Abstract
mucin 1 (MUC1) er en heterodimert protein som er abnormt uttrykt i ulike menneskelige karsinomer og visse hematologisk kreftsykdom. Det onkogene MUC1 transmembrane C-terminale subenhet (MUC1-C) fungerer delvis av transduse vekst og overlevelsessignaler fra celleoverflatereseptorer. Lite er imidlertid kjent om strukturen av MUC1-C cytoplasmatiske domene som et potensielt medikament mål. Ved hjelp av fremgangsmåter for struktur prediksjoner Våre resultater indikerer at et svært konservert CQCRRK sekvens, som er tilstøtende til cellemembranen, danner en liten lomme som eksponerer de to cysteinrestene for dannelse av disulfidbindinger. I motsetning til det gjenværende av MUC1-C cytoplasmatiske domenet har ingen åpenbar struktur, i samsvar med en iboende uordnede protein. Våre studier og dermed fokusert på kommunikasjon til MUC1 CQCRRK regionen. Resultatene viser at L- og D-aminosyre CQCRRK-inneholdende peptider bindes direkte til CQC motiv. Vi viser videre at D-aminosyre peptid, betegnet GO-203, blokkerer homodimerization av MUC1-C cytoplasmatiske domene in vitro og i transfekterte celler. Videre GO-203 binder seg direkte til endogen MUC1-C i bryst og lunge kreftceller. Colocalization studier viser videre at GO-203 binder seg hovedsakelig til MUC1-C på cellemembranen. Disse funnene støtter den videre utviklingen av agenter som retter seg mot MUC1-C cytoplasmaområde CQC motiv og dermed MUC1-C funksjon i kreftceller
Citation. Raina D, Agarwal P, Lee J, Bharti A, McKnight CJ , Sharma P, et al. (2015) Karakterisering av MUC1-C cytoplasmaområde som kreft Target. PLoS ONE 10 (8): e0135156. doi: 10,1371 /journal.pone.0135156
Redaktør: Srinivasa M. Srinivasula, IISER-TVM, INDIA
mottatt: 8 april 2015; Godkjent: 17 juli 2015; Publisert: 12. august 2015
Copyright: © 2015 Raina et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Forskning rapportert i denne publikasjonen ble støttet av National Cancer Institute of National Institutes of Health i henhold utmerkelser CA097098 og CA166480, http: //www.cancer. gov (DK). Genus Oncology gitt støtte i form av lønn for forfattere D.R. og S.K. LeadInvent gitt støtte i form av lønn for forfattere P.A. og PS! De spesifikke roller disse forfatterne er formulert i «-delen forfatternes bidrag». Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser. Jeg har lest journalen politikk og forfatterne av dette manuskriptet har følgende konkurrerende interesser : DK har egenkapital i Genus Oncology og er konsulent for selskapet. Den tilhørighet Genus Oncology og LeadInvent med dette arbeidet endrer ikke vår tilslutning til PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
epitel er lag med sideveis koblet celler med apikal-basal polaritet som er beskyttet mot det ytre miljø ved en slimete barriere [1]. Den mucin familie av utskilte og transmembrane glykoproteiner utviklet seg i metazoans å ha råd til beskyttelse av epitel som, for eksempel, linje (i) luftveiene og gastrointestinale traktater, og (ii) gang i spesialiserte organer [1]. Mucin 1 (MUC1) er et trans medlem av denne familien som ble identifisert av sin overekspresjon i menneskelige brystkreft [2]. MUC1 består av to underenheter som stammer fra autocleavage av et enkelt polypeptid og i sin tur danner et heterodimerisk kompleks ved den apikale membran av normale epitelceller [1]. Den MUC1 N-terminal subenhet (MUC1-N) inneholder tandem 20-aminosyre (aa) repetisjoner som er endret av
O
-glycans. Den MUC1 C-terminal-subenhet (MUC1-C) er den transmembrane komponenten av heterodimeren og forankrer MUC1-N til celleoverflaten. MUC1 er overuttrykt i forskjellige karsinomer, støtter ideen om at oppregulering av MUC1-N /MUC1-C kompleks representerer en omveltning av sin normale funksjon for å fremme overlevelse av kreftceller [1]. I denne sammenheng og i tillegg til å delta i slimbarrieren, glykosylert MUC1-N kan forsterke celleoverflatereseptor funksjon å understøtte vekst og overlevelse [3]. Videre og i forbindelse med tap av polaritet, interagerer MUC1-C med celleoverflate-molekyler, slik som reseptor-tyrosin-kinaser, og fremmer deres aktivering og nedstrøms signalisering [4]. Betydelig, er tilstrekkelig overekspresjon av MUC1-C for å gi forankringsuavhengig vekst og tumorigenicity, støtter onkogene funksjon av denne subenheten [5].
