Abstract
Vi har tidligere rapportert at ekspresjon av Flotillin 2 (Flot-2), et protein isolert fra caveolae /lipid flåten domener, har økt betydelig i nasofaryngealt carcinom (NPC) sammenlignet med normalt vev. Signaltransduksjon gjennom epidermal vekstfaktor reseptorer (EGFR) og Flot-2 spiller en viktig rolle i utviklingen av kreft, men deres nøyaktige rolle i lungekreft er ikke undersøkt. I denne studien, har vi undersøkt sammenhengen mellom ekspresjonen av Flot-2 og EGFR, som øker betydelig i ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) pasienter (n = 352) sammenlignet med ikke-cancer vev. I tillegg kan pasienter med fremskredne stadier av NSCLC hadde høyere positivt uttrykk for Flot-2 og EGFR enn pasienter med tidlige stadier. NSCLC pasienter med økt uttrykk av Flot-2 og EGFR hadde signifikant mindre samlet overlevelse enn pasienter med mindre uttrykk for Flot-2 og EGFR. Tatt sammen, våre data tyder på at økt ekspresjon av Flot-2 og EGFR i NSCLC er omvendt proporsjonal med sykdomsprognosen og at økt ekspresjon av Flot-2 assosiert med øket EGFR kan tjene som en biomarkør for å forutsi dårlig sykdomsprognosen.
Citation: Wen Q, Wang W, Chu S, Luo J, Chen L, Xie G, et al. (2015) Flot-2 Expression korrelerer med EGFR Nivåer og dårlig prognose i Kirurgisk reseksjon ikke-småcellet lungekreft. PLoS ONE 10 (7): e0132190. doi: 10,1371 /journal.pone.0132190
Redaktør: Yves St-Pierre, INRS, CANADA
mottatt: 02.04.2015; Godkjent: 10 juni 2015; Publisert: 10. juli 2015
Copyright: © 2015 Wen et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er innenfor papir
Finansiering: Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra Riks Naturvitenskap Foundations of China (No: 81272566, 81472773).. (https://isis.nsfc.gov.cn/)
konkurrerende interesser:. forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Lungekreft er en av de viktigste årsakene til kreft relatert dødelighet på verdensbasis. Det er ca 80% -85% av lungekreft tilfeller diagnostisert med ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) i mange deler av verden, blant annet plateepitelkarsinom (SCC) og adenokarsinom (ADC) er de to store histologiske subtyper [1 ]. Derfor bør nye funn av biomarkører for å bestemme risikoen for forekomst, progresjon og metastase i NSCLC ha høy klinisk betydning. Den flotillin /reggie proteinet inneholder surperfamily to medlemmer, flotillin-1 /reggie-2 (flot-1) og flotillin-2 /reggie-1 (Flot-2), som begge er sterkt konserverte og begge Flot-1 og Flot-2 proteiner er allestedsnærværende uttrykt sammen med membran flåter [2,3]. Videre Flotillins er blitt foreslått å være involvert i membran reseptorsignalisering, signalveier assosiert med cellevekst og ondartet transformasjon, fagocytose og endocytose, celle-matrise-adhesjon, regulering av aktin cytoskjelettet og dannelse av filopodia [4,5]. Ekspresjon av Flot-2 er avhengige av hverandre og Flot-1-ekspresjonen blir sterkt redusert ved nedregulering av Flot-2 [6]. Økt uttrykk for Flotillins er påvist i flere typer kreft hos mennesker og knyttet til dårlig overlevelse. Over-ekspresjon av Flot-2 er assosiert med human melanoma progresjon og lymfeknutemetastase [7,8]. Høyere uttrykk for Flot-2 også påvises i metastatiske NPC celler [9]. Konsekvent, økte Flot-2-ekspresjon ble også rapportert i NPC pasienter med lymfeknutemetastaser sammenlignet med pasienter uten lymfeknutemetastase [10]. Dessuten øket ekspresjon av Flot-2 er assosiert med dårlig resultater hos pasienter med flere faste tumorer, slik som brystkreft, magekreft og cervikal karsinom, og Flot-2 kan brukes som en prognostisk biomarkør for disse tumorer progresjon [11-13 ].
