Abstract
LIV-1, en sink transportør, er et effektor-molekyl nedstrøms fra oppløselige vekstfaktorer. Dette proteinet er vist å fremme epitelial-til-mesenchymale overgang (EMT) i human pankreas, bryst og prostata kreftceller. Til tross for implikasjon av LIV-1 i kreft vekst og metastasering, har det ikke vært noen studie for å fastslå hvilken rolle LIV-1 i prostata kreft progresjon. Dessuten var det ingen klar avgrensning av den molekylære mekanismen som ligger til grunn LIV-1-funksjonen i kreftceller. I denne henvendelsen, fant vi økt LIV-1 uttrykk i godartet, PIN, primær og beinmetastatisk human prostatakreft. Vi karakteriserte mekanismen som LIV-en driver human prostatakreft EMT i en androgen-ildfast prostatakreftceller (ARCaP) prostatakreft beinmetastase modell. LIV-en, når overexpressed i ARCaP
E (avledede celler ARCaP med epitelial fenotype) celler, fremmet EMT irreversibelt. LIV-en overexpressed ARCaP
E cellene hadde forhøyede nivåer av HB-EGF og matriksmetalloproteinase (MMP) 2 og MMP 9 proteolytisk enzymaktivitet, uten at det påvirker intracellulær sink konsentrasjon. Aktiveringen av MMP’er resulterte i utstøtingen av heparinbindende-epidermal vekstfaktor (HB-EGF) fra ARCaP
E-celler som fremkalte konstitutive epidermal vekstfaktor reseptor (EGFR) fosforylering og dens nedstrøms ekstracellulære signal regulert kinase (ERK) signalering. Disse resultater antyder at LIV-1 er involvert i sykdomsprogresjon som et intracellulært mål til vekstfaktor-reseptor-signalering som fremmet EMT og kreft metastasering. LIV-en kan være en attraktiv terapeutisk mål for utrydding av pre-eksisterende menneskelig prostatakreft og bein og metastaser bløtvev
Citation. Lue HW, Yang X, Wang R, Qian W, Xu RZH, Lyles R, et al. (2011) LIV-en Fremmer Prostate Cancer epithelial-til-Mesenchymale Overgang og metastasering gjennom HB-EGF Shedding og EGFR-medierte ERK signale. PLoS ONE 6 (11): e27720. doi: 10,1371 /journal.pone.0027720
Redaktør: Wafik S. El-Deiry, Penn State Hershey Cancer Institute, USA
mottatt: 22 juni 2011; Godkjent: 23 oktober 2011; Publisert: 16.11.2011
Copyright: © 2011 Lue et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet er støttet av forskningsmidler 2PO1CA098912 og 5RO1CA122602 (LWKC) av National Institutes of Health /National Cancer Institute (https://www.nih.gov) og W81XWH-07-0172 (LWKC) av det amerikanske forsvarsdepartementet i USA (https://cdmrp.army.mil/pcrp). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
LIV-1, et celleoverflateprotein og en kandidat formidler av den vekstfaktor-fremkalte aliserte molekyl, har vært forbundet med flere viktige biologiske prosesser ved å fungere som en transportør for sink og andre ioner [1], [ ,,,0],2], [3], [4], [5]. Som en prototype av LIV-en familien av ZIP metall transportører [5], [6], LIV-1 aksjer sekundær struktur med ZIP transportører og kan ha muligheten til å transportere metallioner. LIV-1 ble vist å være en mediator nedstrøms fra signal transduser og aktivator av transkripsjon 3 (STAT3) og snegle, som samvirker med snegle i undertrykkelse av epiteliale markør E-cadherin (E-CAD) gentranskripsjon [7]. LIV-1 ble også vist å være et samspill partner for østrogenreseptoren (ER) i hormonsensitive vev [3], [8]. I ER-positiv ZR-75-1 brystcancer-cellelinjen, er LIV-1 transkripsjonen induseres av østrogener [9]. I brystsvulster, er LIV-1 uttrykk assosiert med ER status [10], [11], og er positivt korrelert med spredning av kreft til regionale lymfeknuter [12]. I livmorhalskreft, ekspresjon av LIV-1 ble vist å være høyere i tumoren enn normalt vev; RNAi-mediert undertrykkelse av LIV-1 hemmet signifikant celleproliferasjon, kolonidannelsen, og reduserte den vandrende og invasiv evne til HeLa-celler [13]. LIV-1 er også blitt rapportert å være høyere hos klinisk pankreatisk karsinom og indusert EMT i bukspyttkjertelcancerceller [14]. I sebrafisk, LIV-1 er viktig for den kjernefysiske lokalisering av sneglen, en mester transkripsjonsfaktor fremme epitelial til mesenchymale overgang (EMT), som gir migrering av gastrula organisere celler [15]. LIV-1 er derfor en obligatorisk co-faktor som regulerer EMT-forbundet gener [14], [15], [16].