MUC1-C består av en 58-aa ekstracellulære domene, en 28- aa trans region og en 72-aa cytoplasmaområde. Den MUC1-C ekstracellulære domenet inkluderer en NPG motiv med asparaginresidiet lagt
N
-glycosylation [6]. Binding av galectin-3 til det glykosylerte NPG området fremmer dannelsen av ekstracellulære broer mellom MUC1-C og andre celleoverflatemolekyler, som for eksempel epidermal vekstfaktor reseptor (EGFR) [6]. Den MUC1-C cytoplasmatisk domene (MUC1-CD) inneholder en CQC motiv tilstøtende til transmembranområdet, noe som er nødvendig og tilstrekkelig for dannelsen av MUC1-C-homodimerer [7,8]. Viktigere, mutasjon av CQC motiv til AQA blokker import av MUC1-C til kjernen og mitokondrie ytre membran [7,9,10]. Videre opphever CQC → AQA mutasjon den MUC1-C onkogene funksjon, støtter viktigheten av MUC1-C homodimerization i å drive intracellulære signaler der det gis vekst og overlevelse [7,11]. Følgelig har MUC1-C CQC motiv dukket opp som et attraktivt mål for utvikling av peptid og lavmolekylære inhibitorer som blokkerer MUC1-C homodimerization og funksjon [12,13].
De foreliggende studier har undersøkt struktur av den MUC1-C cytoplasmatiske domene basert på dets potensielle betydning som kreft mål. Vi viser at MUC1-C cytoplasmisk CQC motiv befinner seg i en druggable konfigurasjon, og at resten av det cytoplasmatiske domenet er ustrukturert, i overensstemmelse med andre onkogene molekyler som direkte aktivering av flere signalveier [14]. Vi viser også at MUC1-C cytoplasmaområde kan selektivt målrettet med peptider som direkte binder til CQC motiv og blokkerer MUC1-C homodimerization in vitro og i celler.
Materialer og metoder
Molecular Dynamics
MUC1-CD (aminosyrer 1-15) strukturen ble bygget
ab-inito
med de foretrukne phi /psi vinkler av de respektive aminosyrer. Den resulterende atomstrukturen med eksplisitte vannmolekyler og ioner ble undersøkt uten membran bi-lag bruker pasning Model Building med Energy Refinement (GUL) [15]. Etter stabilisering trinn minimalisering, oppvarming og likevekt, korte 15 ns simuleringer ble gjennomført for å generere 1500 conformations adskilt med 10 picoseconds, som ble ytterligere analysert for Root Mean Square Avvik (RMSD). I ytterligere studier ble det MUC1-C-membran-regionen, som har et dominerende heliks konformasjon som forutsagt av THMHMM og TMPred, satt inn i en pre-equalibrated 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glysero-3-fosfokolin (POPC) bi lags og oppløst med eksplisitt vann og ioner. De resterende cytoplasmaområde aminosyrer ble bygget med sine foretrukne phi /psi vinkler. Nanoskala molekyldynamikk (NAMD) [16] ble brukt til å utføre molekylær-dynamikk studien.
NMR analyse av MUC1-CD
Hans-MUC1-CD ble uttrykt fra PET-MUC1- CD plasmid (Novagen, Billerica, Massachusetts) og
15 N-merket protein ble fremstilt som beskrevet [17]. NMR-prøven besto av 1,7 mg /ml His-MUC1-CD, 1% D
2o, referanseforbindelse TMSP (250 pM) og 10 mM d
10-DTT. PH ble justert til 5,0 ved tilsetning av 1 M HCl. Ett og to-dimensjonale
15N heteronuclear enkle kvante sammenheng (HSQC) datainnsamlinger ble utført ved 20 ° C og 10 ° C på en 500 MHz Bruker Advance III NMR system ved Boston University Core-anlegg for strukturell NMR. Dataanalyse ble generert ved hjelp av Bruker sin toppspinn programvare.
