Abstract
microRNAs (mirnas) er korte (~22 nukleotider) regulatoriske RNA som kan modulere genekspresjon og er avvikende uttrykt i mange sykdommer, inkludert kreft. Tidligere studier har vist at mirnas inhibere oversettelse og lette nedbrytningen av deres målrettede messenger RNA (mRNA) som gjør dem attraktive kandidater for anvendelse i cancerterapi. Men den potensielle kliniske nytten av miRNAs i kreftbehandling hviler tungt på vår evne til å forstå og nøyaktig forutsi konsekvensene av svingninger i nivåene av mirnas innenfor rammen av komplekse tumorceller. For å evaluere prediktiv kraft av dagens modeller, ble nivåer av miRNAs og deres målrettede mRNA målt i laser fanget mikro-dissekert (LCM) ovarialcancer epitelceller (CEPI) og sammenlignet med nivåer som finnes i eggstokkene overflaten epitelceller (OSE). Vi fant ut at den antatte inverse sammenhengen mellom endringer i nivåene av mirnas og nivåer av deres mRNA mål holdt for bare ~11% av forventet mål mRNA. Vi viser at denne lave invers korrelasjon mellom endringer i nivåene av mirnas og sine mål mRNA
in vivo
er ikke bare en gjenstand av unøyaktige miRNA mål spådommer, men sannsynlig konsekvens av indirekte cellulære prosesser som modulerer de regulatoriske virkningene av miRNAs
in vivo.
Våre funn understreker kompleksiteten i miRNA-mediert regulering
in vivo Hotell og nødvendigheten av å forstå grunnlaget for denne kompleksiteten i kreftcellene før det terapeutiske potensialet i mirnas fullt ut kan virkelig .
Citation: Shahab SW, Matyunina LV, Mezencev R, Walker LD, Bowen NJ, Benigno BB, et al. (2011) Bevis for komplekst mikroRNA-mediert forordning Eggstokkreft: A Systems Approach. PLoS ONE 6 (7): e22508. doi: 10,1371 /journal.pone.0022508
Redaktør: Moray Campbell, Roswell Park Cancer Institute, USA
mottatt: 10 mars 2011; Godkjent: 27 juni 2011; Publisert: 21.07.2011
Copyright: © 2011 Shahab et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av Ovarian Cancer Institute, The Ovarian Cycle Foundation, The Robinson Family Foundation, The Deborah Nash Willingham Endowment Fund, The Waterfall Foundation og OBNET kvinner Healthcare. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
microRNAs (mirnas) er medlemmer av en rikelig klasse av små (~22 nts) regulatoriske RNA antas å spille viktige roller i en rekke biologiske prosesser og sykdommer i både planter og dyr [1]. Av nyere interesse, er det mulig bidrag av abnorme uttrykt mirnas til kreft initiering og utvikling [2], [3]. Tallrike
in vitro
studier har vist at mirnas er i stand til å inhibere translasjonen og /eller lette nedbrytningen [4], [5], [6], [7] fra deres målrettede mRNA som gjør dem attraktive kandidater for potensiell anvendelse i kreftterapi [8], [9]. Men den potensielle kliniske nytten av miRNAs i kreftbehandling hviler tungt på vår evne til å forstå og nøyaktig forutsi konsekvensene av svingninger i nivåene av mirnas innenfor rammen av tumorceller
in vivo
. Den generelle forventning at endringer i nivåene av mirnas vil bli inverst korrelert (IC) med endringer i nivåer av deres mRNA-mål [10], [11], [12], [13], [14] har ennå ikke entydig testes innenfor sammenheng med tumorceller
in vivo.
for eksempel, tidligere uavhengige estimater av relative miRNA nivåer i eggstokk-kreft sammenlignet med kontrollene har ofte vært inkonsekvent, muligens på grunn av forskjeller i prøvetypen (
f.eks
., bulk vevsprøver lignet med mikro dissekert-celler, etc.), biologiske variasjoner mellom forskjellige kreft sub-typer og individuelle pasientprøver (
f.eks
., [15], [16], [17], [18], [19], [20]) eller på grunn av unøyaktigheter i prediksjon av mRNA mål [21], [22].