diagnostisk og prognostisk verdi av LIV-en i human prostatakreft har ikke vært undersøkt. Siden sink spiller viktige roller i vedlikehold av prostata epitelceller homeostase [17], og sneglen er en nøkkel transkripsjonsfaktor kontrollere prostata kreft celle EMT [18], [19], [20], LIV-1 kan være en aktiv deltaker i fremming av EMT under prostatakreft progresjon og bein metastasering. I denne studien, bestemt vi nivået av LIV-1 i humane prostatacancercellelinjer og prøver kliniske vev for å definere forholdet mellom LIV-1 og prostatakreft progresjon og metastasering. Den ARCaP human prostatacancer progresjon cellemodell ble anvendt for å vurdere rollen til LIV-1. Vår studie fant at LIV-1 overekspresjon fremmer prostatakreft celle EMT og letter dens metastasering til bein og bløtvev. Videre mekanistisk etterforskning avdekket at LIV-1 overekspresjon kan oppregulere HB-EGF og MMP2 og MMP9 uttrykk. Det sistnevnte kan henge fast ved enzymatisk membranbundet HB-EGF, for å produsere løselig HB-EGF som konstitutivt aktivert EGFR via økt EGFR fosforylering og dens nedstrøms ERK-signalering. Resultatene fra denne studien viser at unormalt forbedret LIV-1-ekspresjonen er en markør for prostatakreft progresjon, og aktivert LIV-1 er ansvarlig for konstitutiv aktivering av EGFR som driver EMT. LIV-1 kan være et attraktivt nytt terapeutisk mål for hemming av prostatakreft EMT og bein og metastaser bløtvev.
Materialer og metoder
Etikk uttalelse
Alle dyr arbeid ble gjennomført i henhold til relevante nasjonale og internasjonale retningslinjer, og ble godkjent av Institutional Animal Care og bruk Committee (IACUC) fra Emory University School of Medicine (Permit nummer 254-2008).
celle~~POS=TRUNC linjer~~POS=HEADCOMP og cellekultur
Menneske prostatakreft ARCaP
E og ARCaP
M celler (avledede celler av ARCaP med epitel og mesenchymale fenotype, henholdsvis) ble etablert i vårt laboratorium [21]. Cellene ble dyrket i T-medium (Invitrogen, Carlsbad, CA) supplert med 5% føtalt bovint serum (FBS, Atlanta Biologicals, Lawrenceville, GA). Humane embryoniske nyre HEK293-celler ble oppnådd fra American Type Culture Collection (Manassas, VA) og dyrket i DMEM (Invitrogen) supplert med 10% FBS. RPMI-1640 ble kjøpt fra Invitrogen (Carlsbad, California). Alle dyrkningsmedier ble supplert med penicillin (100 U /ml) og streptomycin (100 ug /ml). Cellekulturer ble holdt ved 37 ° C i en fuktig atmosfære tilsatt 5% CO
2.