Måling av bindingsaffinitetene
bindingsaffiniteter av FITC-GO-202 og FITC-GO-203 ble bestemt ved metningsbinding metoden [18]. I korte, 96-brønn glutathione- eller nikkel-belagte plater (Thermo Fisher, Waltham, MA) ble inkubert med 150 ul PBS-buffer inneholdende 21.45 ug /ml av GST-MUC1-CD, GST-MUC1-CD (AQA) eller His-MUC1-CD over natten ved 4 ° C etterfulgt av vasking med 50 mM Tris og 150 mM NaCl inneholdende 0,1% Tween-20 (TBST), og blokkering med 0,5% BSA i TBS. Platene ble deretter vasket 3 ganger med TBST. FITC-GO-202 eller FITC-GO-203 ble tilsatt til brønnene på 0,19 uM til 25 uM. Ikke-spesifikk binding ble bestemt i nærvær av GST alene. Platene ble inkubert i 1 time ved 37 ° C på en ristemaskin, etterfulgt av vasking 3 ganger med bindingsbuffer. Fluorescensintensitet ble bestemt på et Infinite M1000 PRO Tecan mikroplateleser (Tecan, NC) med eksitasjon ved 490 nm og emisjon ved 525 nm. GraphPad Prism 4.0 Programvare (San Diego, CA) ble brukt til å beregne dissosiasjonslikevektskonstant (Kd) av en ikke-lineær regresjon metode.
Complex Karakterisering av MALDI-TOF-MS
Binding eksperimenter med MUC1-CD og GO-203 ble utført som beskrevet [19]. Kompleksene ble eluert fra glutation perler, dialysert og konsentrert ved å bruke Amicon ultra sentrifugal-filter (Millipore, Billerica, Massachusetts). Kompleksene ble deretter utsatt for ikke-reduserende elektroforese og farget med Coomassie-blått. Proteinbånd ble skåret ut og analysert ved hjelp av MALDI-TOF-MS som beskrevet [20]. Kort, geler ble kuttet i små, jevne stykker; gel stykker var dehydrert med acetonitril og deretter rehydrert i 100 mM ammonium bikarbonat fulgt av 2 vaske- og tørkesykluser med ammonium bikarbonat og acetonitril, henholdsvis. Etter fullstendig dehydrering, ble gelbitene suspendert i 12,5 ng /ul trypsin i 50 mM ammoniumbikarbonat (50 ul). I-gel-fordøyelse ble utført ved 37 ° C i 10-12 timer, og prøvene ble surgjort med 50 ul 0,5% TFA. Tretti ul av denne blanding ble avsaltet ved C-18 inneholdende Zip-Tip (Millipore, Billerica, Massachusetts). Trypsin-spaltet peptider ble analysert ved hjelp av MALDI-TOF-MS (ABI-4800). MALDI-TOF-MS-analyser ble utført ved hjelp av en reflektor metode som var optimalisert for oppkjøpet for masse rekke 700-3500 amu. Data ble samlet inn og analysert ved hjelp av data Explorer programvarepakke (AB-Sciex, Framingham, MA) og MASCOT (ver.2.0.04, Matrix Science, Boston, MA). MS-broen analyse ble gjort ved hjelp av Protein Prospector (ver.4.27.2 enkel og ver.5.0, UCSF). Databasesøkeparametere var: (i) tryptiske fordøye, (ii) oksidert Met, (iii) to savnet skillelinjer, og (iv) disulfid bro med maksimal koblings molekyler satt til to og en masse toleranse på 50 ppm. Søking ble gjennomført mot GST-MUC1-CD og GO-203.
Plasmid Construction
vektorer som uttrykker GST-MUC1-CD, GST-MUC1-CD (AQA) og Hans-MUC1-CD , GFP-MUC1-CD og FLAG-MUC1-CD har blitt beskrevet [7]. Hans-merket MUC1-CD (rotter og hunder) ble klonet i pET28a vektor (Clontech, Mountain View, California) og uttrykt i
E
.
coli
BL21 (DE3).
In Vitro
Dimerisasjon
Renset Hans-MUC1-CD ble inkubert i PBS eller økende mengder av GO-203 i 1 time ved værelsestemperatur, som beskrevet [19]. Proteiner ble deretter separert i ikke-reduserende polyakrylamidgeler og analysert ved immunoblotting.