i et forsøk på å redusere variasjonen som kan tilsløre biologisk signifikante trender, vi har gjennomført mikromatriser (Affymetrix) analyser av miRNAs og mRNA fra samme eggstokkreft epitel (CEPI) celler isolert fra pasientprøver med laser capture mikro-disseksjon (LCM). Vi overvåket forskjeller i nivåene av miRNA uttrykk mellom CEPI og eggstokkreft overflaten epitel (OSE) celler (hentet fra eggstokkene hos normale pasienter) med uttrykk nivåer av deres antatte mRNA mål som bestemmes av ulike prediksjon algoritmer og med eksperimentell validering. Mens eggstokkreft kan oppstå fra enten fimbrial epitel av egglederen eller OSE, har det nylig blitt vist at begge klasser av celler er en del av en overgangs epitel av felles opprinnelse og dermed enten kan tjene som en forløper til CEPI [23]. Siden OSE kan høstes fra overflaten av ovariene med minimal forurensning, ble de valgt som passende kontroller i vårt studium
Vi fant at bare ~11% av mRNA-mål å vise signifikant. (P 0,005) endring i nivået uttrykk i CEPI forhold til normal var IC med endringer i nivåene av sine regulerings mirnas (p 0,01). Nivåene av flertallet (~79%) av målet mRNA var uendret i CEPI mens resten (~ 10%) av mRNA målene vises endringer i nivåene positivt korrelert (PC) med sine respektive regulerings miRNAs. Vi konkluderer med at den lave forutsigbarheten miRNA regulatoriske effekter i CEPI isolert fra pasientprøver skyldes kompleksiteten av miRNA funksjon
in vivo
.
Resultater
De fleste miRNAs forskjellig uttrykt i CEPI forhold til OSE er oppregulert
Unsupervised hierarkisk clustering av uttrykket profiler av mirnas oppdaget på miRChip (Asuragen Inc, Austin, TX) ble utført på tre CEPI og tre OSE pasientprøvene (Figur 1, se tabell 1 for klinisk informasjon om prøvene). Den miRChip inneholder totalt 13,349 sonder inkludert 467 kommenterte menneske mirnas (Sanger miRBase v9.2 [24], [25], [26]), 455 mirnas kommenterte i ulike andre arter og 12,894 (utforskende) prober av spådd, men som ennå ikke validert /kommenterte miRNAs. Ved hjelp av en terskel på to ganger eller større forandring, ble 42 miRNA probene funnet å bli uttrykt forskjellig (p 0,01) mellom våre kreft og kontrollprøver. Av disse 33 ble oppregulert og 9 nedregulert i CEPI forhold til OSE, inkludert 12 tidligere kommenterte menneske mirnas (9 oppregulert og tre nedregulert). En varme kart over 42 forskjellig uttrykt miRNA sonder er presentert i figur 2a (miRNA sekvenser av disse 42 sonder, log
2 forskjell mellom CEPI og OSE, og p-verdier fra t-test er gitt i tabell S1). Til selvstendig teste gyldigheten av differensial miRNA uttrykk mønstre bestemt av microarray, gjennomførte vi målinger av miRNA nivåer med kvantitativ (real-time) polymerase chain reaction (qPCR). Fem (
MIR-141, MIR-429, MIR-205, MIR-383 og MIR-320
) av de 12 tidligere kommenterte menneskelige mirnas vist seg å være forskjellig uttrykt ved mikromatriser ble valgt for qPCR analyse av tre kreft og tre kontrollprøver. QPCR resultatene bekreftet forskjellene oppdaget i mikromatrisestudie (figur 2b).
En unsupervised hierarkisk clustering av CEPI og OSE prøvene ble utført ved hjelp av alle oppdagede probesets på Ambion miRChip array, uavhengig av differensial uttrykk. Probesets med standardavvik 0,5 tvers av alle prøvene ble fjernet før gruppering. Den clustering viser at CEPI og OSE prøver cluster i separate grupper, noe som tyder på avviket mellom gruppene er større enn at innen gruppene.
