Abstract
Bakgrunn
Nylig har det blitt fornyet interesse for sammenhengen mellom kolesterol og prostatakreft. Det er tidligere blitt rapportert at
in vitro
, prostatakreftceller mangler sterol-mediert feedback regulering av de store transkripsjonsfaktor i kolesterolhomeostase, sterol-regulerende element bindende protein 2 (SREBP-2). Dette kan forklare den akkumulering av kolesterol ble observert i kliniske prostatakreft. Derfor har opprørt tilbakemeldinger regulering av økte sterol nivåer bli en gjennomgripende begrep i prostatakreft innstillingen. Her ønsket vi å utforske dette i større dybde.
metodikk /hovedfunnene
Etter å endre mobil kolesterol status i LNCaP og PC-tre prostata kreft celler, vi undersøkte SREBP-2 behandling, nedstrøms virkninger på promoteraktivitet og ekspresjon av SREBP-2 målgener, og funksjonell aktivitet (lipoprotein opptak lav tetthet, kolesterolsyntese). Ved å gjøre dette, observerte vi at LnCap og PC-3-celler var følsomme for økte nivåer sterol. I motsetning til å senke kolesterolnivået via statin behandling generert et større respons i LNCaP celler enn PC-3 celler. Dette fremhevet en viktig forskjell mellom disse cellelinjene: basal SREBP-2 aktivitet ut til å være høyere i PC-3 celler, redusere følsomhet for redusert kolesterolnivået
Konklusjon /Betydning
Dermed. prostatakreftceller er følsomme for endring sterol nivåer
in vitro
, men omfanget av denne forskriften skiller mellom prostatakreftcellelinjer. Disse resultatene kaste nytt lys over regulering av kolesterol stoffskiftet i to brukte prostatakreftcellelinjer, og understreker viktigheten av å etablere hvorvidt kolesterol homeostase er gjennomtrengt på prostatakreft
in vivo
.
Citation: Krycer JR, Kristiana jeg, Brown AJ (2009) Kolesterol Homeostasis i to brukte Menneskelig Prostate Cancer Cell-Lines, LNCaP og PC-3. PLoS ONE 4 (12): e8496. doi: 10,1371 /journal.pone.0008496
Redaktør: Immo A. Hansen, New Mexico State University, USA
mottatt: 26 oktober 2009; Godkjent: 03.12.2009; Publisert: 30.12.2009
Copyright: © 2009 Krycer et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. AJB forskning er støttet av et stipend fra Prostate Cancer Foundation of Australia (PR36, https://www.prostate.org.au). JRK er mottaker av Petre Foundation stipend (https://www.petrefoundation.org.au). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
studiet av kolesterol homeostase i en prostatakreft (PCA) innstilling begynte i 1942, da Swyer publisert
in situ
funn av forhøyet kolesterolnivå i benign prostatahyperplasi i forhold til normalt vev [1] . Mer nylig har det blitt fornyet interesse for sammenhengen mellom kolesterol og PCa [2] – [4]. For eksempel har det blitt foreslått at en grundig forståelse av kolesterol regulering ved PCA progresjon kan føre til utvikling av nye narkotika mål [5]. I tråd med dette, har flere epidemiologiske studier har rapportert en sammenheng mellom bruk av statiner (kolesterolsenkende legemidler) og redusert risiko for avansert PCa (anmeldt i [2] – [4]).
Kolesterol har en viktig innflytelse på membranintegritet, signalering, og stoffskiftet, og derfor er det behov for å regulere nivåene i cellen [2]. En stor homeostatisk mekanisme skjer på transkripsjonsnivået, via master transkripsjonsfaktor: sterol-regulerende element bindende protein 2 (SREBP-2). Reguleringen av denne transkripsjonsfaktor er gjennomgått av Brown og Goldstein [6]. I korthet er SREBP-2 syntetisert som en forløper, bundet til det endoplasmatiske retikulum (ER). Når kolesterol nivåene er lave, er SREBP-2 transporteres fra ER til Golgi-apparatet, hvor den er behandlet for å frigjøre den N-terminale domene. Det modne formen av SREBP-2 vandrer inn i kjernen, hvor det oppregulerer cholesterogenic gener, slik som de som koder for low-density lipoprotein receptor (LDLR) og 3-hydroksy-3-metylglutaryl-koenzym A-reduktase (HMGCR). Dette fremmer opptaket og syntesen av kolesterol til kolesterolnivået er tilstrekkelig, hvoretter SREBP-2 fastholdes i ER, hindrer dens aktivering og således downregulating mål genekspresjon. Dette sterol-avhengige feedback mekanisme regulerer også SREBP-1a /c isoformer. Generelt SREBP-1c fortrinnsvis oppregulerer fettsyre-syre-relaterte gener, SREBP-2 er rettet mot kolesterol-relaterte gener, og SREBP-1a kan aktivere både [7], [8].
