Abstract
Den høye dødeligheten av eggstokkreft kan tilskrives sent stadium diagnose og mangel på effektiv behandling. Til tross for enorm innsats for å utvikle bedre målrettet terapi, fortsatt platina-basert kjemoterapi standard vare for eggstokkreft kreftpasienter, og motstand oppstår ved høy hastighet. En av de hastighetsbegrensende faktorer for oversettelse av nye narkotikafunn i kliniske behandlinger har vært mangel på egnede prekliniske kreft modeller med høy prediktiv verdi. Vi har tidligere genererte genmodifisert mus (GEM) modeller basert på endringen av
TP53 Hotell og
Rb
med eller uten
BRCA1
eller
BRCA2 Hotell som utvikler serøs ovarialcancer (SEOC) tett ligner den menneskelige sykdommen på histologisk og molekylært nivå. Her beskriver vi en tilpasning av disse GEM modeller for å ortotopiske allografts som jevnt utvikle svulster med kort ventetid og er ideell for rutine prekliniske studier. Ovarietumorer mangelfulle i
BRCA1
responderer på behandling med cisplatin og olaparib, en PARP hemmer, mens
BRCA1
-wild typen svulster er ikke mottakelig for behandling, rekapitulere de relative følsom observert hos pasienter. Disse musemodeller gir mulighet for evaluering av effektive behandlingsformer, inkludert prediksjon av differensial responser i
BRCA1
-wild type og
BRCA1
-deficient svulster og utvikling av relevante biomarkører.
Citation: Szabova L, Bupp S, Kamal M, House DB, Hernandez L, Schlomer JJ et al. (2014) Pathway-Spesifikke Engineered Mouse allograft Modeller Funksjonelt rekapitulere Menneskelig Serous ovarialcancer. PLoS ONE 9 (4): e95649. doi: 10,1371 /journal.pone.0095649
Redaktør: Masaru Katoh, National Cancer Center, Japan
mottatt: 10 februar 2014; Godkjent: 28 mars 2014; Publisert: 18 april 2014
Dette er en åpen-tilgang artikkelen, fri for all opphavsrett, og kan bli fritt reproduseres, distribueres, overføres, endres, bygd på, eller brukes av alle for ethvert lovlig formål. Arbeidet er gjort tilgjengelig under Creative Commons CC0 public domain engasjement
Finansiering:. Dette prosjektet er finansiert i sin helhet med føderale midler fra National Cancer Institute, National Institutes of Health, under kontrakt nummer HHSN261200800001E. Innholdet i denne publikasjonen gjenspeiler ikke nødvendigvis synspunktene eller retningslinjer ved Institutt for helse-og omsorgs, heller ikke nevner av varemerker, kommersielle produkter, eller organisasjoner innebærer godkjennelse av den amerikanske regjeringen. Den Funder hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
eggstokkreft er den nest vanligste gynekologisk kreft og den hyppigste årsaken til gynekologiske kreftrelaterte dødsfall i USA [1], med over 50% presentere som serøs ovarialcancer (SEOC). De fleste avanserte SEOCs har spredt utover eggstokken ved diagnosetidspunktet, og deres forvaltning innebærer kirurgisk de-bulking, etterfulgt av kjemoterapi med en kombinasjon av platina og taxan legemidler [2], [3]. Til tross for i utgangspunktet høye responsrater, de fleste pasienter tilbakefall med en median progresjonsfri overlevelse på 18 måneder [4], noe som gjør jakten på nye behandlingsformer avgjørende.
I løpet av de siste årene mye fremgang har blitt gjort for å identifisere kjennetegn genetiske skader forbundet med SEOC. Kreft Genome Atlas (TCGA) studie av en stor høy klasse SEOC kohorten viste at mutasjoner i
TP53
vært dominerende, forekommer hos minst 96% av svulster [5]. Endringer i RB-nettverket ble observert i 67% av tilfellene, og ca 20% av svulstene hadde bakterie linje eller somatiske mutasjoner i
BRCA1 /2
med ytterligere 11% etter å ha mistet BRCA1 uttrykk gjennom epigenetisk stanse [5] .
