere oversikt, se [1] – [3 ]). Således kan for eksempel, cannabinoider produsere et CB reseptormediert apoptose i gliomceller som et resultat av en vedvarende produksjon av ceramid [4] og flere artikler har rapportert både CB reseptor-avhengige og-Uavhengig virkninger av cannabinoider ved levedyktighet, og mobilitet invasivity av både androgen-sensitive og ufølsomme prostatakreft cellelinjer [5] – [11]
In vitro
, er en lokal endocannabinoid tone en viktig faktor å kontrollere malignitet av prostata kreft celler. . Således modulering av innholdet av endocannabinoids, ved anvendelse av inhibitorer av endocannabinoid syntese eller metabolisme, resulterer i en endring i invasive egenskaper av prostatakreftceller på en måte som samsvarer med en beskyttende virkning av endocannabinoids [8], [12]. Endocannabinoid Anandamid metaboliseres av enzymet fettsyre (FAAH) og overekspresjon av enzymet i PC-3-cellene resulterer i en fenotype med en øket invasiv oppførsel
in vitro product: [12]. Disse forfattere konkluderte med at «inhibering av FAAH-aktivitet ved spesifikke inhibitorer kan være en terapeutisk mål for behandling av prostata cancer» [12]. FAAH hemmere, som ikke produserer den slags sentrale atferdsmessige effekter forbundet med cannabinoider som Δ
9-tetrahydrocannabinol [13], er for tiden i utvikling av legemidler, først og fremst med smerter som et terapeutisk mål, og den ledende forbindelsen er i fase II i sin utvikling.
Mindre er kjent om endocannabinoid systemet i prostata svulstvev, men i en studie med et stort antall pasienter med en lang oppfølging, vi nylig rapportert at uttrykket av CB
1-reseptorer i tumorvevet erholdt ved diagnose var assosiert med sykdommens alvorlighetsgrad og utfall [14]. Dermed personer med en CB
1 reseptoren immunoreaktivitets (CB
1IR) over eller lik medianen poengsum for datasettet hadde en høyere forekomst av metastaser ved diagnose, og en høyere andel av tilfellene med høy Gleason score (en indikator på sykdommens alvorlighetsgrad, basert på morfologi av de to mest vanlige tumortyper i prøven [15]) enn de personer med et CB
1IR under medianen for datasettet. Videre, for de personer som hadde blitt fulgt av forventet inntil opptreden av metastaser, ble en høy CB
1IR poengsum assosiert med en lavere sykdomsspesifikk overlevelse [14]. Med hensyn til FAAH, har det blitt rapportert at i et kommersielt tilgjengelig vev microarray, kjerner fra prostata kreftvev hadde en høyere ekspresjon av enzymet enn sett i normalt vev [12]. Imidlertid ble ingen data om forholdet mellom FAAH immunoreaktivitets (FAAH-IR) og sykdom resultatet presenteres. I tillegg ble det mulige årsakene til den høye grad av FAAH-IR i tumorvevet ikke er undersøkt av disse forfatterne. Følgelig i denne studien har vi undersøkt FAAH-IR i vevet microarray brukt tidligere av oss å karakter CB
1IR i svulstvev [14], og foretatt undersøkelser ved hjelp av dyrkede celler for å se om en kjent komponent av svulsten mikromiljøet kan påvirke FAAH aktivitet. Videre har vi undersøkt om FAAH-IR er korrelert med andre patogenetiske og prognostiske variabler, for eksempel den lokale tumor stadium nummer og immunoreactive score for fosforylert epidermal vekstfaktor reseptor (pEGFR).
Metoder
Etikk erklæringen
den forskningsetiske komité ved Umeå universitet sykehus (Regional etisk Review Board i Umeå, Sverige) som er godkjent av studien og fravikes behovet for informert samtykke.