Det er blitt foreslått at at denne tilbake regulering av SREBP-2 som mangler i PCa, gjennom den observasjon at behandling med steroler redusert SREBP-2-target-genekspresjon, så vel som lav tetthet lipoprotein (LDL) opptak i normale celler, men ikke i PC-3 og DU145 PCA celler
in vitro product: [9]. Forstyrrelser i sterol-mediert tilbakemeldinger vil forklare opphopning av kolesterol i PCA prøvene [10], [11], og har blitt en allment akseptert begrep i PCA innstillingen (anmeldt i [3], [4]). Denne feilregulering innebærer at PCA celler, og kanskje kreftceller generelt (for eksempel [9], [12] – [15]), er et spesielt tilfelle i at de ikke er i samsvar med det for tiden holdt paradigmet av cellulær kolesterol homeostase [16]. En akkumulering av kolesterol i cellen vil, for eksempel, avstive mitokondriemembranen, redusere oksidativ fosforylering – dette fremmer glykolyse selv i nærvær av oksygen (i Warburg-effekten [17]), et metabolsk fenotype ofte observert i kreftceller og av stor interesse for kreftforskning [18].
Formålet med undersøkelsen var å utforske kolesterol regulering i større dybde i to brukte PCA cellelinjer, PC-3 og LNCaP, ved hjelp av en rekke forhold og tilnærminger. Vi søkte å bekrefte tidligere funn av SREBP-2 aktivitet blir upåvirket av steroler [9], og finne ut om denne feilregulering påvirker responsen i PCA celler til reduserte sterol nivåer. Fra våre resultater, tilbyr vi et nytt perspektiv på kolesterol homeostase i disse PCA cellelinjer, har implikasjoner for både laboratorieforsøk og PCa terapi.
Resultater
Sterol-mediert regulering av SREBP-2 målgener eksisterer i prostatakreftceller
for å undersøke sterol regulering av SREBP-2 i første omgang, analyserte vi mRNA uttrykk av to SREBP-2 målgener (
LDLR
,
HMGCR
) ved manipulering av kolesterol status av PC-3 og LNCaP-celler. Forsøk ble utført under lipoprotein-manglende tilstander (med lipoprotein-manglende føtalt kalveserum [FCLPDS]) for å forsterke effekten av behandling av cellene med 25-Hydroxycholesterol (25-HC), et oksygenert kolesterol-derivat (oxysterol), og LDL. LDL-kolesterol leverer via LDLR, presentere et fysiologisk alternativ for å øke intracellulære nivåer sterol.
Ved regulering av SREBP-2 er til stede, tilsetning av steroler, gjennom enten 25-HC eller LDL behandling, vil redusere SREBP- 2 behandling og SREBP-2 mål genuttrykk. På den annen side, statin Compactin (også kjent som mevastatin) hemmer HMGCR, som katalyserer et hastighetsbegrensende trinn i kolesterolsyntesen, og således bør øke SREBP-2-aktivitet. De ikke-cancerøse cellelinjer, prostata epitelceller (Prec) og fibroblaster (FB), tjente som en kontroll, viser begge former for feedback regulering (fig. 1A). Ligner sterol-mediert regulering ble også observert i PCA cellelinjer (Fig. 1a), i motsetning til tidligere funn [9].