Antistoffer og reagenser
Polyklonalt kanin-antistoff mot LIV-1 ble generert i vårt laboratorium. Kaniner ble immunisert ved standard immunisering protokoll med konjugert peptid KLH-CPDHDSDSSGKDPRNS, tilsvarende restene 146-161 av LIV-1 protein (GenBank tiltredelse antall NM_012319). Blod ble tatt 2 uker etter fjerde løft, og IgG ble renset og testet for spesifikk immunreaktivitet. Polyklonalt antistoff til E-cadherin (E-CAD), monoklonalt antistoff mot vimentin og fosfo-EGFR-antistoff ble oppnådd fra Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Monoklonalt antistoff til N-cadherin (N-CAD) og EGFR var fra BD Transduksjon Laboratories (San Diego, CA). Antistoffer mot P44 /42 MAP kinase og fosforylerte isoformene var fra Cell Signaling Technology (Danvers, MA). Monoklonalt antistoff mot p-aktin var fra Sigma-Aldrich (St. Louis, MO).
Insulin-lignende vekstfaktor-1 (IGF-1) og transformerende vekstfaktor-β1 (TGF-β1) ble kjøpt fra Diagnostic Systems Laboratories (Webster, TX). Epidermal vekstfaktor (EGF) var fra R 5′-TGCCCAGAAAATGAAAAAGG-3 «og 5′-GTGTATGTGGCAATGCGTTC-3′ for E-cad; ; 5»-CCATCACTCGGCTTAATGGT-3 «og 5′-GATGATGATGCAGAGCAGGA-3′ for N-cad; 5»-CGAAAGGCCTTCAACTGCAAAT-3 «og 5′-ACTGGTACTTCTTGACATCTG-3′ for Snegle; 5»-TGCCCGGCGGAATCTCCTGA-3 «og 5′-GATGCAGGAGGGAGCCCGGA-3» for HB-EGF; 5’GCTGTCTGCGTGGTGGTGCT -3 «og 5’TGGTGTGGTGGGTCCAGGGC -3′ for EGF; og 5»-TTAGCACCCCTGGCCAAGG-3 «og 5′-CTTACTCCTTGGAGGCCATG-3» for GAPDH. Reaksjonene ble initiert med 4 minutters inkubering ved 94 ° C, etterfulgt av 30 sykluser ved 94 ° C i 30 sekunder, 55 ° C i 30 sekunder og 72 ° C i 1 minutt. Reaksjonen ble avsluttet med en 7 minutters forlengelse ved 70 ° C i 7 minutter. PCR-produkter ble visualisert etter elektroforese gjennom en 1,2% agarosegel og farget med etidiumbromid (0,5 ug /ml).
Western blotting
Celler ved 80% konfluens ble lysert i en helcelle- lyseringsbuffer som tidligere rapportert [22]. Lysatene ble inkubert på is i 30 minutter og sentrifugert ved 10000 rpm ved 4 ° C i 10 minutter. Fra hver prøve ble 35 ug protein i supernatanten løst ved hjelp av SDS-PAGE og blottet på en nitrocellulosemembran (Bio-Rad, Hercules, CA), som ble blokkert i 5% skummet melk i PBST (137 mM NaCl, 12 mM fosfat, 2,7 mM KCl, og 0,1% Tween 20) ved værelsestemperatur i 20 minutter og inkubert med primært antistoff ved 4 ° C over natten. Membranene ble deretter vasket tre ganger i PBST og inkubert med pepperrot-peroksidase-konjugert sekundært antistoff i 1 time ved romtemperatur. Etter fem vaskinger i PBST, ble spesifikke signaler detektert ved inkubering av membranen med ECL-reagens (Amersham-Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ).