(A) Hierarkisk clustering av normale og kreft pasientprøver basert på forskjellig uttrykt mirnas mellom CEPI celler og OSE celler (p 0,01, ≥2fold endre). Den dendogram til venstre viser at sondene klynge i to grupper som tilsvarer de oppregulert og nedregulert mirnas forskjellig uttrykt mellom normal og kreft. IDer av utvalgte prober er gitt på høyre side (inkludert kommenterte menneskelige mirnas, se tabell S1 for en fullstendig liste). Key: HSA-MIR-x: kommenterte menneskelige mirnas; HSA-asg /cand-x: spådde kandidat menneskelige mirnas; ppy-:
Pongo pygmaeus
miRNA; cel-:
C. elegans
miRNA. (B) Bekreftelse av uttrykk mønstre for utvalgte mirnas av qPCR. Den relative uttrykk for hver miRNA i logaritmiske enheter i celler fra cancerpasienter 3 er vist sammenlignet med celler fra 3 normale eggstokkene etter normalisering til RNU6B (ΔΔCt metode). Disse ble funnet å være statistisk signifikante ved Relativ ekspresjon Software Tool (REST®) ved en randomiseringsmetode. Randomisering ble utført 5000 ganger. I samsvar med microarray resultater, ble MIR-141, MIR-205 og MIR-429 bekreftet å være signifikant oppregulert i kreft, mens MIR-320 og MIR-383 ble funnet å være signifikant nedregulert. Feilfelt representerer standard feil av gjennomsnittet.
I motsetning til enkelte tidligere studier [15], [16], [18], [19], [20], viser våre resultater at flertallet av miRNAs viser signifikante forskjeller i nivåene av uttrykk mellom CEPI og OSE er oppregulert i eggstokkreft. Grunnlaget for dette avviket er ukjent, men kan skyldes forskjeller i prøvetype (f.eks bulk vevsprøver vs mikro-dissekert celler, etc.) og /eller biologisk variasjon mellom individuelle pasientprøver. Våre funn at flertallet av mirnas blir oppregulert i eggstokkreft er i overensstemmelse med det faktum at miRNA mål er betydelig anriket (geometriske distribusjonen, s 0,05) blant mRNA nedregulert i våre kreftprøvene, mens opp-regulerte gener har relativt noen miRNA mål (Figur S1, varme kart som viser hierarkisk clustering av prøvene ved hjelp av alle probesets er presentert i Figur S2 og bruker bare forskjellig uttrykt mRNA i Figur S3, en liste over alle forskjellig uttrykt mRNA er presentert i tabell S2). En mulig biologisk forklaring på hvorfor mirnas er oppregulert i CEPI kan ligge i det faktum at i motsetning til andre kreftformer [27], [28], overgangen fra OSE til CEPI er antatt å innebære endringer fra en mindre differensiert til en mer differensiert tilstand [29], [30], [31].
Blant de 12 tidligere kommenterte mirnas viser en betydelig endring i nivåene i CEPI prøvene, MIR-205, MIR-141, og MIR-429 er alle signifikant oppregulert i overensstemmelse med tidligere studier som forbinder disse mirnas med vedlikehold av celler i differensiert tilstand epiteliale [32]. Av de mirnas som er nedregulert i CEPI forhold til OSE, MIR-320 og MIR-383 er lokalisert i områder knyttet til hyppig DNA kopi nummer tap i eggstokkreft [19]. MIR-320 tidligere er blitt identifisert som en inhibitor for lungekarsinom proliferasjon [33]. Sitt ned-regulering i CEPI tyder på at det kan fungere som en tumor suppressor i eggstokkreft også.