Celler ble behandlet med statin Compactin (CPN, 5 mm), oxysterol 25 -HC (1 pg /ml), eller LDL (50 ug /ml) i 24 timer. Cellular RNA ble høstet og mRNA uttrykk for
LDLR Hotell og
HMGCR
gener ble analysert ved QRT-PCR. De mRNA-nivåer ble gjort i forhold til kjøretøyets tilstand, som beskrevet i Materialer og Metoder. Dataene er gjennomsnitt + SEM fra 3 separate eksperimenter for hver cellelinje. Hvert eksperiment ble utført med triplikatbrønner pr tilstand. (A) Dataene presenteres separat for hver celle-linje. *
p
0,05, **
p
0,01, to-utvalg
t
-test versus kjøretøyets tilstand. (B) av data fra (A) er overlagt for hvert gen, representert som gjennomsnitt ± SEM for hvert datapunkt. PCA cellelinjer er representert med heltrukne linjer, mens de ikke-PCA cellelinjene er representert med stiplede linjer.
I PC-3 celler, øker cellulær sterol status med 25-HC eller LDL betydelig redusert lipogenic genekspresjon, i forhold til kjøretøyets tilstand (fig. 1A). Likheten mellom kjøretøy- og Compactin-behandlede PC-3-celler er usannsynlig på grunn av motstand mot Compactin, siden vi har funnet at Compactin inhiberer kolesterolsyntesen i PC-3-celler med metabolsk merking (data ikke vist). I motsetning til dette, Compactin betydelig økt lipogenic genekspresjon i LNCaP-celler og sterol-behandlede LNCaP-celler hadde lignende uttrykk bevegelser til de bæremiddelbehandlede celler (Fig. 1A). Ligger over de relative mRNA-ekspresjon data fra hver cellelinje (Fig. 1B) viste at PCA-celler (heltrukne linjer) hadde en redusert respons til Compactin forhold til Prec-celler, og ble mindre påvirket av LDL enn både ikke-PCA cellelinjer . Likevel, disse PCA cellelinjer var begge følsomme for endringer i kolesterol status.
Sterol-mediert regulering er spesifikk for SREBP-2
Gitt at uttrykket av to SREBP-2 mål gener (
LDLR
,
HMGCR
) reagerte på samme måte som endrer kolesterol status (fig. 1), søkte vi mer direkte bevis på at denne effekten ble formidlet av SREBP-2 transkripsjonsfaktor.
Siden modne SREBP-2 binder seg til sterol regulerende element (SRE) innenfor en target genet promoter-regionen, har vi utviklet en SRE spesifikke luciferase assay, utnytte LDLp-588luc plasmid [19], som koder ildflue luciferase under transkripsjonen regulering av
LDLR
promoter. Ved hjelp av seterettet mutagenese, forstyrret vi SRE innenfor promoter-regionen for å generere en negativ kontroll plasmid, LDLp-mutSRE. Vi fant at villtype-promotor (LDLp-588luc) oppviste de forutsagte endringer i luciferase-aktivitet (som øker med Compactin behandling, reduseres med 25-HC eller LDL-behandling), mens den mutante promoter (LDLp-mutSRE) produsert ubetydelige endringer (Fig . S1). Mutanten promoter luciferaseaktivitet ble subtrahert fra den til villtype-promotoren for hver behandling betingelse for å oppnå SRE-spesifikk aktivitet. Dette luciferase-analysen viste at feedback regulering skjedde i PCA-cellene i respons til endrede kolesterolnivåer (Fig. 2A).
(A) Celler ble transfektert som beskrevet i Materialer og Metoder. Behandlingen omfattet statin Compactin (CPN, 5 uM), oxysterol 25-HC (1 pg /ml), eller LDL (50 ug /ml) i 24 timer. SRE-spesifikk luciferaseaktivitet ble bestemt som beskrevet i Materialer og Metoder, og normalisert til kjøretøyets tilstand. Villtype og mutant promoter-verdiene er vist i fig. S1. Dataene er gjennomsnitt + SEM fra 3 separate eksperimenter for hver cellelinje. Hvert eksperiment ble utført med triplikatbrønner pr tilstand. *
p
0,05, **
p
0,01, to-utvalg
t
-test versus kjøretøyets tilstand. (B) av data fra (A) er blitt belagt, stilles som gjennomsnitt ± SEM for hvert datapunkt. PCA-cellelinjer som er representert ved heltrukne linjer, mens de ikke-PCA cellelinjer som er representert ved stiplede linjer. (C) Cellene ble behandlet med CPN (5 pM) eller 25-HC (1 pg /ml) i 24 timer. Cellelysater ble utsatt for SDS-PAGE og Western utslettet med IgG-1C6 anti-SREBP-2 antistoff. Den C-terminale spaltningsprodukt av SREBP-2, SREBP-2 (C), er merket med en pil – vi antar at bandet under er en ikke-spesifikk band. Sondering for α-tubulin fungert som en intern lasting kontroll. Blottet vist er representative for minst 2 separate forsøk for hver cellelinje.