Måling av intracellulær sinkkonsentrasjon
To metoder ble anvendt for å bestemme intracellulær sink konsentrasjon. For å fremstille prøver for analyse av total intracellulær sink ved induktivt koblet plasma massespektrometri (ICP-MS), dyrkede celler ved 80% konfluens ble trypsinisert og vasket i PBS, og deretter inkubert i 300 ul av 70% salpetersyre ved 37 ° C i 2 timer. Cellene ble deretter plassert i 2% salpetersyre og underkastet ICP-MS med et Varian instrument. En standardkurve ble generert med serielle fortynninger av sink instrument standarder. For å fremstille prøver for analysering av intracellulær labile sink ved fluorometrisk metode, ble cellene sådd ut ved 3 x 10
5 celler per brønn i 6-brønns plater dagen før målingen. Cellene ble fylt med 2 uM av FluoZIN-3 AM (Invitrogen) i 1 time i Opti-MEM inneholdende 0,02% Pluronic F127 (Invitrogen). Etter vasking i PBS ble lastet cellene inkubert i indikator-fri Opti-MEM i 30 minutter. Fluorescens av FluoZin-3 ble målt ved hjelp av en PE Victor
3 V-plateleser.
Scratch sårheling analysen
ARCaP
M celler transfektert transient med LIV-1 siRNA eller universal siRNA kontroll ble anvendt for å bestemme vandringsadferd. Cellene ble langsomt og forsiktig skrapet med et 10 ul pipettespiss over midten av brønn 48 timer etter transfeksjon. Etter riper, ble brønnen forsiktig vasket to ganger med medium for å fjerne de frigjorte celler. Brønnen ble etterfylles med friskt medium. Bilder ble tatt 48 timer etter riper. Flere visninger av hver brønn ble dokumentert, og tre uavhengige eksperimenter ble utført.
Trans-brønn migrasjon og invasjon analyser
For å utføre en trans-brønn migrasjon analysen, 2,5 × 10
4 cellene i den øverste kammer i 24-brønners plater av Transwell 8 um porestørrelse (BD Biosciences) ble inkubert i 16 timer i komplett medium ble tilsatt til den nederste kammer. Cellene ble deretter fiksert med formalin og farget med 0,5% krystallfiolett. De ikke-migrerte celler inne i kammeret ble fjernet ved pensling. Krystallfiolett for trekkende celler ble solubilisert i Sorensons buffer (0,1 M natriumcitrat og 50% etanol, pH 4,2) og målt for absorbans ved OD
590. Invasjonen Analysen ble utført ved anvendelse av BD BioCoat Matrigel invasjons kamre (BD Biosciences, 8-um porestørrelse). De samme prosedyrene som er beskrevet ovenfor ble brukt, bortsett filtrene ble pre-belagt med 100 ul Matrigel på en 1:04 fortynning i RPMI-1640.
Vurdering av tumorigen og metastatiske potensialer
Den funksjonelle roller LIV-en i prostata tumordannelse og metastase ble vurdert som rapportert tidligere [23]. For å vurdere lokal tumorvekst, 4 uker gamle atymiske hannmus (Ncr-nu /nu, National Cancer Institute, Frederick, MD) ble inokulert subkutant med ARCaP
E-celler (1 x 10
6 i 50 pl PBS) stabilt transdusert med LIV-1. Tumor dimensjon ble målt med en målepunktet på dager 23, 32, 43, og 50 etter injeksjonen, og tumorvolumet ble beregnet som lengde x bredde x høyde x 0,5236 [24]. For å vurdere kreftmetastaser, ble atymiske hannmus inokulert intracardiacally med ARCaP
E celler (2 × 10
6 i 100 mL PBS) stabilt transduced med LIV-en til venstre ventrikkel. Dyrene ble observert i 4 måneder for utvikling av metastatiske lesjoner. Skjelettmetastaser ble registrert av X-ray radiografi og metastaser bløtvev ble bekreftet ved histopatologi
Immunohistochemistry (IHC) av vev microarray (TMA)
De normale og syke prostata vev analysert var fra.: 1) En skreddersydd TMA med normal prostata vev fra 4 friske menn; matchet kreft, godartet, og PIN-vev fra 12 prostatakreft tilfeller; matchet godartede og kreft vev fra 11 tilfeller; matchet PIN og kreft fra en sak; benign prostatahyperplasi (BPH) fra 2 tilfeller; og prostatakreft beinmetastaser fra 3 prostatakrefttilfeller. 2) En skreddersydd TMA besto av 47 bein metastase vev fra 11 prostatakreftpasienter. 3) Fire TMA som hver inneholder 66 tilfeller av prostatakreft og godartet prostata lidelser (US Biomaks. Rockville, MD).