Cell Kultur
Menneske ZR-75-1 brystkreft (ATTC) og H1975 lungekreft (ATTC) cellelinjer var dyrket i RPMI 1640 supplert med 10% varme-inaktivert føtalt bovint serum (HI-FBS), 100 enheter /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin. 293T-celler ble dyrket i DMEM med 10% HI-FBS, antibiotika, og 2 mmol /L L-glutamin. Cellene ble behandlet med FITC konjugert-GO-202 (FITC-GO-202), FITC-GO-203 eller ukonjugert GO-203 syntetisert ved MIT Biopolymer Laboratory (Cambridge, MA) og AnaSpec, Inc (San Jose, California). Den p3XFLAG-CMV-10 (Sigma, St. Louis, MO), pEGFP-C1 og pDsRed-Monomer-N1 (Clontech, Mountain View, California) vektorer ble brukt for transfeksjon av rotte og hund MUC1-CD og full lengde human MUC1 i 293T-celler i nærvær av Lipofectamine 2000 (Life Technologies, Grand Island, NY).
Immunoutfelling og immunoblotanalyse
Cellelysater ble fremstilt som beskrevet [19]. Løselige proteiner ble immunopresipitert med anti-FLAG (Sigma, St. Louis, MO), anti-MUC1-C (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) eller en kontroll IgG. Bunnfallet og lysatene ikke underkastet immunoutfelling ble immunoblottet med anti-MUC1-C, anti-GFP (Abcam, Cambridge, MA), anti-FLAG og anti-FITC (Life Technologies, Grand Island, NY). Reaktivitet ble påvist med pepperrot peroksidase-konjugerte sekundære antistoffer og chemiluminescence.
Analyse av GO-203 Lokalisering
293T celler ble transfektert med MUC1-pDsRed-Monomer-N1 i nærvær av Lipofectamine 2000 for 48 timer. Cellene ble deretter inkubert med FITC-GO-203 i 3 timer og undersøkt ved anvendelse av et Nikon-dekonvolvering bredt felt epifluorescens system med en 100x oljeneddyppingsobjektivet. Bilder ble tatt med NIS-element programvare (Nikon) og analysert av ImageJ programvare.
Resultater
Analyse av MUC1-C cytoplasmaområde Struktur
For å definere strukturen på 72-aminosyre MUC1 cytoplasmaområde (MUC1-CD), vi først brukt flere betingelser for å generere krystaller med renset MUC1-CD protein. Disse forsøk på krystallisering viste seg mislykket, spørre oss å utforske molekylære simuleringsstudier. Vi først slått til homologi modellering som en tilnærming for å kartlegge strukturelle aspekter av MUC1-CD. Spesielt, men MUC1-CD oppviste liten eller ingen sekvens homologi med kjente proteiner. Derfor studerte vi sekundære struktur spådommer for MUC1-CD ved hjelp av ulike metoder, inkludert ROBETTA [21] og IGB-SSPro [22]. Resultatene fra disse studiene kollektivt indikert at MUC1-CD-en ikke er i samsvar med en typisk sekundærstruktur.
Vi dermed fokusert vår innsats på de første 15 aminosyrer av MUC1-CD (CQCRRKNYGQLDFIP) ved å studere sine atomistisk molekylær dynamikk . Den MUC1-CD (1-15) modellen ble bygget
ab-inito
med de foretrukne phi /psi vinkler av aminosyrer. Den resulterende strukturen ble så undersøkt med eksplisitte vann og ioner. Ved hjelp av korte 15 nanosekund simuleringer (1500 conformations adskilt med 10 picoseconds) med GUL og som demonstrert av RMSD, fant vi at MUC1-CD (1-15) sekvens er også iboende ustrukturerte uten foretrukne conformations (fig 1A). I tillegg, NMR-analyse av MUC1-CD bekreftet fravær av en påvisbar sekundærstruktur (figur 1B-1D), som vist ved tilstedeværelsen av toppene, i samsvar med MUC1-CD være en ustrukturert protein mellom 7,5 og 8,5 ppm.
(A) RMSD av snapshots innhentet for første
ab-initio
strukturen MUC1-CD (1-15). Y-aksen er RMSD og X-aksen er øyeblikksbilde sekvens (picoseconds). (B) Proton NMR spektra (1D) og
15N-HSQC spektra av MUC1-CD (1-15) ble kjøpt til 500 MHz på (C) 20 ° C og (D) 10 ° C ved pH 5,0.