i LNCaP-celler, SRE-spesifikk aktivitet (Fig. 2A) først på mer følsomme enn SREBP-2-target-genekspresjon ( fig. 1) for å sterol behandling. Følgelig ligger over dataene for hver cellelinje (Fig. 2B) viste at hver cellelinje ble påvirket på samme måte av sterol behandling. I motsetning til dette, Compactin behandling igjen demonstrert at PC-3 og LNCaP-celler skiller seg i den utstrekningen av deres homeostatiske reaksjoner: SRE-spesifikke aktivitet ble betydelig øket i LNCaP-celler sammenlignet med de ikke-PCA-cellelinjer (stiplede linjer), i motsetning til PC-3 celler (fig. 2B). Interessant, i prec celler, responsen på Compactin (fig. 2A) ble avstumpet i forhold til SREBP-2-target-genekspresjon (Fig. 1A). Dette tyder på at andre transkripsjonsfaktorer kan påvirke effekten av SREBP-2 på mål-genekspresjon, rettferdiggjøre bruken av den SRE-spesifikke luciferase-assay.
imidlertid SREBP-1a isoform binder seg også til de samme skjelettrelaterte hendelser som SREBP-2 med sterk affinitet [7], komorbid disse resultatene. Derfor, vi testet om denne effekten var SREBP-2-spesifikke ved Western blotting. Siden IgG-1C6 anti-SREBP-2-antistoff binder til den C-terminale ende [20], registrerer den C-terminale spaltningsprodukt, gir en indikasjon på SREBP-2 prosessering. For eksempel vil steroler fremme retensjonen av SREBP-2 forløper i ER [21], reduserende spaltet SREBP-2. Vi fant at 25-HC redusert SREBP-2 spalting i alle tre prostata cellelinjer, mens Compactin øket SREBP-2 spalting i Prec og LNCaP-celler, men ikke i PC-3-celler (fig. 2C). Således er graden av SREBP-2 behandling korrelert til regulering av promoter-aktivitet (Fig. 2A, B) og SREBP-2-target-genekspresjon (Fig. 1) ble observert i disse PCA-cellelinjer. Samlet sett viser disse dataene at PC-3 og LNCaP cellene er både følsomme for steroler, men varierer i sine svar til Compactin behandling.
Endringer i SREBP-2 aktivitet sette til funksjonsnivå i PCA celler
for å se om transkripsjonsregulering utøver homeostatiske effekter på kolesterol stoffskiftet i PCA celler, undersøkte vi effekten av å endre sterol status på LDLR aktivitet og kolesterol syntese.
aktiviteten av LDLR ble bestemt ved hjelp av en LDL opptaksanalyse . Etter inkubering med DII-LDL (LDL merket med fluorescerende fargestoff DII), den etterfølgende fluorescens i cellene gitt en indikasjon av LDL-opptak. Siden LDL internaliseres ved 37 ° C, men ikke 4 ° C, [22], hvert forsøk ble utført to ganger samtidig, med ett sett med celler inkubert med DII-LDL ved 37 ° C og den andre ved 4 ° C – forskjellen i fluorescens mellom de to settene gitt et mål på internalisert DII-LDL. Dette kontrolleres også for ikke-spesifikk binding av DII-LDL. Denne analyse viste at, i forhold til kjøretøyets tilstand, 25-HC forårsaket en signifikant reduksjon i DII-LDL internalisering i alle celletyper (fig. 3A). I kontrast, Compactin økt LDLR aktivitet i LNCaP celler bare, har ingen signifikant effekt i PREC celler og forårsaker en reduksjon (riktignok ikke signifikant,
p
= 0,08) i PC-3 celler (fig. 3A).