Bare ~11% av de antatte mRNA målene for mirnas forskjellig uttrykt mellom CEPI og OSE vise forventede inverse mønster av endringer i genekspresjon
Tidligere studier har fastslått at humane mirnas undertrykke genekspresjon ved sammenkobling med komplementære sekvenser som befinner seg i 3 «ikke-translaterte regioner (3»-UTR) av målrettede mRNA som resulterer i translasjonell undertrykkelse og mRNA degradering [6 ], [7]. Basert på disse funnene, er endringer i ekspresjonsnivåer av mirnas generelt forutsies å være inverst korrelert med forandringer i ekspresjonsnivåer av deres målrettede mRNA [10], [11], [12], [13], [14]. For å teste denne hypotesen i sammenheng med celler isolert fra pasientprøver, sammenlignet vi endringer i nivåene av de tidligere kommenterte menneske mirnas med nivåer av deres spådd målet mRNA i våre CEPI prøvene i forhold til OSE kontrollene. Den antatte mRNA målene for disse tidligere kommenterte menneske mirnas ble først identifisert ved hjelp av Miranda algoritme [34], [35], [36]. Resultatene indikerer at bare ~11% av endringer i mRNA-ekspresjonen mellom CEPI og OSE ble inverst korrelert (IC) med de observerte forandringer i miRNA nivåer (tabell 2 S3). Tidligere studier av nivåer av mirnas og deres målrettede mRNA i en rekke cellelinjer rapporterte tilsvarende resultater [13], [37], [38]. Uttrykket av flertallet (Ingen endring, NC: ~79%) av de anslåtte mRNA mål var ikke signifikant forskjellig (p 0,005 og /eller fold change 2) mellom CEPI og OSE prøver, mens ~ 10% av målrettede mRNA viste endringer positivt korrelert (PC) med sine putatively regulerings mirnas.
for å finne ut om den uventet lav prosentandel av IC endringer kan være en beregnings gjenstand av vår bruk av Miranda algoritme for å forutsi målrettede mRNA vi gjentok analysen uavhengig ved hjelp av PicTar (www.pictar.org) og TargetScan (www.targetscan.org) miRNA mål prediksjon algoritmer. I begge tilfeller, resultatene var i samsvar med vår opprinnelige funn at bare et mindretall av endringer i mRNA uttrykk mellom CEPI og OSE er omvendt korrelert (IC) med de observerte endringene i miRNA nivåer (PicTar: IC 9,4%, PC 10,1%, NC 80,5%, TargetScan: IC 10,4%, PC 10,3%, NC 79,3%, se tabell 3, S4 S5). For å øke nivåene av målet spådommer, reanalysert vi data ved hjelp av bare miRNA mål som ble mest spådd av alle tre algoritmer (krysset). Vi fant ut at ved å overlappe de tre uavhengige prediksjon algoritmer, hver miRNA hadde færre spådd mål, men bruker disse ofte spådd målene, ble bare ~ 7% av mRNA endringer mellom CEPI og OSE funnet å være omvendt korrelert (IC) med de observerte endringene i miRNA nivåer (tabell 4). Vi analyserte også våre data ved hjelp av kryss av spådommer fra to algoritmer gangen (Miranda + TargetScan, Miranda + PicTar, og PicTar + TargetScan), og igjen fant vi at endringer i nivåene av bare 6-9% av den anslåtte mRNA målene var omvendt korrelert med endringer i miRNA nivåer (tabell S6, S7 og S8).
Eksperimentell validering er antatt den strengeste metoden for å validere miRNA mål [39], [40]. Følgelig, for ytterligere å teste muligheten for at det lave omvendt korrelasjon mellom forandringer i miRNA nivåer og puls mRNA observert i vevsprøvene ble bare en refleksjon av den begrensede nøyaktighet av target prediksjon algoritmer, gjennomførte vi en serie av transfeksjonsteknikker eksperimenter ved bruk av to mirnas som var signifikant oppregulert i CEPI (MIR-7 og MIR-128) for å identifisere eksperimentelt validerte mål for disse mirnas i CEPI.
En rekke uavhengige transfeksjon eksperimenter ble utført med MIR-7, MIR-128 og et matchet sett av negative kontroll miRNAs i et veletablert eggstokkreft cellelinje (HEI) [41]. For å fastslå effektiviteten av våre transfections (positive kontroller), overvåket vi uttrykk nivåer av to tidligere bekreftet mRNA mål av MIR-7 (epidermal vekstfaktor reseptor, EGFR [42] og Mir-128 (B lymfom Mo-MLV innsetting regionen en homolog .., BMI1 [43]) regulering resultatene bekrefter effektiviteten av begge transfections (figur S4) RNA ble samlet inn fra celler etter transfeksjon og de relative nivåer av mRNA til stede ble bestemt av Affymetrix microarray-analyser (HG-U133 Plus 2.0; Bord S9 og S10).