MUC1-CD (1-15) inneholder en CQC motiv etterfulgt av tre positivt ladede rester (RRK). Den cytoplasmatiske region CQCRRK ligger ved siden av cellemembranen (forutsagt av TMPred SAQSGAG), den 28-aminosyre MUC1 -C /transmembrandomene (MUC1-C /TMD; VPGWGIALLVLVCVLVALAIVYLIALAV) og de første 10 rester av MUC1-CD (CQCRRKNYGQ). Som bestemmes av molekylære dynamikk studier, har TMD en dominerende helix konformasjon (Fig 2A). De resterende aminosyrer ble bygget med sine foretrukne phi /psi vinkler. Den resulterende strukturen ble satt inn i et representativt membran patch (POPC bilags) og atomistisk molekylær dynamikk studier ble utført for 55 ns ved hjelp NAMD programvare. Vi observerte en likevekt struktur med stabil RMSD og en foretrukket konformasjon (turn) på CQC regionen (figur 2A). Vi fant også at de to Arg-rester helst orientere mot membranen på grunn av kostnad-charge interaksjoner med de negativt ladede fosfater i lipid bilaget, og dermed skape en liten lomme for CQC motiv (Fig 2B). Dette foretrukket liten lomme orientering, kombinert med sin nærhet til lipid bilaget, støttet den oppfatningen at de CQC motiv Cys restene har redusert conformational frihet, som predisponerer dem for å danne disulfidbindinger mer effektivt med begrenset entropic straff.
(A ) Sekundær struktur fordeling av snapshots ble oppnådd med hensyn til simulert tid og vurderes med DSSP algoritmen. Y-aksen er resten sekvens: (1 til 7-SAQSGAG), (8-35 -VPGWGIALLVLVCVLVALAIVYLIALAV), (36-45 -CQCRRKNYGQ). X-aksen er tid i picosekunder (ps). (B) Figuren viser et område av det ytre lipid bilaget frem som rosa, røde og orange pinner som representerer fosfolipid-monomerer med den skruelinjeformede MUC1-C TMD. De cytoplasmatiske rester av MUC1-C består av CQCRRK blir fremhevet som en ball og pinne modell. De positivt ladede arginines trekkes opp og låses mot de negativt ladede fosfatgrupper.
Binding Studier med MUC1 CQC Motif
MUC1-C CQC motiv overfører dannelsen av MUC1- C homodimerer nødvendige for MUC1-C funksjon [7,8]. Vi ga derfor peptider som inneholder CQCRRKN sekvens som potensielle agenter som kan bindes til CQC lommen og blokkerer MUC1-C homodimerization. Ett slikt peptid, betegnet GO-202, inneholder et poly-Arg-sekvens for celle-penetrasjon bundet til CQCRRKN (L-aminosyrer, fig 3A). GO-202 ble syntetisert med en N-terminal FITC etikett for å evaluere direkte binding av dette peptid til GST-MUC1-CD bundet til glutation-belagte ELISA-plater. Som bestemt ved metningsbinding metoden, dissosiasjonskonstant (Kd) var 0,88 pM (figur 3A). Vi har også vurdert binding av et peptid, betegnet GO-203, karakterisert ved at poly-Arg celle-gjennomtrengende domene er knyttet til CQCRRKN (D-aminosyrer, fig 3B). Inkubasjon av FITC-merket GO-203 til GST-MUC1-CD demonstrerte en Kd på 0,63 mikrometer (Fig 3B). For å bekrefte spesifisitet bindende, ble FITC-GO-203 inkubert med Hans-MUC1-CD bundet til nikkel-belagte ELISA-plater (Fig 3C). I disse studiene var Kd var 0,86 mikrometer, noe som indikerer at samspillet mellom GO-203 og MUC1-CD ikke er gitt av GST eller His-tag. For å bekrefte spesifisiteten av interaksjonen, ble FITC-GO-203 også inkubert med GST-MUC1-CD der CQC Motivet ble mutert til AQA. Her, ingen interaksjon var tydelig mellom FITC-GO-203 og GST-MUC1-CD (AQA) som støttes av deteksjon av bare bakgrunns fluorescens (data ikke vist). Disse resultater viser at både L- og D-formene av den CQCRRKN peptidet direkte bindes til MUC1-CD og at bindingen er spesifikk for CQC motivet.
(A) Vist er de L-aa-sekvensen av GO -202 og (B) D-aa sekvens av GO-203. Den tilsynelatende Kd for binding av (A) FITC-GO-202 til GST-MUC1-CD, (b) FITC-GO-203 til GST-MUC1-CD og (C) FITC-GO-203 til His-MUC1-CD proteiner ble bestemt ved metnings bindende eksperimenter.