EGFR er medlem av reseptortyrosinkinasehemming familie er involvert i reguleringen av cellulær proliferasjon og differensiering som er direkte sammenstilt med mRNA-transkript nivået av EGFR i NSCLC pasienter [14]. EGFR og tilhørende signalveien har dukket opp som en ledende mål for NSCLC behandling [15,16]. Interaksjonen har blitt funnet mellom Flotillins og EGFR i kreftceller og Flot-2 blir Tyr- fosforylert av Src-kinase basert på EGFR-aktivering [4]. I tillegg EGF stimulering resulterer i opptak av Flotillins fra plasmamembranen til slutten av endosomer [4]. Den formidler ikke bare den gruppering og aktivering av EGFR i plasmamembranen, men også fungerer som en MAP kinase stillas protein som regulerer MAP kinase signalering under senere trinn av reaksjonsveien [17]. Uttrykket av Flot-2 protein er oppregulert i de fleste NSCLC prøvene i forhold til normalt vev [18,19]. Imidlertid har dual uttrykk for Flot-2 og EGFR og dens forhold til utvikling og progresjon eller clinicopathologic /prognostisk innblanding i stor samling av NSCLC prøvene ikke blitt rapportert. I denne studien, vi har oppdaget flot-2 og EGFR proteiner ved immunhistokjemi (IHC) i 352 tilfeller av NSCLC og 59 tilfeller av ikke-kreft lunge kontroll vev, og undersøkt sammenhengene mellom uttrykket av Flot-2 og EGFR proteiner og clinicopathological funksjoner og prognostiske implikasjoner i NSCLC.
Materialer og metoder
Etikk erklæringen
Prøver ble oppnådd med informert samtykke og alle protokoller ble godkjent av The Second Xiangya Hospital of Central South University Etikk Review Board (vitenskapelig og forskningsetiske komité, nei. s02 /2000). Skriftlig informert samtykke ble innhentet fra alle pasienter, også skriftlig informert samtykke ble innhentet fra de pårørende, vaktmester, eller foresatte på vegne av mindreårige /barn deltakerne i studien.
microarray (TMA ) og kliniske data
NSCLC pasienter ble sendt til kirurgisk behandling ved Institutt for Thoracic Surgery på Second Xiangya Hospital of Central South University (Changsha, Kina) fra 2003 til 2013. Alle tumorprøver og ikke-kreft lunge vev ble hentet fra Avdeling for patologi, Second Xiangya Hospital of Central South University. Disse pasientene hadde blitt sendt til rutinemessig staging og definitive kirurgisk reseksjon av lunge og systematisk mediastinale lymfeknutetoalett. Alle pasientene hadde en bekreftet histologisk diagnose av NSCLC ifølge WHO histologisk klassifisering av lungekreft. Iscenesettelsen klassifisering av dagens analyse ble utført basert på kriteriene til syvende utgaven av AJCC /UICC TNM staging system for lungekreft (2009). Ingen av pasientene hadde tidligere blitt behandlet med kjemoterapi og radioterapi ved tidspunktet for opprinnelig drift. Komplett klinisk posten og oppfølgingsdata var tilgjengelig for alle pasienter. Skriftlig informert samtykke ble innhentet fra disse pasientene, og denne studien ble godkjent av etikk Review Committee av Second Xiangya Hospital of Central South University.
Immunohistochemistry og score
IHC farging for prøvene på den TMA ble utført med klar til bruk Envision TM
+ Dual Link System-HRP metoder (Dako, Carpintrria, CA). Fargingen betingelse for hvert antistoff ble justert i henhold til vårt laboratorium erfaring. Kort beskrevet, ble hver TMA seksjon deparaffinized og rehydrert, og høy temperatur antigen gjenfinning ble oppnådd ved å varme opp prøvene i 0,01 M citratbuffer i en nasjonal mikrobølgeovn ved full effekt (750 watt) i 30 minutter, deretter ble prøvene neddykket i metanol inneholdende 0,3% H
2o
2 for å inaktivere endogen peroksidase ved 37 ° C i 30 minutter. For å eliminere ikke-spesifikk farging, ble platene inkubert med passende preimmunserum i 30 minutter ved romtemperatur. Etter inkubasjon med en 1: 1000 fortynning av primært antistoff til Flot-2-protein (kanin polyklonalt antistoff, Catalog # S0051, Epitomics, Inc.) og med en 1: 200 fortynning av det primære antistoff (Novocastra NCL-EGFR-384-klonen , Leica Biosystems, Newcastle Upon Tyne, UK) ved 4 ° C over natten, ble objektglassene skylt med fosfatbufret saltvann (PBS) og inkubert med en merket polymer-HRP ble tilsatt i henhold til produsentens instruksjoner og inkubert i 30 minutter. Fargereaksjon ble utviklet ved anvendelse av 3, 3′-diaminobenzidin-tetraklorid (DAB) kromogen oppløsning. Alle lysbildene ble kontra med hematoksylin. Positive kontrollglass ble inkludert i hvert forsøk i tillegg til de interne positive kontroller. Spesifisiteten av antistoffet ble bestemt med matchet IgG-isotype-antistoff som en negativ kontroll.