Pasienter
de formalinfikserte, parafininnstøpte prøvene som brukes i denne studien var samlet på Central Hospital, Västerås, Sverige, mellom 1975 og 1991 fra totalt 412 pasienter diagnostisert med prostatakreft ved transurethral reseksjon for vannlating problemer [16 ]. Tilstedeværelsen av metastaser ble bestemt ved anvendelse av en beinskanning kort tid etter transuretral reseksjon. Pasientene ble fulgt frem til 2003. For de 388 tilfellene hvor svulsten FAAH-IR kan scores (se nedenfor), 281 ble etterfulgt av vaktsom venter til utseendet metastaser (standard behandling tilnærming på den tiden). De andre pasientene fikk hormonbehandling, strålebehandling eller radikal prostatektomi. Gleason score og andelen av prøven som inneholdt tumor ble vurdert i hver prøve. Dødsårsak ble vurdert ved evaluering av medisinske poster. Microarray (kjerner med en diameter på 0,6 mm) ble konstruert ved hjelp av en Beecher Instrument (Sun Prairie, WI, USA). Hver vev microarray lysbilde (56 totalt, vanligvis med kjerner fra 8 tilfeller per lysbilde) inneholdt opp til åtte (vanligvis fem) prøver av svulstvev (både primære og sekundære Gleason grad områder ble inkludert) og opptil fire (vanligvis fire) prøver av ikke-ondartet vev fra hver pasient [16].
Immunohistochemistry
Snittene ble deparaffinized, rehydrert og plassert i citratbuffer pH 6,0. Etter koking i en trykkoker i 60 minutter, ble prøvene plassert i vann og deretter i Ventana buffer, hvoretter de ble anbrakt i en Ventana automatisert analysator (Ventana Medical Systems Inc, Tucson, AZ) som FAAH antistoff (fortynning 1 /2000) og det sekundære systemet (iView DAB Detection Kit, Ventana Medical Systems Inc.) ble tilsatt. Det anvendte antistoff, et kanin anti-FAAH reist mot de siste 102 aminosyrene av rotte FAAH, er blitt karakterisert i detalj [17] og ble funnet å gi den passende fargemønster (somatodendritic farging av hovedceller) i formalinfiksert vev fra human hippocampus (data ikke vist), i samsvar med rotte hippocampus [18], [19]. CB
1 reseptoren immunoreaktivitets (CB
1IR) score var tilgjengelig i databasen, og har blitt rapportert andre steder [14].
De enkelte kjerner ble scoret under mikroskop for FAAH-IR ved en etterforsker (LT) som var blind for de kliniske data for pasientene. Poengsystemet som ble benyttet var hovedsakelig den samme som den som benyttet tidligere for CB
1IR [14]. I korte trekk, for det epiteliale vev, ble kjernene kanten for immunoreaktivt intensitet (0-3, hvor 0 er fraværende og 3 er høy) og fordeling i epitelvev (0, 10, 25, 33, 50, 67 eller 100% av den totale fordelingen for hver intensitet). Fordelingen av de mest vanlige intensitet ble satt til 100 minus summen av de andre intensiteter. Den fraksjon fordelingen ved hvert intensitet ble multiplisert med den intensitet og verdiene summeres for å gi en sluttresultatet for kjernen. Således, for eksempel, ville en kjerne med intensitetene av en (10%), 2 (10%) og 3 (rest) (fordeling i parentes) mottar et sammensatt score på 1 x 0,1 + 2 x 0,1 + 3 x 0,8 = 2,7 . Når identifiserbare i kjernen, ble den basale og luminal epitelvev mottok hver for seg. Blodkarveggene ble bedømt på samme måte, men med en enklere fordeling (0, 50 og 100%). Gjennom å score, eksempler på kjerner scoret som en, to og tre var på hånden for sammenligning som en «intern standard». Kjerner hvor den struktur eller kvaliteten av vev var ikke tilstrekkelig god, eller hvor fargingen var uklar, ble ekskludert fra studien. For hvert tiltak ble medianverdier for sammensatte score for hver pasient beregnet og lagt inn i databasen ved en annen etterforsker (CF). Som et mål på påliteligheten av tumor epiteliale score, ble 67 kjerner (16 pasienter) scoret på to separate anledninger av samme etterforsker. Den Spearman korrelasjonskoeffisient for de enkelte kjerne score mellom denne pilot og hovedstudien var 0,76 (n = 67, p 0,0001, 95% konfidensintervall 0,63 til 0,85). Den intra korrelasjonskoeffisient for enkelttiltak (ICC (2,1), et mål på reproduserbarhet av scoring metoden) var 0,67 (95% konfidensintervall 0,51 til 0,78, p 0,001).
Interleukin-4 (IL-4) reseptoren immunoreaktivitet ble vurdert i formalinfiksert, parafin innleiret vevssnitt ved hjelp av et monoklonalt antistoff mot det ekstracellulære domene av den rekombinante humane IL-4-reseptor (MAB230, R Applied Biosystems, Foster city, CA, USA). For semi-kvantitativ PCR, ble prøver fra samme behandlingsgruppen samlet (n = 6).