Go-203 Forms disulfidbindinger med MUC1-CD på CQC Motif
for å vurdere sammenslutning av GO-203 med MUC1-CD videre , GO-203 ble inkubert med renset GST-MUC1-CD. Kompleksene ble separert ved SDS-PAGE og tryptiske spaltninger ble analysert ved hjelp av MALDI-TOF-MS (figur 4A). Peptid identifikasjon var basert på MS-bro analyse av de tryptiske spaltningen MALDI-TOF data mot sekvensene av de 2 kjente komponenter i reaksjonen, dvs. GST-MUC1-CD (S1 figur) og GO-203. Peptidet dimer med en enkelt disulfidbro ved CQC-motivet var representert ved toppen av m /z 1483.6084 Da (figur 4B), og egenskapene er oppført i tabell 1. Denne topp ble ikke observert i de tryptiske fordøyinger av GST + GO-203 og GST-MUC1-CD prøver, noe som indikerer at GO-203 skjemaer disulfidbroer spesielt med MUC1-CD, og ikke med GST.
(A) Trypsin sammendrag av den 35 kDa GST-MUC1-CD og dra- 203-kompleks ble analysert ved hjelp av MALDI-TOF masse fingerprinting. (B) Den uthevede området (A) ble utvidet til å vise et bestemt peptid topp på en m /z 1483 Da grunn av dannelsen av et disulfid bro mellom GO-203 og MUC1-CD.
GO-203 blokker MUC1-CD Homodimerization
in vitro
MUC1-CD-sekvensen er begrenset til pattedyrarter har dukket opp sent i evolusjonen [6]. Den CQCRRK sekvens er konservert hos rotte, hund og humane proteiner (figur 5A). Et protein sekvens homologi analyse ved hjelp Clustal Omega videre vist at menneskelig MUC1-CD (AAA60019.1) aksjer betydelig sekvens homologi på 83% med MUC1-CD proteiner av rotte (AAI66505) og hund (NP_001181906.1) (figur 5A). For å vurdere den funksjonelle betydningen av CQCRRK, vi genererte renset Hans-taggede rotte MUC1-CD protein (~ 10 kDa) (figur 5B). Inkubasjon av rotte His-MUC1-CD ved pH 7,4 var assosiert med dannelsen av ~ 20 kDa homodimerer (figur 5B). Videre tillegg av GO-203 på økende mengder i forhold til Hans-MUC1-CD redusert homodimerization (Fig 5B). Dog og menneske Hans-merket MUC1-CD proteiner også dannet homodimerer som ble effektivt hemmet av GO-203 (figur 5C og 5D). I motsetning til dette, CP-2-peptid, som omfatter AQARRKN, hadde ingen effekt på human MUC1-CD homodimerization (figur 5D).
(A) menneske, rotte og hund MUC1-CD-proteiner har høy sekvenshomologi så justert ved hjelp Clustal Omega. De konserverte regioner er vist i boksene, med den røde boksen som angir CQCRRK regionen. (B) rotte og (C) hund renset Hans-MUC1-CD-proteiner ble inkubert med PBS (kontroll) eller økende mengder av GO-203 (50, 150 og 450 uM) i 1 time ved romtemperatur. Proteinene ble separert i en ikke-reduserende polyakrylamid-gel og analysert ved immunblotting med anti-MUC1-C. (D) Renset human His-MUC1-CD-protein ble inkubert med PBS (kontroll), CP-2 (150 uM) eller GO-203 (150 pM) i 1 time ved romtemperatur. Proteinene ble separert i en ikke-reduserende polyakrylamidgel og analysert ved immunoblotting med anti-MUC1-C.
GO-203 blokker MUC1-CD Homodimerization i Cells
For å vurdere ytterligere effektene av målretting MUC1-CD CQCRRK motiv i celler, transfektert vi 293T celler til å uttrykke rotte GFP-merket eller FLAG-merket MUC1-CD (figur 6A, venstre). Coimmunoprecipitation studier viste at FLAG-MUC1-CD danner dimerer med GFP-MUC1-CD (figur 6A, høyre). Spesielt behandling av de transfekterte 293T celler med GO-203 ble forbundet med hemming av FLAG-MUC1-CD /GFP-MUC1-CD komplekser (fig 6A, høyre). I motsetning behandling med CP-2 ikke hadde noen tilsynelatende effekt (figur 6A, til høyre). Transfeksjon av 293T celler til å uttrykke merket hund MUC1-CD (figur 6B, venstre og høyre) eller menneskelig MUC1-CD (figur 6C, venstre og høyre) bekreftet dannelsen av MUC1-CD homodimerer. Videre GO-203 behandling resulterte i inhibering av MUC1-CD homodimerization (figur 6B, 6C og høyre, høyre). I tillegg demonstrasjonen at CP-2 behandling har ingen effekt på MUC1-CD homodimerdannelse støttet spesifisitet rettet mot CQC motiv (fig 6B, rett og 6C, høyre).