Immunohistokjemisk farging av TMA-seksjoner ble bedømt uavhengig av QW og SF blindet til clinicopathological data, ved 200 x forstørrelse lysmikroskopi. Evalueringen var basert på fargeintensitet og graden av farging. Fargeintensitet for Flot-2 og EGFR ble scoret som 0 (negativ), 1 (svak), 2 (middels) og 3 (sterk). Farging utstrekning ble scoret som 0 (0%), 1 (1-25%), 2 (26-50%), 3 (51-75%), og 4 (76-100%), avhengig av prosentandelen av positive -stained celler. Summen av fargeintensitet og fargings grad score varierte fra 0 til 7, og cut-off nivåer for Flot-2 og EGFR ble valgt på basis av et mål på heterogenitet ved hjelp av log-rank test med hensyn på total overlevelse ( OS). En optimal cut-off-nivået ble identifisert som følger: en fargeindeks score på 0-2 ble anvendt for å definere tumorer med negativ uttrykk og 3-7 indikerte positive ekspresjonen av disse to proteiner. Avtalen mellom de to evaluatorer var 95%, og alle poeng avvik ble løst ved diskusjon mellom de to evaluatorer.
Statistisk analyse
chi-kvadrat test og Spearmans rang korrelasjonskoeffisient ble brukt til å evaluere forholdet mellom den Flot-2 og EGFR-ekspresjon i vevssnitt høstet fra NSCLC. Kaplan-Meier analyse ble utført for generelle overlevelseskurver og statistisk signifikans ble vurdert ved hjelp av log-rank test. Cox proporsjonal hazard regresjonsmodell ble brukt til å estimere uavhengige prognostiske faktoren Flot-2 og EGFR proteiner. Tosidig statistisk analyse ble brukt, og dataene ble ansett for å være statistisk signifikant når
P
. 0,05
Resultater
flot-2 og EGFR proteiner betydelig økt i vev av lunge SCC og ADC
for å utforske sammenhengen mellom Flot-2 og EGFR signalering i ondartet vev, vi først bestemt uttrykk og cellulær lokalisering av Flot-2 og EGFR i lunge SCC, ADC og ikke- kreftlungekontroll vev ved IHC. Sterk positivt uttrykk for Flot-2 protein (Fig 1A og 1B) ble identifisert på cellemembraner av lunge SCC og ADC vev og ingen Flot-2 uttrykker celler ble påvist i ikke-kreft lunge kontroll vev (figur 1C). Vevssnitt ved hjelp av avstemt IgG-isotype-antistoff som negativ kontroll viste heller ingen positiv farging av Flot-2 i lunge ADC-celler (figur 1D). Sterk positiv ekspresjon av EGFR-protein (figur 2A og 2B) ble identifisert på membraner og cytoplasma av lungen SCC og ADC-celler og ingen farging ble funnet i ikke-kreft lungevevet kontroll (figur 2C). Negativ kontroll hadde vist noen EGFR farging i lunge SCC-celler (figur 2D). Deretter nummerere vi ekspresjonen av Flot-2 og EGFR i lunge SCC, ADC og ikke-kreft kontroll lungevev. Uttrykk for både Flot-2 og EGFR var betydelig høyere i vev høstet fra pasienter med lunge SCC og ADC sammenlignet med ikke-kreft lunge kontroll vev (
P
0,001) (fig 3)
.
sterk positiv farging av Flot-2-proteinet ble funnet på cellemembraner av lunge SCC og lunge ADC celler (figur 1A og 1B, 20 x, IHC, DAB-farging). Negativ farging av Flot-2 ble vist i ikke-cancerous lungevevet (figur 1C, 20 ×, IHC, DAB farging). Negativ kontroll viste ingen Flot-to flekker i lunge ADC celler (figur 1D, 20 ×, IHC, DAB farging).