IHC-protokollen for å vurdere genekspresjon har blitt rapportert [22]. I korthet prøver ble deparaffinized, rehydratisert og utsatt for antigen gjenfinning. Etter endogen peroksidase blokkering, ble prøvene inkubert med primært antistoff ved 4 ° C over natten, etterfulgt av en 30-minutters inkubering med DakoCytomation EnVision + HRP-reagens. Signaler ble påvist ved å legge diaminobenzidine som kromogen og kontra av hematoxylin. Pre-immunisering kaninserum tjente som negativ kontroll. IHC farging ble scoret av to etterforskere uavhengig basert på fire fargeintensitet fra 0 til +++ som tidligere rapportert [22].
Gelatin zymografi
Alle gelatin Zymografi reagenser ble kjøpt fra Invitrogen. Celler ble dyrket i serumfritt RPMI1640 medium i 24 timer og kondisjonert medium ble oppsamlet. Protein i mediet ble konsentrert med en AmiconUltracel 30 KDa filter (Millipore, Billerica, Massachusetts). Like mengder av protein (10 ug /prøve) ble blandet med 2 x Novex Tris-Glycine SDS-prøvebuffer, og fraksjonert på en 10% gelatin-gel under ikke-reduserende betingelser. Gelen ble deretter inkubert ved 37 ° C i renaturering av buffer i 30 minutter og i utviklingen av buffer i 30 minutter. Til slutt ble gelen farget i SimplyBlue Safestain, og band som representerer gelatinase aktivitet MMP2 og MMP9 ble kvantifisert.
Enzyme-linked immunosorbent assay (
ELISA
) for HB-EGF
Cellene ble dyrket i serumfritt RPMI1640 medium i 24 timer. Kondisjonert medium ble samlet og analysert for HB-EGF konsentrasjon med Human HB-EGF DuoSet ELISA kit (R og 2) bein metastase vs. godartet, PIN-kode, og primær lokalisert kreft. Denne testen er ekvivalent med den parametriske t-test benyttet når det er kun to grupper som sammenlignes. Logistisk regresjon ble brukt til å modellere sammenhengen mellom binære Gleason score som ble delt inn i binære variabler av godt differensiert (GI≤6) vs. moderat til dårlig differensiert (GI≥7) prostatakreft. SAS og Minitab ble brukt i denne analysen.
Resultater
Den menneskelige prostata kreft ARCaP celler etablert i vårt laboratorium [21] kan lett forfremmet til å gjennomgå EMT i respons til løselige faktorer og matrix proteiner til stede i tumoren mikromiljøet [20], [25], [26], [27]. For å belyse den molekylære mekanismen som regulerer EMT, ble epitelial ARCaP
E analysert for differensiell genekspresjon i respons til løselige faktorer, i forhold til sin ARCaP
M motstykke som oppviste en mesenchymale fenotype. LIV-1 var en av de differensielt uttrykte gener identifisert [27]. I denne studien undersøkte vi rollen som LIV-en i å regulere EMT i ARCaP celler for å vurdere mulig mekanisme for LIV-1-operasjon i markedsføringen av prostatakreft bein og metastaser bløtvev.