293T celler ble transient transfektert til uttrykke en tom vektor og (A) rotte GFP-MUC1-CD og FLAG-MUC1-CD, (B) hund GFP-MUC1-CD og FLAG-MUC1-CD eller (C) human GFP-MUC1-CD og FLAG-MUC1 -CD. Etter 48 timer ble cellene ubehandlet (kontroll) eller behandlet med 5 uM GO-203 eller CP-2 hver dag i 3 dager. Cellene ble deretter høstet for immunblotting med anti-GFP og anti-FLAG (venstre panel). Helcellelysater ble også utfelt med anti-FLAG og bunnfallet ble immunoblottet med de angitte antistoffer (høyre panel).
Binding av GO-203 til Endogene MUC1-C i Cells
For å finne ut om GO-203 medarbeidere med endogen MUC1-C, vi behandlet ZR-75-1 brystkreftceller med FITC-GO-203. Analyse av anti-MUC1-C utfellinger av immunblotting med anti-FITC indikerte at GO-203 danner komplekser med MUC1-C (figur 7A). Lignende studier utført på FITC-GO-203-behandlet H1975 lungekreftceller gitt ytterligere støtte til ideen om at GO-203 medarbeidere med endogen MUC1-C (figur 7B). MUC1-C er uttrykt som en ~ 25-20 kDa N-glykosylert form og som 17/15 kDa glykosylerte arter [6,8]. I tillegg er MUC1-C påvisbart som homodimerer og høyere ordens oligomerer under ikke-reduserende betingelser som anvendt i disse forsøkene [8]. I denne sammenheng og som vist i hele immunoblots oppnådd fra de resultatene som er presentert ovenfor (figur 7A og 7B), samvirker FITC-GO-203 med de forskjellige MUC1-C-monomere og oligomere former (S2A og S2B Fig). Å definere lokalisering av GO-203 /MUC1-C komplekser, ble immunfluorescens micoroscopy utført på 293T celler transfektert til å uttrykke DsRedMN1-merket MUC1 og /eller behandlet med FITC-GO-203. Kontroll 293T celler inkubert med Hoechst fargestoff for å farge kjerner hadde ingen påviselig DsRed eller FITC signaler (Fig 7C). I motsetning i celler transfektert for å uttrykke DSRedMN1-MUC1, de DsRed signalene ble hovedsakelig er lokalisert langs cellemembranen med noen få prikker detekterbare i kjernen (figur 7D). I 293T celler behandlet med FITC-GO-203 alene, ble FITC signalene lokalisert langs membranen og i cytosol (fig 7E). Videre, i 293T celler som uttrykker DSRedMN1-MUC1 og behandlet med FITC-GO-203, ko-lokalisering av DsRed og FITC-signaler (rød + gul grønn →) ble observert langs membranen (figur 7F). Den lysere FITC-GO-203 farging i 293T-celler som uttrykker MUC1 sammenlignet med den i den MUC1-null-innstillingen kunne forklares ved retensjon av FITC-GO-203 i komplekser med MUC1-C på cellemembranen.
(A) ZR-75-1 og (B) H1975-celler forble ubehandlet (kontroll), og behandlet med 5 mM FITC-GO-203 over natten. Lysis ble utført i en ikke-reduserende buffer. Lysater ble utfelt med anti-MUC1-C eller et kontroll IgG fulgt av tilsetning av ikke-reduserende prøvebuffer. Bunnfallet ble immunoblottet med anti-FITC og anti-MUC1-C. 293T-celler ble ubehandlet (C, kontroll), (D) transient transfektert med DsRedMN1-MUC1, (E) behandlet med 5 mM FITC-GO-203, eller (F), transfektert med DsRedMN1-MUC1 og behandlet med 5 uM FITC- GO-203. Fordeling av MUC1 (rød) eller FITC-GO-203 (grønn) og colocalization (gul) ble vurdert ved immunofluorescens-mikroskopi. Kjerner ble kontra med Hoechst fargestoff (blå).