i samsvar med resultatene fra CEPI vevsprøver, bare et mindretall av predikerte mRNA mål ble funnet å være betydelig redusert (IC) etter MIR-7 eller MIR-128 transfeksjon (tabell 5). Den spådd mRNA mål som var signifikant nedregulert i disse transfeksjon eksperimenter ble tatt som «eksperimentelt validert» mRNA mål av MIR-7 og MIR-128 kroner. Ved hjelp av bare disse målene, vi reanalysert microarray data fra vevsprøver og fant at bare vises ~8% (range 0-18%) av de «eksperimentelt validerte» mRNA mål endringer i uttrykk IC med endringer i MIR-7 og Mir-128 uttrykk i CEPI (tabell 6). Kollektivt Våre resultater tyder på at den lave omvendt korrelasjon mellom forandringer i nivåene i mirnas og deres mål-mRNA
in vivo
er ikke bare en gjenstand av unøyaktige mål-anslag, men snarere en refleksjon av kompleksiteten av miRNA funksjon i kreftceller.
Diskusjoner
Det er vel kjent at gener og deres mRNA produkter er gjenstand for en lang rekke myndighetskontroller. Det relative bidraget av feil i disse kontrollene til begynnelse og progresjon av sykdommer, så som kreft, kan varieres og komplisert [44]. mirnas og andre små ikke-kodende RNA nylig er blitt vist å være viktige regulatorer av genekspresjon, og avbrudd av miRNA ekspresjon har vært implisert i mange sykdommer, inkludert kreft [3], [45], [46], [47], [ ,,,0],48]. Mens det er velkjent at mirnas kan tjene som nyttige biomarkører for diagnostisering og oppsamling av en rekke forskjellige humane kreftformer (for eksempel [2], [49], [50]), den måte og i hvilken grad mirnas bidrar til prosessene liggende kreft er bare begynner å bli forstått [2], [45]. For eksempel ble regulerende funksjon av miRNAs i utgangspunktet antas å operere utelukkende på translasjonsforskning nivå [51], [52], men nyere funn har vist at disse små regulerings RNA også spille en rolle i modulering av mRNA stabilitet, og at disse to moduser av kontroll kan være inter-relaterte [7], [53]. Vi vet fortsatt ikke utelukke muligheten for at reguleringen av noen mål gener kan forekomme på translasjonsforskning nivå uten vesentlige endringer i mRNA nivå, og derfor kan ha blitt oversett i våre analyser.
Omfattende
in vitro
og
in vivo
studier tidligere har vist at menneske mirnas kan undertrykke genekspresjon ved sammenkobling med sekvenser som befinner seg i 3-utranslaterte regioner av målrettede messenger RNA (mRNA) som resulterer i translasjonell undertrykkelse og påfølgende mRNA degradering [1 ], [6], [7]. Så langt er det få eksempler på mirnas øker transkripsjon eller oversettelse av målgener [54], [55], noe som resulterer i positive sammenhenger mellom mirnas og målet mRNA. Derfor er et generelt holdt forventning om at endringer i uttrykket nivåer av mRNA blir omvendt korrelert med endringer i nivåene av deres målgruppe mirnas [56]. Men det faktum at enkelte mirnas kan målrette flere mRNA og at individuelle mRNA kan bli målrettet av flere mirnas skaper potensialet for et komplekst nettverk av interaksjoner i kreftceller replete med en rekke positive og negative tilbakemeldinger looper [57], [58] . I tillegg til det faktum at mirnas er velkjente målrette mRNA som koder for en rekke cellulære transkripsjonsfaktorer og andre regulerende proteiner øker sannsynligheten for at de direkte regulatoriske effekter av mirnas kan moduleres ved indirekte eller «nedstrøms» effekter innenfor rammen av kreftceller. Dette er ikke å si at mekanismene viste til grunn for miRNA regulering
in vitro
er virkningsløs
in vivo
, men heller at de funksjonelle konsekvensene av disse mekanismene kan maskeres og /eller modulert av regulatoriske kompleksiteten som kjennetegner kreftceller. I hvilken grad denne kompleksiteten kan redusere vår evne til å forutsi molekyl følge av endringer i nivåene av mirnas innenfor rammen av kreftceller har relevans til mulig bruk av miRNAs i kreftbehandling.