LIV-1 var involvert i å fremme EMT i ARCaP cellemodell
Vi har tidligere rapportert at ARCaP
E celler gikk EMT når de ble behandlet med løselige faktorer inkludert IGF-1, EGF, TGF-β1 og β-2 mikroglobulin (β -2M) [20], [25], [26], [27]. I den foreliggende undersøkelse, når ARCaP
E-celler ble behandlet med enten TGF-β1 eller IGF-1, ble en induksjon av LIV-1-ekspresjon detektert ved både RT-PCR og Western blotting analyser (figur 1A). Når forskjellige konsentrasjoner av IGF-1 ble tilsatt til induksjonsmediet ble responsen til LIV-1-ekspresjon funnet å være doseavhengig (figur 1A). IGF-1-indusert LIV-1-ekspresjon i ARCaP
E-celler forekom samtidig med en bryter av cellemorfologi og genekspresjon mot mesenchymale fenotype,
dvs.
, tap av tettklebemiddel polarisert epitel-morfologien til å bli løst spredt fibrinoblast celler med økt uttrykk av N-cad og vimentin men redusert uttrykk for E-cad, et kjennetegn beholdes av polariserte epitelceller (Figur 1b). Aktivert LIV-1 uttrykk syntes å skje samtidig med overgangen av ARCaP
E til ARCaP
M, en ARCaP mesenchymale variant [21].
Rollen LIV-en ble vurdert av den endrede uttrykk under EMT. A, ARCaP
E-celler ble behandlet i 48 timer med vekstfaktorer for å indusere EMT. RT-PCR og Western blotting ble brukt til å vise økt LIV-1-ekspresjonen (venstre panel), og den dose respons fra (høyre panel) uttrykket. B, Western blotting ble brukt til å bekrefte EMT-lignende uttrykks forandringer i den behandlede ARCaP
E-celler. C, mesenchymale celle-lignende ARCaP
M-celler ble utsatt for siRNA knockdown for LIV-1-ekspresjon i 48 timer. RT-PCR og Western blotting ble brukt til å påvise uttrykks endring som følge av reverseringen av EMT i de behandlede cellene. D, Scratch sårtilheling og transwell invasjon analyser ble benyttet for å bestemme trekkfugl og invasive atferd i siRNA behandlet ARCaP
M celler. * Angir statistisk signifikans sammenlignet med kontroll con1 klon (P 0,05). E, ARCaP
E celler ble transfektert med LIV-1 uttrykk konstruere. RT-PCR og Western blotting ble utført 48 timer etter transfeksjon å oppdage uttrykks endringer som gjenspeiler EMT-lignende hendelser. GAPDH fungerte som en intern kontroll for RT-PCR reaksjoner, og β-actin ble brukt som en lasting kontroll i Western blotting.
For å definere rollen LIV-en i formidling EMT, vi forbigående redusert den LIV-1 nivå i mesenchymale-lignende ARCaP
M celler ved siRNA knockdown. ARCaP
M celler behandlet med spesifikke LIV-en siRNA viste en markert reduksjon av LIV-1 transkripsjoner (figur 1C). Viktigere, de behandlede cellene viste redusert uttrykk av mesenchymale markører N-cad og sneglen, men økt uttrykk av E-cad genet i både RT-PCR og Western blotting analyser (figur 1C). I tillegg ARCaP
M celler behandlet med spesifikke LIV-en siRNA utstilt mye redusert trekkfugl og invasiv evne i scratch sårhelende og Transwell invasjons analyser (figur 1D). Disse resultatene antydet at LIV-1 uttrykk er assosiert med EMT og redusert LIV-1 uttrykk fører til mesenchymale til epitel overgang (MET), en reversering av EMT. Tilstedeværelsen av LIV-1 viste seg å være nødvendig for opprettholdelsen av et mesenchymale fenotype.
neste undersøkt hvorvidt forhøyet LIV-1 i epitel-lignende ARCaP
E cellene ville være tilstrekkelig til å igang EMT, som bestemt ved molekylære analyser. Etter transient transfeksjon med LIV-1 ekspresjonskonstruksjon, ARCaP
E-celler ble undersøkt ved både RT-PCR og Western blotting analyser for ekspresjon av EMT-assosierte markører. Den transfekterte ARCaP
E celler viste markant økt LIV-1 uttrykk (figur 1E), ledsaget av økt N-cad og Snail men en redusert E-cad uttrykk. Disse uttrykks endringene var i samsvar med de sett i vekstfaktor-fremkalte EMT (figur 1B). Resultater fra LIV-en siRNA knockdown og LIV-1 overekspresjon studier i ARCaP
M og ARCaP
E celler antydet at LIV-en tjener en viktig regulator av EMT i menneskelige prostata kreft celler.