Semi-kvantitativ PCR
mRNA nivåer for mennesker CB
1, FAAH og GAPDH ble analysert ved anvendelse av en Taq-PCR Core-kit (Qiagen, Hilden, Tyskland), en Biometra TProfessional termo (Biometra, Gottingen, Tyskland) og de følgende primere: hFAAH (197 bp), frem til 5′-TGGAAGTCCTCCAAAAGCCCAG-3 «, revers 5»- – TGTCCATAGACACAGCCCTTCAG-3 «, HCB
1 (165 bp), forover 5′- AAGGTGACATGGCATCCAAAT-3′, revers 5′-AGGACGAGAGAGACTTGTTGTAA-3 «, og hGAPDH (180 bp), forover 5′- CAACTACATGGTTTACATGTTC-3′, revers 5»- GCCAGTGGACTCCACGAC-3 «. Betingelsene for PCR var: denaturering ved 94 ° C i 2 minutter, gløding i 40 s ved 57 ° C (GAPDH) eller 60 ° C (FAAH, CB
1), etterfulgt av forlengelse ved 72 ° C i 60 s; i etterfølgende sykluser denaturering ble gjennomført ved 94 ° C i 40 sek. For FAAH og CB
1 Analysene inkluderte 35 sykluser, mens 25 sykluser ble brukt til GAPDH.
kvantitativ real-time PCR
I tillegg til semi-kvantitativ PCR på samleprøver og analyse av de enkelte prøver ble utført ved anvendelse av kvantitativ real-time PCR. Både SYBR Grønn (FAAH, CB
1, GAPDH) og TaqMan (ß-aktin) kinetikk ble brukt. For FAAH, CB
1 og GAPDH, prime beskrevet ovenfor ble brukt sammen med Power SYBR Grønn PCR Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA), mens menneske ß-aktin ble oppdaget ved hjelp av en pre-laget primer -probe mix (Hs00357333_g1, Applied Biosystems) sammen med TaqMan Universal PCR Master mix (Applied Biosystems). Amplifikasjonene ble utført på en ABI PRISM 7900 HT Sequence Detection System og programvare (Applied Biosystems), og prøvene ble analysert in triplo. Både GAPDH og ß-aktin ble benyttet som husholdningsgener, med lignende resultater (data for ß-aktin ikke vist). Den relative uttrykk for FAAH og CB
1was beregnet fra
Ct
verdier ved hjelp av standardkurven metoden.
Western Blot
For Western blotting, proteinprøver ble elektroforese på 10% SDS – polyakrylamid-geler under reduserende betingelser og fraksjonerte proteiner ble overført elektroforetisk på Immobilon-P-membran (Millipore, Bedford, MA, USA). Membranene ble blokkert over natten ved 4 ° C på en orbital-rystemaskin i 5% ikke-fett tørrmelk, 0,05% Tween-20 i PBS (PBS-T) før inkubering med primært kanin-polyklonalt antistoff mot FAAH (1:1000-1 :5000; det samme antistoff som anvendes ved immunhistokjemisk delen av studien) eller primært kanin-polyklonalt antistoff mot aktin (1:8000; Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA). Primære antistoffer ble fortynnet i PBS-T 3% (FAAH) eller PBS-T 5% (aktin) ikke-fett melkepulver. Etter inkubasjon med konjugert sekundære antistoffer (Amersham Biosciences), ble proteinene oppdaget ved hjelp av forbedret chemiluminescence detection system (Amersham Biosciences). Molekylstørrelser på proteinbånd ble bestemt ved parallell elektroforese av molekylvektmarkører (Bio-Rad Laboratories AB, Sundbyberg, Sverige). Proteinkonsentrasjoner ble bestemt ved BSA proteinanalyse kit (Pierce, Rockford, IL, USA)
Forbindelser
Anandamide (etanolamin-1-
3 H, spesifikk aktivitet. 2.2 TBqmmol
-1) ble hentet fra amerikanske Radiomerket Chemicals Inc. (St Louis, MO, USA). Umerket Anandamid og URB597 ble hentet fra Cayman Chemical Co. (Ann Arbor, Michigan, USA). Interleukin-4 ble oppnådd fra Sigma-Aldrich.