BRCA1 og BRCA2 spille viktige roller i homolog rekombinasjon (HR), og tap av enten protein fører til mangel i dobbel tråd DNA pause (DSB) reparere [6]. I HR-mangel celler, er DSB sin reparert av feilutsatte mekanismer, som kan føre til genomisk ustabilitet. Kjemisk inhibering av enkelttrådede (ss) DNA-brudd-reparasjon i HR-manglende celler kan føre til syntetisk dødelighet på grunn av den samtidige fravær av to DNA-reparasjonsbaner [7], [8]. I klinikken, er poly (ADP) -ribose polymeraseinhibitorer (PARPi) gjennomgår evaluering som en fremgangsmåte for å utnytte syntetiske dødelighet for terapeutisk intervensjon. PARP-1 er nødvendig for identifisering av ssDNA pauser (SSB) og rekruttering av reparasjons proteiner til skadede områder [9]. Inhibering av denne prosessen i BRCA-manglende celler fører til akkumulering av DSB sin, på grunn av kollapset replikering gafler, og til slutt til celledød [10] – [12]. Basert på disse funnene, har PARPi blitt testet i kliniske studier som enkle eller kombinerte behandlinger hos pasienter med langtkomne solide tumorer [13] – [15]. Nylig, oralt aktiv PARPi, olaparib (AZD2281), viste kliniske antitumor aktivitet i BRCA-assosiert eggstokkreft og brystkreft [15] -. [19]
Så langt kliniske studier av nye terapeutiske midler har stolt på prekliniske studier utført på cellelinjer og immunkompromitterte cellelinje xenograft-modeller. Påfølgende høye feilrater i humane studier tyder på et behov for prekliniske modeller med bedre prediktiv verdi [20]. Genmanipulerte musemodeller (GEMMs) har viktige fordeler i forhold til cellelinje xenograft modeller, ved at svulstene er drevet av definerte genetiske hendelser og oppstår på grunn av opphopning av flere stokastiske hendelser i orgelet av interesse og er derfor underlagt relevant mikromiljøet og vert celle responser. Flere ovarialcancer GEMMs som utvikler svulster som ligner sykdom hos mennesker er rapportert [21] – [25]; Men har disse modellene ikke er skreddersydd for effektiv bruk i prekliniske studier, og få rekapitulere hele spekteret av genetiske og biologiske egenskaper ved menneskelig SEOC.
Tidligere rapporterte vi GEMMs som utvikler eggstokkreft med den genetiske og biologiske karakteristikker av menneskelige SEOCs [26]. Rettet mot eggstokkreft overflaten epitel, oppheving av RB svulst undertrykkelse (TS) initiert sykdom, og
TP53
aberrasjon (missense mutasjon eller sletting) lettere sykdomsprogresjon til aggressiv peritoneal formidling og metastasering. Ovarietumorer fra disse modellene, inkludert de som mangler enten
BRCA1
eller
BRCA2
, representerer alle 4 transkripsjonsklasser av menneskelig SEOC. Her bruker vi disse modellene for å skape ortotopiske immunocompetent transplanterte modeller, og til å generere synkroniserte årskull av mus som passer for prekliniske studier. For å avgjøre om disse modellene er medgjørlig for bruk i rutineeffektstudier og hvis deres terapeutiske svar reflektere observerte resultater i humane studier, vi utførte singel eller kombinasjonsbehandling med standard platina kjemoterapi og olaparib. Som observert hos pasienter, behandlingsrespons var avhengig av
BRCA1
status, og dermed demonstrere nytten av disse modellene i å vurdere potensialet effekten av nye behandlingsformer for kreft i eggstokkene.
Materiell og Metoder
forsøksdyr
Alle dyreforsøk ble utført i henhold til dyrestudie protokoll godkjent av Institutional Animal Care og bruk komité Frederick National Laboratory for kreftforskning og National Institutes of Health guide for omsorg og bruk av forsøksdyr. FNLCR er akkreditert av AAALAC International og følger Public Health Service Policy for omsorg og bruk av forsøksdyr. Animal omsorg ble gitt i samsvar med de prosedyrer som er skissert i «Guide for omsorg og bruk av forsøksdyr» (National Research Council, 1996; National Academy Press, Washington). Dyrene ble holdt i en barriere anlegget på FNLCR etter HEPA filtrering i mikro isolator bur og matet med autoklaveres laboratorium gnagerdiett (LabDiet, St. Louis, MO). Alle dyr prosedyrer ble utført under bedøvelse ved hjelp av innånding av 1-2,5% isofluran. Endepunktet for mus var endring i generell helse, spesielt 20% vekttap, manglende evne til å spise, drikke, eller ambulate, krum holdning, pustevansker eller tegn på nedkjøling, samt tegn på ascites med oppblåst mage og håndgripelig svulst ca 2 cm størrelse. Dyr som viste kliniske tegn, fast tumorvekst av 2 cm, eller ble døende før maksimal ascites ekspansjon (omtrentlig fordobling av bredden av abdomen) ble straks avlivet ved CO2-inhalering.