Produksjon og karakterisering av polyklonale antistoffer mot humant LIV-en
for å vurdere om LIV-1 uttrykk er knyttet til klinisk progresjon av menneskelig prostatakreft, hevet vi polyklonale antistoffer ved å immunisere kaniner med KLH-konjugert LIV-1 peptid. Spesifisitet av LIV-1-antistoffer ble bekreftet ved Western blotting av hel-celle-ekstrakter fra celler som overuttrykker eksogent LIV-1. Fra HEK293-celler forbigående transfektert med LIV-1, observerte vi en enkelt immun-reaktiv LIV-1-protein, ved 110 kDa (figur 2A). Siden den beregnede molekylvekt på LIV-1-protein er 90 kDa [5], differensial 20 kDa mellom den detekterte og den anslåtte størrelsen ble sannsynligvis tilskrives N-bundet glykosylering av det LIV-1-protein, som tidligere rapportert [5]. Viktigere var det signal som detekteres av LIV-1-antistoffer opphevet når antistoffene ble pre-adsorbert med LIV-1 peptidet anvendt i immunisering. I tillegg ble øket signalintensitet detekteres i ARCaP
E-celler transient transfektert med LIV-1 ekspresjonskonstruksjon, mens en reduksjon av det signal som ble sett i ARCaP
M-celler behandlet med en forbigående LIV-1 knockdown vektor i både Western blotting og IHC-analyser (figur 2B og 2C). Disse resultatene tydet på at LIV-1-antistoffer fremstilt kunne detektere spesifikt LIV-1-proteinet, som ble modifisert i cellelinjene som ble testet.
De produserte antistoffer mot LIV-1 ble utsatt for validering for spesifisitet. A, ble HEK293-celler transient transfektert med LIV-1 ekspresjonskonstruksjon underkastet Western blot-analyse med antistoffene til LIV-1 (øvre panel). Antistoffspesifisitet ble bestemt ved pre-absorberende antistoffet med det immuniserende peptid (midtre panel). B, ARCaP
E-celler ble transient transfektert med LIV-1 uttrykk konstruere å overuttrykke LIV-en og ARCaP
M celler med spesifikke siRNA å undertrykke LIV-1 uttrykk. I de øvre 2 paneler, ble Western blotting utført 48 timer senere med antistoffene til LIV-1. I de lavere 2 paneler, ble disse celler undersøkt ved hjelp av RT-PCR for å bekrefte LIV-1-ekspresjon. β-aktin ble benyttet som kontroll i Western blotting og GAPDH ble brukt som kontroll for RT-PCR-analyse. C, IHC ble gjennomført for å ytterligere bekrefte LIV-1 Ab spesifisitet i ARCaP
E celler transient transfektert med LIV-1 uttrykk konstruere og ARCaP
M celler transient transfektert med den spesifikke siRNA (200 ×).
Stall LIV-1 overekspresjon indusert EMT i ARCaP
E celler
Etter forbigående knockdown av LIV-1 i ARCaP
M celler, en forventet reversering av mesenchymale fibroblastisk cellen form til epitelial morfologi ble observert. Disse morfologiske brytere var lett påvises ved genuttrykk endringer (figur 1C). I kontrast, forbigående overekspresjon LIV-1 i ARCaP
E cellene induserte ikke mesenchymale morfologisk overgang, til tross for felles uttrykks endringer som indikerer EMT (figur 1E). Vi har mistanke om at mangelen på morfologiske forandringer kan skyldes arten av den forbigående transfeksjon. Følgelig ble stabile ARCaP
E-kloner etablert for å vurdere om LIV-1 er en kritisk regulator assosiert med morfologiske samt uttrykks og atferds overgang fra en epitelial til mesenchymale fenotype.