Formålet med vår studien var å evaluere i hvilken grad de molekylære konsekvenser av endringer i miRNA nivåer i kreftceller isolert fra pasient vev kan forutsies fra dagens modeller av miRNA funksjon. Det faktum at tidligere innsats for å få uttrykk profiler av mirnas og deres mRNA mål ble vanligvis utført på prøver tatt fra forskjellige pasienter og /eller fra blandede (bulk) vev har bidratt til inkonsistente funn (for eksempel [15], [16], [17], [18], [19], [20]). I et forsøk på å redusere eksperimentell variasjon, analysert vi endringer i nivåene av mirnas og deres målrettede mRNA i eggstokkreft celler isolert fra de samme pasientene ved LCM. Våre resultater tyder på at bare ~11% av endringer i nivåene av mRNA er IC med endringer i nivåene av de regulerende mirnas i samme eggstokkreft (CEPI) celler. For å eliminere muligheten for at våre resultater er bare en gjenstand av feilaktig identifiserte mRNA mål for miRNA regulering, vi gjentok våre analyser ved hjelp av målene spådd av en rekke prediksjon algoritmer, samt, mål eksperimentelt validert i en serie av transfeksjon eksperimenter utført i en veldokumentert ovarian cancer cellelinje (HEI). Våre resultater konsekvent støtter konklusjonen om at den forventede IC mellom endringer i miRNA nivåer og nivåer av sine mål mRNA forekommer relativt sjelden i eggstokkreft celler isolert fra pasientprøver og at denne lave omvendt korrelasjon er ikke bare en gjenstand av unøyaktige miRNA mål spådommer. Snarere Våre resultater tyder på at den lave omvendt korrelasjon mellom forandringer i miRNA nivåer og nivåer av sine mål mRNA er den sannsynlige resultat av indirekte cellulære prosesser som modulerer eller maskere regulerende effektene av mirnas
in vivo
. Våre funn understreker kompleksiteten i miRNA-mediert regulering
in vivo Hotell og behovet for bedre å forstå grunnlaget for denne kompleksiteten i kreftcellene før det terapeutiske potensialet i mirnas fullt ut kan virkelig.
Materialer og metoder
Vevsprøver
Eggstokktumorprøver var samlet på Northside Hospital (Atlanta, Georgia) under operasjonen og hurtigfrosset i flytende nitrogen innen 1 minutt av fjerning fra pasienter. Alle eggstokkene tumorprøver brukt i denne studien var fra pasienter diagnostisert med serøs papillær epitelial ovarialcancer. Tannpuss av normal eggstokk overflaten epitelceller (OSE) ble bevart umiddelbart i RNAlater (Ambion, Austin, TX). Pasient samtykke og godkjennelse fra Institutional Review styrene i Georgia Institute of Technology og Northside Hospital ble oppnådd. Den skriftlige samtykke og vår protokoll (# H09227) ble godkjent av IRB. Detaljert klinisk informasjon for hver pasient som brukes i denne studien er gitt i Tabell 1.
Laser fangst mikro-disseksjon (LCM)
Fersk frosset vev fra svulster ble kuttet i sju-mikron seksjoner, anvendt til ikke-ladet lysbilder, så fiksert i 75% etanol i 30 sekunder, farget og dehydrert bruker HistoGene LCM Frozen § Farging Kit (Arcturus, Mountain View, California). LCM ble utført med en AutoPix Automated Laser Capture mikrodisseksjon systemet med Media CapSure Makro Caps (Arcturus). Omtrent 10 000 celler ble fanget på hver av 5-6 caps per prøve. miRNA ble hentet fra fanget celler ved hjelp av Mirvana miRNA Isolation Kit (Ambion). mRNA ble isolert fra celler fra de samme pasientene som bruker PicoPure RNA Isolation Kit (Arcturus).
RNA ekstraksjon fra eggstokkene overflate epitelceller
For miRNA qPCR og microarray, normal eggstokkoverflate epitelceller var spunnet ned og resuspendert i lyseringsbuffer fra Mirvana miRNA Isolation Kit (for små RNA berikelse), etter produsentens anbefalte protokoll (Ambion). cDNA for qPCR ble syntetisert fra RNA (10 ng) ved bruk av TaqMan miRNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems, Foster City, California).