Sterk positiv farging av EGFR-proteinet ble funnet i cellemembraner og cytoplasma lunge SCC og lunge ADC celler (figur 2A og 2B, 20 x, IHC, DAB-farging). Negativ farging av EGFR ble vist i ikke-cancerous lungevevet (figur 2C, 20 ×, IHC, DAB farging). Negativ kontroll viste ingen EGFR flekker i lungen SCC celler (figur 2D, 20 ×, IHC, DAB farging).
Resultatene viste at det var signifikante forskjeller mellom gruppene som ble statistisk evaluert av kine- kvadrat test.
for å undersøke klinisk utfall på grunn av over-uttrykk for Flot-2 og EGFR i kreftvev, vi neste undersøkt clinicopathological funksjonene NSCLC inkludert alder, kjønn, kliniske faser, lymfeknute metastase (LNM) status, og patologisk differensiering i univariate chi-kvadrat test. Data er vist i tabellene 1 og 2 viser at en sterk positiv korrelasjon mellom høy ekspresjon av Flot-2 og de kliniske stadier av NSCLC. Viktigere, pasienter med avanserte kliniske stadier hadde signifikant høyere uttrykk av Flot-2 enn pasienter med tidlige stadier (
P
= 0,003). Lignende trend ble observert i tilfelle av EGFR uttrykk (
P
= 0,03). Imidlertid ble det ikke observert forskjeller mellom uttrykket av Flot-2 /EGFR og andre clinicopathological funksjoner som alder, kjønn, LNM status og patologisk differensiering av NSCLC.
Den parvise sammenheng mellom uttrykk for Flot-2 og EGFR proteiner i 352 tilfeller av NSCLC
Vi neste analysert parvis sammenheng mellom uttrykk for Flot-2 og EGFR i NSCLC pasienter (n = 352). Pasienter (n = 115) med co-uttrykk for Flot-2 og EGFR proteiner, 119 pasienter med felles negativ farging av to proteiner og 118 pasienter med positivt uttrykk for enten Flot-2 eller EGFR. Den økte uttrykk for Flot-2 var signifikant assosiert med økt uttrykk av EGFR (r = 0,332,
P
0,001 Spearman rank korrelasjon test). Disse data tyder på at Flot-2 og EGFR kan spille en viktig rolle i å fremme utvikling og progresjon av NSCLC.
Effekt av uttrykk for flot-2 og EGFR proteiner på prognosen for pasienter med NSCLC
i univariat overlevelse analyse av lunge SCC og ADC pasienter, Kaplan-Meier overlevelseskurve analyse med log-rank betydning testen ble utført. Kaplan-Meier-overlevelses plott (figur 4A, 4B og 4C) for lunge SCC pasienter med differensial ekspresjon av Flot-2 (figur 4A), EGFR (figur 4B), og kombinerte ekspresjon av en av disse to proteinene (figur 4C) var presentert. Kaplan-Meier overlevelses tomter for lunge ADC pasienter med differensial uttrykk for Flot-2 (fig 4D), EGFR (Fig 4E), og kombinert uttrykk for en av disse to proteiner (Fig 4F) ble presentert. De generelle overlevelse for lunge SCC og ADC pasienter med negative uttrykk for Flot-2 protein var betydelig høyere enn disse med positive Flot-2 uttrykk (
P
= 0,043, figur 4A;
P
= 0,007, figur 4D), samt den generelle overlevelse for lunge ADC pasienter med negative uttrykk av EGFR var bedre enn disse med positiv EGFR uttrykk (
P
= 0,033, figur 4E). I tillegg har de som lunge SCC og ADC pasienter med positiv uttrykk med en av flot-2 og EGFR proteiner hadde en lavere totale overlevelse enn pasienter med all negativ farging av to proteiner ovenfor (
P
= 0,02, fig 4C ;
P
= 0,005, figur 4F). Det ble imidlertid ingen signifikant sammenheng mellom uttrykk av EGFR og samlet overlevelse lagt merke til i lunge SCC pasienter (
P
0,05)