statistikker og
Med unntak av Cox proporsjonal-farer regresjon og intra korrelasjonskoeffisienten analyser, som ble utført ved bruk av SPSS programvare (SPSS Inc., Chicago, IL, USA), alle statistiske beregninger ble foretatt ved hjelp av statistikkpakke innebygd i GraphPad Prism 5 dataprogram for Macintosh (GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA). For å overleve analyser, ble en hendelse definert som dødsfall på grunn av prostatakreft og lagt inn i databasen som «event = 1». Død av andre årsaker ble sensurert, som var tilfeller der pasienten var fortsatt i live på datoen for siste oppfølging. Disse ble gruppert som «event = 0». Tilfeller (n = 3) der sykdommen utfallet var ukjent ble ekskludert fra overlevelsesanalyser. Varigheten av overlevelse er definert som tiden fra diagnose til dato for prostatakreft død, død av andre årsaker, eller hvis ingen dødsfallet fant sted, frem til dato for siste oppfølging.
Receiver drift karakteristiske (ROC) kurver ble brukt for å definere cut-offs for FAAH-IR, som deretter ble brukt til å konstruere overlevelseskurver ved hjelp av Kaplan-Meier-metoden. Forskjeller i utfall mellom gruppene ble testet med log-rank test. Cox proporsjonale-farer regresjonsanalyser ble gjennomført for å vurdere påvirkning av FAAH poengsum på resultatet på ulike CB
1IR tidsavgrensninger. Forskjeller i fordelingen av variabler mellom grupper av pasienter ble analysert ved hjelp av chi-kvadrat test.
For lesere som er ukjent med de statistiske metoder som brukes for å vurdere påvirkning av FAAH-IR ved sykdom utfallet, en kort forklaring av deres nytten er garantert, spesielt med hensyn til valg av cutoff verdier for FAAH-IR. ROC testen ble opprinnelig utviklet for å hjelpe tolkning av radarsignaler, og plotter antall sanne negative (1- falske positive brøk, kalles en – spesifisitet).
vs
sanne positive (sensitivitet) ved en gitt cutoff verdi (dvs. for saker med en score lik eller høyere enn den valgte verdien). Arealet under ROC-kurven kan da beregnes. For en test med absolutt ingen diagnostisk verdi, vil kurven være en rett linje med et område på 0,5. En perfekt test vil gi en verdi på 1,0, slik at jo lengre vekk fra 0,5 verdi, jo bedre testen. For en test med et areal under kurven betydelig større enn 0,5, er en viktig sak valg av grenseverdien, verdien valgt som et signal om at pasienten kan ha den aktuelle sykdommen. Dersom verdien cutoff er satt lavt, da følsomheten vil være høy, men det vil være et stort antall av falske positiver. Hvis verdien cutoff er satt høyt, deretter antall falske positiver vil bli lavere, men et stort antall sanne positive vil bli savnet. Valget av cutoff er således en avveining mellom å maksimere antall sanne positive funnet og minimere antall falske positiver. Valg av cutoff er avhengig av den relative betydningen av manglende sanne positive
vs.
Misdiagnosing sanne negative for den aktuelle sykdommen, men en nyttig måte å identifisere en optimal cutoff er å bestemme cutoff punktet med maksimal vertikal avstand mellom den observerte verdien og den tilsvarende verdi for en prøve uten diagnostisk verdi, beregnet som maksimal følsomhet + spesifisitet -1. Denne verdien er kalt Youden indeks, J, og vi har brukt denne verdien her for FAAH-IR (kalt J
FAAH). For nyttige vurderinger på ROC kurver og valg av optimale cutoff-verdier, se [22] – [24]
Når det gjelder de statistiske analyser av overlevelseskurver, Kaplan-Meier-metoden, hvor forskjeller i utfall mellom. grupper er testet med log-rank test, gir en nyttig (og visuelle) metode for å vurdere forskjeller i overlevelseskurver. Den Cox proporsjonal farer regresjonsanalyser fare «som en funksjon av forklaringsvariablene og ukjente regresjonskoeffisientene multiplisert med en vilkårlig og ukjent funksjon av tid» (sitat fra den opprinnelige papir av Cox [25]), dvs. vurderer bidrag av forskjellig potensielle risikofaktorer på endepunktet målt (i dette tilfellet, død på grunn av prostatakreft) uten å gjøre antakelser om den grunnleggende overlevelseskurve selv.