Cellene ble behandlet med statin Compactin (CPN, 5 uM) eller oxysterol 25-HC (1 pg /ml) i 24 timer i medium C (A) Celler ble fremstilt, behandlet og analysert for DII -LDL intern som beskrevet i materialer og metoder. Mengden av DII-LDL internalisert gir en indikasjon på LDLR aktivitet. Data er presentert som gjennomsnitt + SEM fra minst 3 separate eksperimenter for hver cellelinje. Hvert eksperiment ble utført med triplikatbrønner pr tilstand. (B) Etter behandling ble cellene vasket med PBS og radiomerket med [1-
14C] -eddiksyre i 2 timer. Radiomerking ble utført i nærvær av behandling, med unntak av CPN behandling (i hvilket tilfelle CPN var fraværende). Cellene ble deretter høstet og lipid ekstrakter ble underkastet tynnsjiktskromatografi og phosphorimaging som beskrevet i Materialer og Metoder. De phosphorimages vises er representative for minst 3 separate eksperimenter for hver cellelinje. Tetthetsmåling ble utført, og dataene presentert som gjennomsnitt + SEM for hver cellelinje. *
p
0,05, **
p
. 0,01, to-utvalg
t
-test versus kjøretøyets tilstand
For å bestemme kolesterolsyntesen, ble cellene radioaktivt merket etter behandling. Den 25-HC behandling ble opprettholdt gjennom radiomerking, mens Compactin behandling ble fjernet – siden Compactin vil redusere kolesterolsyntesen, vi i stedet forsøkt å simulere «statin rebound effekt «[23]. Dette fenomenet er en homeostatic svar på Compactin: normalt, øker Compactin SREBP-2 behandling (figur 2B.), Oppregulering uttrykk for kolesterol syntetiske enzymer. Følgelig, når Compactin er fjernet, på grunn av de høye nivåer av enzymer som er tilstede, vil det være en stor fluks gjennom reaksjonsveien. Dette fører ironisk nok en akutt økning i kolesterolnivået. Dette kan observeres i Prec og LNCaP-celler (fig. 3B). Imidlertid Compactin forbehandling overraskende redusert kolesterolsyntese i løpet av radiomerking i PC-3-celler (fig. 3B). Til tross for dette, 25-HC opphevet kolesterolsyntesen i alle tre cellelinjer (Fig. 3B).
Til sammen utgjør disse data viser at reguleringen av både kolesterol opptak (via LDL) og syntese er følsomme for sterol nivåer i PCA celler.
Basal SREBP-2 aktivitet er høyere i PC-3 celler enn i LNCaP celler
Mens både PC-3 og LNCaP cellelinjene er sterol-responsive, SREBP-2 -aktivitet i PC-3-celler viste mindre følsomme overfor det reduserte kolesterolnivå (Compactin behandling, fig. 1, 2). Disse forsøk ble utført under lipoprotein-manglende forhold (Medium C), mens en to-gangers økning i SRE-spesifikke aktivitet ble observert med Compactin behandling (i forhold til kjøretøyet behandling) under full-serum betingelser (Fig. 4). Dette tyder på at det i PC-3 celler, er Compactin effekten maskert av «metning» av SREBP-2 behandling i lipoprotein-mangel media, slik at ytterligere kolesterol deprivasjon via Compactin behandling ville ha liten effekt. Dette innebærer videre at PC-3-celler ikke er ufølsomme for Compactin
per se
, men krever mindre sterol savn å maksimere SREBP-2-aktivitet i forhold til andre cellelinjer, inkludert LNCaP-celler.
PC-3-celler ble transfektert som beskrevet i Materialer og Metoder. Behandlingen omfattet statin Compactin (CPN, 5 uM) eller oxysterol 25-HC (1 pg /ml) i 24 timer, enten i hel-serum (medium A) eller lipoprotein-fattig serum (Medium C). SRE-spesifikk luciferaseaktivitet ble bestemt som beskrevet i Materialer og Metoder, og normalisert til kjøretøyets tilstand. Data er gjennomsnitts + SD, representative av 2 separate eksperimenter. Hvert forsøk ble utført med tredoble brønner per tilstand.
Denne viktige forskjellen mellom LNCaP og PC-3 celler ble undersøkt videre. Som en case-studie ble grunnlinjen regulering og aktivitet av LDLR vurdert under lipoprotein-mangelforhold, fra forsøkene beskrevet i figurene 1-3. For det første ble mRNA uttrykk data vurderes: A C
t-verdier for en terskel på 10
-1.5 normaliserte fluorescens enheter ble sammenlignet mellom PC-3 og LNCaP celler. De C
t-verdier for husholdningsgenet, porphobilinogen deaminase (
PBGD
), var like i de to cellelinjene (
p
≈0.73), begrunner denne sammenligningen. Den gjennomsnittlige
LDLR
A C
t-verdien var ca. 2 enheter lavere i PC-3 celler, noe som indikerer en fire ganger høyere basal
LDLR
mRNA uttrykk enn LNCaP celler (Fig. 5A) . Deretter basal LDLR aktivitet var også signifikant høyere i PC-3-celler (fig. 5B).