Kaplan-Meier analyse ble brukt til å plotte den generelle overlevelseskurver. av 159 tilfeller av lunge SCC og 193 tilfeller av lunge ADC pasienter med differensial ekspresjon av Flot-2, EGFR, og kombinerte ekspresjon av en av disse to proteinene, som statistisk signifikans ble bestemt ved log-rank test. (A) Lung SCC pasienter med positivt uttrykk for Flot-2 protein viste verre generelle overlevelse sammenlignet med pasienter med negativ Flot-2 (P = 0,043, tosidig). (B) Positiv uttrykk for EGFR hadde ingen signifikant korrelasjon med generelle overlevelse av lunge SCC pasienter (P 0,05, tosidig). (C) Kaplan-Meier-kurver viste lunge SCC pasienter med positivt uttrykk med en av Flot-2 og EGFR proteiner hatt verre generelle overlevelse enn de med all negativ farging av to proteiner ovenfor (p = 0,02, tosidig). (D) Lung ADC pasienter med positivt uttrykk for Flot-2 hadde verre samlet overlevelse enn at med negativt (P = 0,007, to, henholdsvis ensidig). (E) Lung ADC pasienter med positivt uttrykk for EGFR hatt verre generelle overlevelse enn at med negativt (P = 0,033, to, henholdsvis ensidig). (F) Lung ADC pasienter med positiv uttrykk med en av Flot-2 og EGFR proteiner viste verre generelle overlevelse sammenlignet med all negativ farging av to proteiner ovenfor (P = 0,005, tosidig).
Foruten univariat analyse, ble multivariat Cox proporsjonal hazard regresjonsanalyse også gjennomført til videre undersøke om de uttrykk for Flot-2 og EGFR proteiner er de uavhengige prognostiske faktorer for NSCLC, og disse resultatene ble avslørt i tabell 3. i multivariat analyse av uttrykk for flot-2 og EGFR proteiner i 159 lunge SCC tilfeller og 193 lunge ADC tilfeller, som inkluderte kliniske faser, lymfeknutemetastase status, histologisk type, behandlingsstrategi, alder og kjønn, har vi funnet at positivt uttrykk for Flot-2 protein kan tjene som et selvstendig dårlig prognostisk faktor for lunge ADC (
P
= 0,035), samt kliniske stadier (
P
= 0,02). For lunge SCC, er LNM status og histologiske karakterer identifisert som selvstendige dårlige prognostiske faktorer (
P
= 0,034,
P
= 0,019, henholdsvis). Igjen ble ingen klinisk effekt basert på alder, kjønn, behandlingsstrategi og uttrykk av EGFR påvist i lunge SCC og ADC.
Diskusjoner
Økende bevis har indikert at Flotillins involvert i EGFR signalveien. Aktivert EGFR kan endre størrelsen på Flotillins oligomerer [20]. I tillegg er Flotillins og EGFR proteiner coimmunoprecipitated, og Flotillins kunne regulere E-cadherin-mediert celle kontakt dannelsen ved å påvirke EGFR menneskehandel [17,21]. I vår nåværende studie har vi rapportert at uttrykk for Flot-2 og EGFR ble betydelig økt i lunge SCC og ADC sammenlignet med ikke-kreft lunge kontroll vev. Den økte uttrykk for Flot-2 var signifikant assosiert med økt uttrykk av EGFR i NSCLC når Spearmans rang korrelasjonskoeffisient ble gjennomført. Videre NSCLC pasienter med avanserte kliniske stadier hadde betydelig høyere positiv andel av Flot-2 uttrykk enn de med tidligere stadier. Fremfor alt, våre resultater er ikke bare i samsvar med tidligere publiserte data [18,19], men også bringe folk nye synsfelt. For det første, over-ekspresjon av både Flot-2 og EGFR ble funnet i NSCLC; For det andre, positiv sammenheng mellom uttrykk for Flot-2 og EGFR i NSCLC absolutt eksisterte; Endelig kan Flot-2 og EGFR spille en viktig rolle i å fremme utvikling og progresjon av NSCLC. Likevel er bare disse bevisene ikke nok til å trekke en sterk konklusjon; dermed videre undersøkelser vil være nødvendig for å tydelig demonstrere spesifikk mekanisme Flot-2 og EGFR i NSCLC, og det er det vi er i ferd med å studere i nær fremtid.