Resultater
Distribusjon av FAAH immunoreaktivitets i ikke- ondartede og svulstvev
FAAH-IR ble scoret i kjerner fra totalt 412 pasienter. Av disse ble rekorder for seks pasienter som ikke finnes i databasen, og så data for disse pasientene ikke ble inkludert i analysene.
Et eksempel på FAAH-IR for den ikke-ondartet vev er vist i fig. 1A. FAAH-IR ble sett i epitelcellene, og i blodårer, samt i celler (muligens lymfocytter som uttrykker FAAH [26]) infiltrering av stroma i enkelte kjerner. I alt ble 1247 kjerner fra 377 pasienter scoret for ikke-maligne epiteliale FAAH. Av disse 733 kjerner fra 307 tilfeller hadde definer basal: luminal morfologi og FAAH-IR for disse sakene ble scoret separat og brukes i analysene. I tillegg ble 993 kjerner fra 369 tilfeller scoret for FAAH-IR i blod fartøy vegger. Den kumulative fordelingen av verdiene i basal og luminale epitel-celler er vist i fig. 1B, hvor det er klart at median FAAH-IR er høyere i de basale epitelceller enn i den luminale cellene. Faktisk, av de 733 kjerner scoret, basal FAAH-IR stillingen var høyere enn tilsvarende luminal score i 724 kjerner og de to score var like i 9 kjerner. Den luminal minutter ble aldri høyere enn basal poengsum. Den blodkar FAAH-IR ble scoret litt forskjellig, så en direkte sammenligning av verdiene er ikke relevant. Det var imidlertid en signifikant korrelasjon mellom basal FAAH-IR og blodkar FAAH-IR, men ikke mellom luminal og blodkar FAAH-IR (tabell 1).
apparat A. Eksempel på FAAH-IR i en kjerne av ikke-ondartet prostatavevet erholdt ved transuretral reseksjon fra en 75 år gammel pasient. Stjernene indikerer blodårer, og # symbolet angir FAAH positive celler, antakelig infiltrerende lymfocytter. I Panel C blir FAAH-IR i en kjerne av tumorvev fra en 64 år gammel pasient er vist. Linjene øverst til høyre over kjernene viser 100 mikrometer. Panel B viser de kumulative frekvenser av FAAH-IR skår for den basale og luminal ikke-ondartet (N) epitelvev (n = 307 i begge tilfeller), og for det tumor (T) epitelvev (n = 388). Medianverdiene (med interkvartilt område i parentes) var: basal (N), 2,625 (2,125 til 2,9); luminal (N), 1,25 (1-1,75); epitelial (T), 2,05 (1,8-2,3). Medianverdiene var signifikant forskjellige fra hverandre (p 0,001, Dunn multiple sammenligningstest følgende vesentlige Kruskal-Wallis test). Panel D viser forholdet av epitelial tumor FAAH-IR til Gleason score (GS) ved diagnose. De FAAH-IR skår ble delt inn i kvadranter hvor jeg refererer til score mellom 1,8 (n = 96), II mellom 1,8 og 2 (n = 94), III mellom 2,05 og 2,25 (n = 99) og IV mellom 2,3 og 3 (n = 99). Fordelingen av GS gruppene var signifikant forskjellig i de kvadrantene (χ
2 = 27,03, df = 9, p 0,0005).
Totalt 1851 kjerner fra 388 tilfeller ble scoret for FAAH-IR i tumor epitelceller. For blodårene, ble 1201 kjerner fra 360 pasienter scoret. Et eksempel på farging for en tumor kjerne er vist i fig. 1C og den kumulative fordelingen av de epiteliale Stillingen er vist i fig. 1B, hvor det kan ses at den midlere poengsum var betydelig høyere enn den ikke-ondartet luminal stillingen, men lavere enn den basale stillingen.
Prøvene som benyttes her, er blitt undersøkt av oss med hensyn til ekspresjon av epitel CB
1-reseptorer [14]. For de ikke-maligne prøver, var det ingen signifikant korrelasjon mellom CB
1IR score og enten basal, luminal eller blodkar FAAH-IR. I motsetning til en signifikant korrelasjon mellom svulsten CB
1IR og svulsten epiteliale og blodkar FAAH-IR ble sett (tabell 1).