For mRNA qPCR og microarray total RNA ekstraksjon fra OSE ble utført ved hjelp av PicoPure RNA Isolation Kit, etter produsentens anbefalte protokoll (Arcturus). På grunn av begrenset antall celler hentet fra overflaten epithelial tannpuss, ble OSE RNA hentet fra 5 pasienter med ikke-maligne eggstokkene for mRNA microarray og fra to
forskjellige
sett av tre pasienter med non-maligne eggstokkene for miRNA (en satt for miRNA microarray, en annen for qPCR) (Se tabell 1 for mer informasjon om pasientopplysninger).
Kvantitativ (real-time) PCR
Total RNA (10 ng) hentet fra LCM fanget eggstokkene tumorceller og normale celler OSE ble omdannet til amplifisert cDNA for qPCR. TaqMan miRNA Analyser (Applied Biosystems) ble utført etter produsentens protokoll for HSA-MIR-141, HSA-MIR-429, HSA-MIR-205, HSA-MIR-320, HSA-MIR-383 og for RNU6B endogen kontroll med StepOnePlus real-Time PCR maskin (Applied Biosystems). Prime spesifisiteter for disse mirnas er tidligere påvist [58] – [63] og RNU6B er en tidligere etablert kontroll for human eggstokk-vev (https://www.ambion.com/techlib/tn/151/3.html; https://www3.appliedbiosystems.com/cms/groups/mcb_marketing/documents/generaldocuments/cms_044972.pdf). Statistisk signifikans ble bestemt ved anvendelse av den relative uttrykk programvare verktøyet (REST; [59])
For mRNA qPCR, ble total RNA (1-5 ug) ble ekstrahert fra celler omdannet til cDNA ved hjelp av Superscript First Strand III syntese. systemet (Invitrogen). cDNA ble deretter renset ved anvendelse av QIAGEN PCR-rensesett (Qiagen) ifølge produsentens instruksjoner. qPCR forsøk ble utført for EGFR, BMI1 og GAPDH genene ved hjelp iQ SYBR grønn Supermix (Bio-Rad, Hercules, CA). sekvensspesifikke primere som brukes for SYBR grønn analyser er som følger: EGFR-forward: GGAGAACTGCCAGAAACTGACC, EGFR-revers: GCCTGCAGCACACTGGTTG, GAPDH fremover: GGTCTCCTCTGACTTCAACA, GAPDH-revers: AGCCAAATTCGTTGTCATAC, BMI1 fremover: ACTTCATTGATGCCACAACC, BMI1-revers. CAGAAGGATGAGCTGCATAA The EGFR primere ble utformet som av [60] og GAPDH-primere ble utformet som av [61]. BMI1 primere ble oppnådd fra qPCR primer databasen RTPrimerDB [62]. GAPDH-primer-effektiviteten ble beregnet til å være ~ 1. spesifisiteten til den annen primere kan oppnås fra den relevante publikasjoner /database. Alle qPCR reaksjoner (for mRNA og miRNA) ble optimalisert med ikke-mal kontroller og -RT (minus revers transkriptase) styrer før eksperimentere. GAPDH ble valgt som endogen kontroll som det vises minimal endring mellom cellene transfektert med MIR-NC og MIR-7/128 i microarray.
Alle qPCR reaksjoner ble utført med minst 2 biologiske replikater og for hver biologisk replikere minst 3 tekniske replikater.