Data ble samlet fra forsøk hvor LnCap og PC-3-celler som mottas kjøretøy behandling i medium C i 24 timer. (A) For hver QRT-PCR eksperimenter, A C
t-verdier (for terskel = 10
-1.5 normalisert fluorescens enheter) for
LDLR
genet, i forhold til
PBGD
husholdningsgenet, ble vurdert. Ekspresjon er representert som et gangers endring (i forhold til PC-3-celler), hvorved en ett-enhet økning i A C
t resulterer i en to-gangers reduksjon i mRNA-ekspresjon. Data er presentert som gjennomsnitt + SEM fra minst 4 separate forsøk for hver cellelinje. (B) Rå LDL-opptaket målt ved fluorescens normalisert med proteininnholdet i LDL-opptaksanalyse, var i gjennomsnitt mellom eksperimenter og gjøres i forhold til PC-3-celler. Data er presentert som gjennomsnitt + SEM fra minst 3 separate eksperimenter for hver cellelinje. (C) For hver SRE-spesifikk luciferase-analysen, den ildflue /
Renilla
luciferase forhold som genereres fra LDLp-mutSRE plasmid ble normalisert til den av LDLp-588luc plasmid. Data presentert som gjennomsnitt + SEM fra minst 5 separate forsøk for hver cellelinje. Hvert eksperiment i (A) – (C) ble utført med triplikatbrønner pr tilstand. *
p
0,05, **
p
0,01, to-utvalg
t
-test versus PC-3 celler. (D) En modell som viser forskjellene i kolesterolhomeostase mellom PC-3 og LNCaP-celler. Terskelnivået av cellulær kolesterol, ved hvilket SREBP-2-aktivitet blir dramatisk redusert, kan være høyere i PC-3-celler. Dette ville redusere effekten av statiner, i forhold til basal tilstand.
Sammen med fig. 2C, innebærer dette at basal SREBP-2 aktivitet er høyere i PC-3 celler. Imidlertid kan andre transkripsjonsfaktorer også bidrar til ekspresjonen av SREBP-2 målgener. Derfor tidligere SRE-spesifikke luciferasepreparater eksperimenter ble gjen analysert. For bilens tilstand, den relative luciferase aktivitet generert av LDLp-mutSRE (mutert SRE i
LDLR
promoter) ble ansett som en del av den for LDLp-588luc (villtype
LDLR
promoter) . Den mutSRE-Fluc luciferaseaktivitet ble antatt å representere ikke-SRE aktivitet siden Compactin og 25-HC behandling hadde liten effekt på LDLp-mutSRE aktivitet i alle cellelinjer (Fig. S1). Den mutSRE-Fluc /LDLR-Fluc andelen var høyere i PC-3 celler enn LNCaP celler (Fig. 5C), noe som tyder på andre transkripsjonsfaktorer kan også bidra til forskjeller i
LDLR
mRNA uttrykk observert mellom disse celle- linjer (fig. 5A). Samlet utgjør disse data tyder på at basal aktivitet nedstrøms SREBP-2 er oppregulert i PC-3 celler, noe som resulterer i en maksimal respons i henhold basale forhold.
Diskusjoner
I denne undersøkelsen har vi søkt å få innsikt i mobilnettet kolesterol homeostase i PCA innstillingen. En avvikende feedback-respons til steroler synes å være et vanlig fenomen i kreftceller [9], [12] – [15] og ville forklare akkumulering av kolesterol i klinisk PCa [10], [11]. Våre funn tyder på at sterol-regulert behandling av SREBP-2 eksisterer i PCA-celler (fig. 2C). Følgelig sterol feedback regulering hadde nedstrøms effekter ved SRE (Fig. 2B), ved ekspresjon av SREBP-2 målgener (Fig. 1B), og på den funksjonelle nivå (fig. 3). Vi vurderte også responsen av disse cellene til reduserte sterol nivåer, finne at PC-3 og LNCaP celler avvek i deres grad av regulering (Fig. 5).