Vi isolert 4 ARCaP
E kloner (LIV # 8, 12, 14 og 17) som stabilt uttrykker høye nivåer av LIV-1-protein, som påvist ved Western blotting (figur 3A). To kontroll kloner (con1 og CON2) ble også isolert fra transfeksjon med kontrollvektor. De overekspresjon LIV-en viste typiske EMT-lignende uttrykks endringer, med redusert E-cad uttrykk, men økt N-cad og Snail uttrykk (figur 3A). Betydelig, alle klonene viste markert forandret cellulær morfologi: i stedet for den lille cellestørrelsen med brostein-lignende form med tett anordnet intercellulære kontakter som er typisk for den epiteliale cellelignende ARCaP
E, alle de fire klonene innrettet bemerkelsesverdig endret morfologi viser et tap av inter kontakt og typisk spindel-formet mesenchymale celle morfologi (Figur 3B). Den morfologiske overgangen var permanent og irreversibel, vedvarer etter mer enn 30 passeringer i kontinuerlig kultur, mens de to vektor transfekterte kloner forble epitelceller-aktig. Det virker som stabil LIV-1 overekspresjon kan frembringe både morfologiske og biokjemiske EMT overgang. LIV-1 er således en potent formidler av EMT i ARCaP
E celler.
ARCaP
E-kloner overekspresjon LIV-en vises EMT-lignende endringer i genuttrykk, cellulær morfologi og atferd. A, alle fire LIV-1 overekspresjon ARCaP
E kloner viste EMT-lignende uttrykks forandringer som påvist ved Western blotting, mens de to vektorkontroll kloner (1 og 2) beholdt en epitelial celle-lignende uttrykk profil. B, cellulær morfologi av de LIV-1 overekspresjon-celler viste markerte endringer fra kontroll klonene (200 x). C, LIV-1 overekspresjon celler (LIV # 8 og LIV # 14 ble sammenlignet med vektorkontroll kloner 1 og 2 og foreldre ARCaP
E og ARCaP
M celler for endret trekkevne i Transwell analyser. Hvert resultat er gjennomsnitt ± standardavvik for en tre eksemplarer analysen. D, den LIV-1 overekspresjon # 8 og # 14 kloner ble sammenlignet med vektor kontroll kloner 1 og 2 og foreldre ARCaP
E og ARCaP
M celler for endrede invasivitet. * indikerer statistisk signifikans i forhold til con1 kontroll klone (
P
0,05).
virkningene av LIV-1 på atferdsendringer ble vurdert for sin promotering av celle migrasjon og invasjon i Boyden kammer analyser. Mens kontrollen neo transfektert ARCaP
E-klonene viste lignende migrasjon og invasjon evner tett etterligner de av foreldre ARCaP
E celler, gjentatte analyser viste at LIV-1 overekspresjon tillagt betydelig økt trekkevne (Figur 3C) og invasiv potensial til å trenge ekstracellulære matriser (Figur 3D). Samlet utgjør disse dataene støtter forestillingen om at økt LIV-1-nivåer fremme motilitet og invasive atferd av prostata kreft celler.
LIV-1 overekspresjon forfremmet prostata tumordannelse og fjernmetastaser
in vivo
Vi har undersøkt hvilken rolle LIV-en stabilt uttrykt i ARCAP
E celler i moduler påfølgende tumorigene og metastaserende atferd hos mus. Vi sammenlignet lokal og fjernt metastatisk vekst av ARCaP
E svulster ved subkutan og intrakardielle svulst celle inokulasjon protokoller som beskrevet tidligere [21], [23].
Etter subkutan implantasjon, LIV-1 overekspresjon kloner induserte en lik forekomst av tumordannelse til vektor-transfiserte kontroller, hver gruppe som har 6 tumorer fra totalt 8 vaksiner.