cellekultur og celle transfections
HEY celler ble gitt av Gordon B. Mills, Institutt for Systems Biology, University of Texas, MD Anderson Cancer Center. Cellene ble dyrket i RPMI 1640 (Mediatech, Manassas, VA) supplert med 10% volum /volum varmeinaktivert føtalt kalveserum (Invitrogen, Carlsbad, CA), 2 mM L-glutamin (Mediatech), 10 mM HEPES-buffer (Mediatech ), penicillin (100 U /ml), og streptomycin (100 ug /ml). Omtrent 12 timer før transfeksjon, disse cellene (duplikater eller tre paralleller pr transfeksjon, 1,5 x 10
5 per brønn) ble sådd ut i seks-brønns plater i dyrkningsmedium og tillatt å holde seg over natten ved 37 ° C i en 5% CO
2 atmosfære. Den påfølgende dagen etter vask brønnene med PBS og erstatte vekstmediet med Opti-MEM (Invitrogen) ble cellene transfektert med miRNA [HSA-MIR-7 miRIDIAN ligne, miRIDIAN miRNA etterligne negativ kontroll # 1 (MIR-NC, en
C. elegans
miRNA, cel-MIR-67, med bekreftet minimal sekvens identitet hos mennesker), eller HSA-MIR-128 miRIDIAN ligne (Thermo Fisher Scientific, Lafayette, CO)] med Lipofectamine 2000 transfeksjon middel ( Invitrogen) i henhold til produsentens instruksjoner ved en sluttkonsentrasjon på 25 nM. Celler ble inkubert i fire timer i denne redusert serum miljø for å optimalisere transfeksjon, ble vasket med PBS, og deretter inkubert ved 37 ° C og 5% CO
2 til 44 timer (totalt 48 timer) etter tilsetning av friskt vekstmedium til brønnene . Transfeksjon effektivitet ble beregnet fra den relative knock-down av tidligere validerte mål (EGFR for MIR-7 og BMI-en for MIR-128 [42], [43]), basert på anbefalinger av siRNA /miRNA reagenser produsent (Thermo Fisher Vitenskapelig). Cellekulturforsøk ble utført med minst to-tre uavhengige biologisk replikater.
Mikromatrise
Tissue mRNA microarray.
Biotin merket cRNA ble syntetisert, hybridisert til Affymetrix HG- U133 Plus 2,0 oligonukleotid arrays og analysert med en Genechip Scanner 3000 (Affymetrix, Santa Clara, CA).
HEY celle RNA isolering og mRNA microarray.
Total RNA ble isolert ved hjelp av RNeasy Mini RNA isolasjon kit (Qiagen, Valencia, CA) i henhold til produsentens instruksjoner. Integriteten til RNA ble bekreftet ved hjelp av en Agilent 2100 Bioanalyzer (1,8-2,0, Agilent Technologies, Palo Alto, California). mRNA ble konvertert til dobbel strandet (ds) -cDNA og forsterkes ved hjelp av Applause 3′-Amp System (Nugen, San Carlos, CA). Dette cDNA ble deretter biotin merket og fragmentert ved hjelp Encode Biotin Module (Nugen). Det merket cDNA ble hybridisert til Affymetrix HG-U133 Plus 2.0 oligonukleotid arrays og analysert med en Genechip Scanner 3000 (Affymetrix).
Mikromatrise dataanalyse
Tissue miRNA microarray dataanalyse.
Prøver for våre miRNA profilering studien ble behandlet av Asuragen Services (Austin, Texas), i henhold til selskapets standard operasjonsprosedyrer. En tilpasset-produserte Affymetrix GeneChip® fra Ambion er designet for å miRNA sonder som stammer fra Sanger miRBase og publiserte rapporter [24], [25], [26], [63], [64], [65]. Bakgrunnssignalet ble estimert fra antigenomisk probesekvenser levert av Affymetrix og avledet fra et større sett av kontroller som brukes på Affymetrix humane exon array. Spike-i eksterne referanse kontrollene var basert på ikke-miRNA kontroll sonder som mangler homologi til det menneskelige genom. Arrays innenfor en spesifikk analyse eksperiment ble normalisert i henhold til den variansen stabiliseringsmetode som er beskrevet i [66]. En Wilcoxon rank sum test ble benyttet for å bestemme deteksjons samtaler av miRNA probe signal i forhold til fordeling av signaler fra GC-innhold matchet anti-genomiske sonder.
En to-utvalgs t-test, med forutsetning om lik varians, ble brukt for statistisk hypotesetesting. Denne testen definert som prober er ansett for å være signifikant forskjellig uttrykt på grunnlag av en p-verdi på 0,01 og log
2 forskjell ≥1. Signal intensiteter fra disse forskjellig uttrykt prober ble z-poeng normalisert før hierarkisk clustering.
Unsupervised hierarkisk clustering av prøvene ble utført ved hjelp av Spotfire Decisionsite for microarray analyse (DSMA) basert på Z-score forvandlet signalverdier av alle probesets unntatt de med standardavvik 0,5.