I PC-3 celler, steroler forårsaket en betydelig nedgang i SREBP-2 aktivitet, i konflikt med tidligere funn [9]. Foruten metodiske hensyn, for eksempel kvantitative versus semi-kvantitative metoder for mRNA besluttsomhet, kan andre faktorer står for avviket med sine funn. For eksempel har det blitt vist at colonic adenokarsinomceller var upåvirket av steroler ved høyere tettheter, men viste feedback regulering når belagt ved lavere densiteter [14]. Celler ved lavere tettheter er eksponentielt voksende, med høyere kolesterol opptak og syntese priser som finnes i både kreft og normale celler [14], [24]. Dette kan gi rom for avstemming av funnene her med de av den forrige studien [9], spesielt siden deres eksperimenter ble kjørt for en lengre varighet (30 og 45 h, mot 24 timer her). Vi belagt PC-3-celler med lav tetthet, for å forhindre overconfluence etter 48 timer, og fant følsomhet for steroler opp til 48 h (fig. S2).
På samme måte, steroler ble funnet å redusere SREBP-2-aktivitet in LNCaP-celler (fig. 2). Her var det en liten nedgang i SREBP-2-target-genekspresjon (fig. 1), mens kolesterolopptak og syntese ble opphevet (fig. 3). Dette støttes av en tidligere funn at steroler downregulated ekspresjonen av HMG-CoA-syntase, en annen SREBP-2 målet, i LNCaP-celler [25]. Derfor PCA cellene er faktisk følsomme for økt sterol nivåer. Dette opphever ikke ideen om å forstyrres sterol-tilbakemelding i PCA-celler, men snarere reiser flere spørsmål: do laboratorium PCA cellelinjer som akkumuleres kolesterol som er sett i klinisk PCa [10], [11]? Ville PCA-celler være mindre følsomme overfor steroler i en
in vivo
sammenheng, for eksempel i xenotransplantater? Klart, tilsier dette videre etterforskning.
Vi har også undersøkt omvendt situasjon, redusere kolesterolnivået ved hjelp av statin Compactin. I likhet med Prec celler, denne økede SREBP-2-aktivitet (Fig. 2), forsterket SREBP-2-target-genekspresjon (fig. 1), og induserte en statin-rebound effekt i kolesterolsyntesen (fig. 3B) i LNCaP-celler. Interessant, Compactin ikke påvirke LDLR aktivitet i Prec-celler (fig. 3A), mens det har vært foreslått at statiner reduserer blod-kolesterolnivåene ved å øke LDLR uttrykket (her sett i fig. 1 A) og således LDL-opptak [26]. Denne tilsynelatende paradoks kan forklares siden PCSK9 (proprotein konvertase subtilisin /Kexin type 9), en annen SREBP-2-target, er blitt funnet å fremme LDLR degradering, noe som begrenser effektiviteten av statiner [27], [28]. LNCaP cellene ser ut til å omgå denne reguleringsmekanisme (fig. 3A), viser økt LDLR aktivitet på Compactin behandling. Alt i alt viser dette at LNCaP-celler svare på lave nivåer sterol.
I motsetning til dette ble Compactin ikke føre til en betydelig økning i SREBP-2-target-genekspresjon (fig. 1) i PC-3-celler, i forhold til kjøretøyets tilstand. Compactin ble bekreftet å hemme kolesterol syntese av metabolsk merking. Derfor, er mangelen på Compactin effekt sannsynligvis på grunn av nær-maksimal SREBP-2-behandling fra inkubering i lipoprotein-manglende media (fig. 4). Som støtter dette, basalnivåer av behandlede SREBP-2 ser ut til å være høyest i PC-3-celler (fig. 2C), og basal LDLR ekspresjon og aktivitet var høyere i PC-3 enn LNCaP-celler (Fig. 5A, B). Dermed PC-3 celler krever mindre sterol deprivasjon for å påkalle en maksimal respons fra SREBP-2 veien. Videre Compactin behandling tendens til å redusere LDLR aktivitet (Fig. 3A) og forbehandling senket kolesterol syntese (Fig. 3B), av grunner som er foreløpig uklart.