Selv om svulsten-node-metastaser (TNM ) staging system er den beste prognostisk indeks for operativ NSCLC [22], trenger biomarkører ikke bare spille overveldende viktig rolle i å etablere en nøyaktig diagnose, men også gi prognostiske data for NSCLC [23]. Derfor nye funn av biomarkører for å bestemme risikoen for forekomst, progresjon og tilnærminger for terapeutisk behandling av NSCLC er av ekstrem betydning for utvikling av terapeutiske strategier for å forbedre resultatet og overlevelse av NSCLC pasienter. Flot-2, som et målgen av p63 og p73, kommer fra p53 transkripsjonsfaktor familie [24], er foreslått som en prognostisk markør forbundet med dårlig prognose i flere humane tumorer, slik som brystkreft, magekreft, livmorhalskreft og så videre [11-13]. Men betydningen av Flot-2 i lungekreft var fortsatt sjelden rapportert. Forrige litteratur viste at bare to undersøkelser om Flot-2 som har blitt gjennomført i NSCLC til i dag. Men de har heller ingen observasjon om sammenhengen mellom over-uttrykk for Flot-2 og klinisk utfall samt dårlig overlevelse eller ingen beskrivelse om forskning på uttrykk mønster av EGFR forbundet med Flot-2 i lunge SCC og lunge ADC, henholdsvis [ ,,,0],18,19]. I vår nåværende studie, viste vi at både lunge SCC og ADC pasienter med økt uttrykk av Flot-2 hadde verre samlet overlevelse sammenlignet med pasienter med negativ Flot-2. Videre multivariat analyse viste at økt uttrykk av Flot-2 ble uavhengig faktor for dårlig prognose i lunge ADC pasienter uavhengig av kliniske stadier, histologiske typen, LNM status, histologiske klassetrinn, alder og kjønn. Våre resultater er ikke bare i samsvar med eller lignende med de tidligere publiserte data, men også foreslå at høyt uttrykk for Flot-2 kan delta i å fremme celle overlevelse og spredning og forbinder med dårlig prognose av lunge ADC pasienter. Derfor, økt ekspresjon av Flot-2 kan betraktes som en ny biomarkør for å forutsi dårlig prognose for lunge ADC-pasienter.
Såvidt EGFR er opptatt, har mange tidligere studier antydet at ekspresjon av høye nivåer av EGFR er det gjelder fremdrift, metastaser og dårlig prognose av kreftpasienter, men prediksjon kraften i denne enkelt reseptor for pasientenes utfall er kontroversielt. Rapportene om co-uttrykk av EGFR og andre proteiner i NSCLC ha en positiv synergistisk effekt på pasientenes utfall [25,26]. I vår nåværende studie positivt uttrykk for EGFR hadde signifikant korrelasjon med generelle overlevelse for lunge ADC pasienter. Videre lunge SCC og ADC pasienter med positivt uttrykk for en av Flot-2 og EGFR proteiner hadde en lavere totale overlevelse enn pasienter med all negativ farging av disse to proteiner. Derfor våre resultater antyder en viktig interaksjon mellom Flot-2 og EGFR intracellulær bane i progresjonen av NSCLC og høy ekspresjon av flot-2 og EGFR-protein kan ha en positiv synergistisk effekt på pasientens utfall.
I konklusjonen våre funn viste en positiv sammenheng mellom Flot-2 og EGFR nivåer i NSCLC vev. Ekspresjonsnivået av Flot-2-protein er korrelert med dårlig prognose både i lunge SCC og ADC pasienter som tyder på at Flot-2, assosiert med øket EGFR kan tjene som biomarkør for å indikere dårlig prognose og potensielt terapeutisk mål for NSCLC.
Takk til
Takk Dr Mohammad Sohrab Hossain og Runzhao Li MD for deres hjelp med den engelskspråklige redigering av manuskriptet.