Diskusjoner
MUC1-C transmembrane subenhet samhandler med RTK, som for eksempel EGFR, på celleoverflaten og bidrar til deres aktivering og nedstrøms intracellulære signalveier [6,19,23]. Følgelig har det vært økende interesse for funksjonen til MUC1-C cytoplasmatiske domene som et oncoprotein. I denne sammenheng, overekspresjon av MUC1-C cytoplasmatiske domene er tilstrekkelig til å gi forankrings-uavhengig vekst og tumorigenisitet [5]. Hvordan MUC1-C cytoplasmaområde induserer transformasjon har vært gjenstand for stor studie; Men lite er kjent om strukturen av denne onkogene protein. De foreliggende studier således undersøkte de fysiske egenskapene til 72-amino-syre cytoplastic domene og viser at, bortsett fra den CQCRRK sekvens bosatt i tilknytning til cellemembranen, det gjenværende av dette proteinet ikke har noen åpenbar struktur.
Fraværet av identifiserbare alfa-helikser eller beta ark var av interesse i at MUC1-C cytoplasmaområde sekvenser nedstrøms CQC motivet er gjenstand for fosforylering av flere kinaser som inkluderer blant andre EGFR, MET, SRC, ABL, gsk3 og PKC [ ,,,0],1,4]. I sin tur, disse posttranslasjonelle modifikasjoner regulere interaksjoner av MUC1-C cytoplasmaområde med effektorer av ulike signalveier som er forbundet med transformasjon [1,4]. Som ett eksempel, fosforylering av MUC1-C cytoplasmatiske domene overfører binding til WNT pathway effektor, β-catenin, og derved aktivering av wnt målgener [5,24]. Annet arbeid har knyttet den MUC1-C cytoplasmaområde til aktivering av NF-kB p65 [25,26] og STAT1 /3 [27,28] trasé. På denne måte den iboende uordnede strukturen i MUC1-C cytoplasmatiske domenet har tilsynelatende kapasitet til å gjennomgå forskjellige post-translasjonelle modifiseringer og for å kommunisere med flere effektorer.
Proteiner med egen uordnede strukturer finnes i hele genomet og omfatter onkoproteiner, så som p53 [29], PTEN [30], androgen receptor [31] og andre [14]. Disse proteinene kan by på utfordringer for legemiddelutvikling gitt fraværet av lommer eller veldefinerte tredimensjonale folder [14]. Derfor har vi fokusert på design av agenter som retter seg mot CQC motiv, basert på de observasjoner som endogene MUC1-C danner homodimerer og CQC cysteinene er nødvendig og tilstrekkelig for dette samspillet [7,8]. Videre fant vi at muterende CQC motiv til AQA avskaffet kapasiteten MUC1-C for å fremme transformasjon [7]. De foreliggende resultater viser at en L-aminosyre [R]
9-CQCRRKN-inneholdende peptid (GO-202) binder direkte til MUC1-C cytoplasmatisk domene. Interessant nok ble lignende resultater oppnådd med en D-aminosyre [R]
9-CQCRRKN peptid (GO-203), i samsvar med en retro Inverso effekt der CQC motivet er flankert på begge sider av basiske aminosyrer. Spesifisitet av disse cystein-mediert interaksjoner ble bekreftet i studier som viser at muterende CQC å AQA i MUC1-C cytoplasmaområde eller i CP-2 kontroll peptid avskaffet bindende.
I konsert med direkte binding til MUC1- C cytoplasmaområde CQC motiv, GO-203 var effektive i å forstyrre MUC1-CD homodimerer in vitro. I tillegg GO-203 behandling hemmet dannelsen av GFP-MUC1-CD /FLAG-MUC1-CD homodimerer i cellene, i samsvar med intracellulære binding av GO-203 til tagget-MUC1-CD monomerer og dermed blokkerer tilgjengeligheten av MUC1-C cytoplasmaområde CQC motiv for homodimerdannelse. I denne forbindelse, og viktigere, coimmunoprecipitation studiene videre viste at FITC-GO-203 medarbeidere med endogen MUC1-C i bryst og lunge kreftceller. Videre konfokale studier indikerte at GO-203 binder seg hovedsakelig til MUC1-C på cellemembranen. Disse funnene kollektivt støtter forestillingen om at GO-203 binder seg til MUC1-C cytoplasmaområde CQC motiv i cellene og dermed blokkerer MUC1-C homodimerization og funksjon.