Derfor PC-3 og LNCaP celler varierer i deres kolesterol homeostase. Radhakrishnan
et al.
[29] foreslår en «slå-lignende kontroll» av SREBP-2 aktivitet, der et kraftig fall i SREBP-2 behandling oppstår når intracellulær (ER-) kolesterol nivåene når et nøyaktig terskel. Vi foreslår at dette «regulatoriske måler» er høyere i PC-3 celler (fig. 4D), sto for en) PC-3 celler med høyere basal SREBP-2 enn LNCaP celler, 2) statiner vises å ha liten effekt i PC- 3-celler (i forhold til den basale tilstand), og 3) steroler reduserende SREBP-2-aktivitet i både PCA-cellelinjer.
Denne forskjellen i kolesterol regulering kan tilskrives andre fenotypiske forskjeller mellom disse cellelinjene, slik som androgen respons. LNCaP-celler androgen-følsomme [30], mens PC-3-celler er forholdsvis androgen-uavhengig [31]. Androgener har blitt vist å oppregulere ekspresjon SCAP, deretter økende SREBP-2-aktivering [32]. Siden en mangel på feedback regulering ble tidligere observert i androgen-uavhengig PCA-cellelinjer (PC-3, DU145) [9], er det blitt hevdet at forstyrret sterol tilbakemeldingen kan være forbundet med androgen deprivasjon fordi SREBP-2 ble oppregulert i LNCaP xenografter
in vivo
på verten kastrering [33]. Men dette kan ikke forenes med våre resultater siden PC-3 celler ble funnet å være sterol-sensitive her. Likevel kan en faktor involvert i androgen-uavhengighet favorisere PC-3 celler, potensielt øke baseline SREBP-2 aktivitet. Alternativt kan andre transkripsjonsfaktorer bidra til SREBP-2-target-genekspresjon (fig. 5C), slik som onkostatin M-binding til SIRE (sterol-uavhengig responselement) i
LDLR
promotoren [34], forsterke basal kolesterol stoffskiftet i PC-3 celler. Videre undersøkelser er nødvendig for å avgrense de nøyaktige mekanismene som kolesterol homeostase forskjellig i disse PCA cellelinjer – i lys av dette, har en nyere artikkel rapportert forskjeller i transkripsjons profil mellom LNCaP og PC-3 celler [35], om enn ikke direkte relatert til kolesterol homeostase.
Derfor våre funn støtter påstanden om at disse to cellelinjer ikke kan behandles som synonymt eksempler på PCA cellelinjer for
in vitro
studier [35], [ ,,,0],36]. Det er imidlertid vanskelig å relatere disse funnene til en klinisk setting fordi, til det beste av vår kunnskap, har ingen studier undersøkte sterol-mediert regulering av SREBP-2 og kolesterol stoffskiftet i cellene isolert fra prostata prøver. I tillegg har det vært motstridende rapporter om ekspresjonsprofilen av PCa i en sterol-relaterte sammenheng. For eksempel i de senere studier som undersøker de skiftende profil med progresjon av metastatisk, hormon ildfast tilstand: noen studier funnet en økning i ekspresjon av SREBP-2 [37] og sterol-biosyntese-[38] gener, mens en annen har funnet en reduksjon [ ,,,0],39]. Slike konflikter kan skyldes forskjeller i pasientpopulasjoner, eksempel preparater, eller microarray plattformer (anmeldt i [40]).
Likevel har det blitt hevdet at LNCaP celler er mer karakteristisk for klinisk PCa enn PC-3 celler [41], [42]. Følgelig kan resultatene her har kliniske konsekvenser: i særdeleshet, LNCaP-celler har høyere LDLR aktivitetsnivået til Compactin behandling. Dette tyder på at behandling med et kolesterolsenkende legemiddel (for eksempel et statin) kan indusere LDL uptake spesielt i PCA celler. Dette innebærer at samtidig bruk av slike kreftspesifikke kjemoterapeutika, innlemmet i LDL eller andre LDLR-bindende vesikler [43], [44], kan gi en potensiell behandlingsalternativ for PCa.
Materialer og metoder
Materialer
ikke-kreft menneskelige PREC celler ble hentet fra Lonza (Mt Waverley, Vic, AU), human forhud FB celler var en gave fra Dr Ingrid Gelissen (University of New South Wales, AU)