Detaljert musestamme informasjon og generering av adenovirally indusert SEOC modeller har blitt beskrevet tidligere [26]. Beige nude [Cr: NIH-bg-nu-XIDen], atymiske nakne [atymiske NCR-nu /nu] og FVB [FVB /NCR] hunnmus ble hentet fra Animal Production Program, FNLCR eller fra Jackson Laboratories [FVB /NJ ].
ortotopiske svulst transplantasjon
for å utføre orthotopic tumor transplantasjon, korsryggen av FVB hunner (5-8 uker gamle) ble barbert, ble dyrene bedøvet og huden ble aseptisk forberedt for kirurgi . En sideveis langsgående innsnitt ble gjort i flanken området overliggende den høyre eggstokk og en annen mindre innsnitt ble gjort i peritoneum. Den eksponerte eggstokk, med det omkringliggende fettputen, ble exteriorized og en liten donor tumor-fragment (ca. 2 mm) ble innsatt under bursa gjennom et lite kirurgisk rive. Eggstokkene ble erstattet tilbake i bukhulen, ble peritoneum sutureres og huden lukkes med metallklips.
Cellekulturer
Menneskelig ovarialcancer cellelinje HeyA8 var en gave fra Dr. Elise Kohn , NCI, og ble opprinnelig beskrevet i [27]; linjer 1A9 og cisplatin-resistente 1A9CP80 var gaver fra Dr. Tito Fojo (NCI), og ble hentet som i [28], [29];
BRCA1
mutant linje UWB1.289 ble innhentet fra ATCC (Manassas, Virginia). Alle ovarie linjene ble dyrket i RPMI (Life Technologies, Grand Island, NY) med 10% føtalt bovint serum (Hyclone, Pittsburg, PA) og standard antibiotika; 1A9CP80 celle medium ble supplert med 80 mM cisplatin (Tocris, Bristol, UK). En detaljert prosedyre for etablering av murine eggstokkreft cellelinjer er gitt i data S1.
In vitro
cytotoksisitetsassayer
Livskraftig av de vedlagte eggstokkreft celler ble vurdert ved hjelp av XTT som beskrevet [30]. I korthet ble cellene sådd ut i 96-brønners plater i en tetthet på 1-2,000 celler /50 ul /brønn og inkubert i 24 timer. Cisplatin (Tocris, Bristol, UK) og olaparib (AZD2281, Selleck Chemicals, Houston, Texas) ble utarbeidet i dimetylsulfoksid (DMSO) aksjer og brukes belagt celler fra nylagde arbeidsløsninger serielt fortynnet i mediet. Celler ble etterfylles med nye medikamenter etter 3 dager og levedyktighet ble bestemt etter 7 dager ved inkubasjon kulturer med XTT og måle absorbansen ved hjelp Tecan F200 plateleser (Research Triangle Park, NC). Celletetthet i behandlede brønner ble uttrykt som prosent av kontroll. Forsøk omfattet triplikate prøver og ble gjentatt minst tre ganger. IC50-verdier (konsentrasjoner som produserer tap av levedyktighet på 50% av cellene) ble beregnet ved lineær regresjon.