FAAH aktivitet i prostata kreft cellelinjer er påvirket av interleukin-4
en forklaring på det funn at tumoren epiteliale FAAH-IR er høyere enn FAAH-IR i normal prostata epitelvev [12] er som en bestanddel av svulsten mikromiljøet påvirker dens aktivitet. Den T
H2 cytokinet interleukin-4 (IL-4), som har blitt rapportert å regulere FAAH og CB
1-reseptorer på lymfocytter og Jurkat-celler [26] – [28], er involvert i patogenesen av flere cancer typer, inkludert prostata cancer (se [29] – [35]). IL-4-reseptorer er blitt rapportert i både tumor epitelceller og i dyrkede prostatakreft-cellelinjer [29], [36]. Vi bekreftet nærvær av IL-4-IR i prostata cancer epitelvev (fig. 2A), og fant at inkubering av både human androgen-insensitive PC-3-celler og rotte Dunning R3327 AT-1 prostatakreftceller med IL-4 for 24 h produserte en signifikant økning i FAAH aktivitet av cellene (fig. 2B og C). Et lignende resultat ble observert med humane prostatacancer LNCaP-celler (data ikke vist). Denne effekten av IL-4 er ikke unik for prostata kreft celler, siden det ble også sett mus P19 teratokarsinomceller celler (fig. 2D).
Panel A, IL-4-reseptor-immunoreaktivitet i et prostata svulst vevsprøve ( Gleason scorer 8). Linjen nederst til venstre i bildet representerer 100 mikrometer. Paneler B-D, effekt av IL-4 på FAAH aktiviteten av humane PC-3 prostata kreftceller (B); rotte R3327 AT-1 prostatakreftceller (C) og mus P19 teratokarsinomceller celler (D). Cellelinjene ble inkubert i 24 timer med 5 ng /ml IL-4 og FAAH aktivitet i cellehomogenater ble bestemt ved anvendelse av 2 uM [
3H] Anandamid som substrat. Enzymaktiviteten i alle tilfeller ble fullstendig blokkert av selektiv FAAH inhibitor URB597. Data er gjennomsnitt og standardavvik, n = 4-5; * P 0,05, ** p 0,01, paret t-test. I paneler (E) og (F) PC-3 og LNCaP-celler ble inkubert med IL-4 (5 ng /ml) i 24 timer. Utvinning av RNA, cDNA syntese og PCR-analyse ble utført som beskrevet i «Methods» -delen. Panel E. Semi-kvantitativ PCR-analyse av FAAH mRNA-ekspresjon i PC-3 og LNCaP-celler. MRNA uttrykk for FAAH ble normalisert mot GAPDH. Den semi-kvantitativ PCR-analyse ble utført ved hjelp av samleprøver (n = 6). Panel F. kvantitativ real-time PCR-analyse av FAAH mRNA uttrykk, normalisert mot GAPDH. Kvantitative PCR-data er visualisert som middel (n = 6) og sem, hvor den ubehandlede kontrollgruppe mener er definert som 100%.
I etterfølgende eksperimenter, effekter av IL-4-behandling ved FAAH-proteinet og mRNA ble vurdert. Behandling av PC-3 og LNCaP-celler med IL-4 i 24 timer ikke regulere mRNA-ekspresjon av FAAH, vurdert ved både semi-kvantitativ PCR og kvantitativ real-time PCR (figur 2E, 2F). I et ytterligere eksperiment ble PC-3-celler behandlet med IL-4 (5 ng /ml) i 3 timer, for å studere mulig tidlig regulering av FAAH uttrykk. I likhet med den 24 h eksperimentet, imidlertid, behandling av PC-3-celler med IL-4 i 3 timer og fikk ikke regulere mRNA-ekspresjon av FAAH (data ikke vist). I motsetning til situasjonen for Jurkat-celler og T-lymfocytter, ekspresjonen av CB
1 i LNCaP-celler ble ikke regulert ved IL-4: den relative ekspresjon av CB
1 /GAPDH (% av ubehandlede kontroller, midler ± sEM, n = 6) etter 24 timers behandling med enten bærer eller IL-4 var 100 ± 33 og 109 ± 20, henholdsvis. PC-3 celler brukes i vår lab uttrykte ikke påvisbare nivåer av CB
1 mRNA (data ikke vist).
Foreløpige Western blot analyser ble også foretatt ved hjelp av lysatene fra PC3 celler behandlet i 24 timer med enten bærer eller 5 ng /ml IL-4.