Prekliniske studier i mus
in vivo
studier, cisplatin (Tocris , Bristol, UK) ble rekonstituert i steril 0,9% saltløsning og injisert intraperitonealt, og olaparib (AZD2281, Selleck Chemicals, Houston, Texas) ble administrert oralt i kjøretøyet [PBS inneholdende 10% DMSO (Sigma, St. Luis, MO) og 10% (2-hydroksypropyl)-cyklodekstrin (Sigma, St. Luis, MO, USA)]. For de farmakodynamiske studier av mus med etablerte ortotopiske ovarietumorer (~0.5 cm i diameter) ble behandlet med: 1), cisplatin (5 mg /kg), n = 3; 2; 3 og 3 til linje 29255; 32233; 39877 og 30200; henholdsvis 2) olaparib (50 mg /kg), n = 1; 3; 2 og 3 for linje 29 255; 32233; 39877 og 30200; henholdsvis 3) cisplatin (5 mg /kg) etterfulgt av olaparib (50 mg /kg) 1 time senere, n = 3; 2; 2 og 2 for linje 29 255; 32233; 39877 og 30200; henholdsvis eller 4) kjøretøy, n = 2; 2; 2 og 1 for linje 29255; 32233; 39877 og 30200; henholdsvis, på dag 1. gruppene 2 og 4 har mottatt en annen dose av olaparib og gruppe 4 en annen dose av kjøretøyet 24 timer senere. Alle dyr ble avlivet på dag to, to timer etter siste dosering. Tumorvev ble samlet og PAR-nivåer ble målt ved anvendelse av HT PARP
in vivo
Farmakodynamisk analyse II (Trevigen, Gaithersburg, MD). Tumor lysatene ble fremstilt i henhold til produsentens instruksjoner og 2 mikrogram av totalt proteiner ble analysert.
For effekt og langsiktig behandlingsstudier dyr med palpable tumorer (~0.5 cm i diameter) ble fotografert og randomisert inn i 4 behandlingsgrupper, som beskrevet ovenfor, basert på tumorvolumet for å oppnå omtrent den samme fordeling av volumene i alle grupper. Cisplatin ble administrert intraperitonealt en gang i uken. Olaparib og kjøretøy ble administrert oralt i 5 påfølgende dager per uke. Dyr i effektstudier ble behandlet for 2 eller 3 uker, fotografert å oppfatte endringer i tumorvolum og avlives 2 timer etter olaparib /kjøretøy dosering. Dyr i langsiktig dosering studien ble behandlet i inntil 10 uker og avbildes annenhver uke ved hjelp av ultralyd (US) for å bestemme tumorvolum. De ble overvåket etter avsluttet behandling for svulst utvikling og ble avlivet når døende på grunn av tumorbyrde. Svulstvev ble samlet for histologisk analyse og immunhistokjemi (IHC).
genuttrykk profilering
Gene uttrykk profilering og sammenligning av murine og humane datasett ble utført som beskrevet tidligere [26]. Data for genuttrykk analyse av murine primær og avledet ortotopiske SEOC svulster er offentlig tilgjengelig på Gene Expression Omnibus database under tiltredelsen tall GSE51927.
Data S1 inneholde materiale og metoder for etablering av murine primær tumorcellelinjer, celle implantasjoner, bildebehandling og tumorvolummålinger, vev samling, patologisk og IHC analyse, kvantitativ analyse av IHC flekker, immunfluorescens farging av menneskelige og murine celler og kvantitativ PCR-analyse av
BRCA1
status.
Resultater
Transplant modeller beholde biologiske og genetiske egenskaper av primære SEOCs
GEM SEOC modeller ble indusert ved injeksjon av en adenovirus Cre vektor inn i eggstokkene bursa av mus som bærer ulike kombinasjoner av Cre-avhengige alleler. Som beskrevet tidligere [26], da RB-TS-funksjonen ble inaktivert via uttrykk for
TgK18
T121
allel og ble kombinert med
TP53
sletting eller missense mutasjon (
p53
R172H
), kreft utviklet seg i løpet av 8-12 måneder å produsere høy klasse metastatisk sykdom. Tap av
BRCA1
eller
2
kombinert med RB-TS inaktive førte ikke til sykdomsprogresjon utover stadium I uten samtidig TP53 aberrasjon, og ikke merkbart påvirke biologien til sykdomsprogresjon når kombinert med forstyrrelse av
Rb Hotell og
TP53
. Men
BRCA1
eller
BRCA2
status tydelig konsekvensene viss terapeutisk utfall hos mennesker; Derfor var det viktig å opprettholde modeller både med og uten villtype
BRCA1
for prekliniske studier.
de novo
SEOC modeller er utmerket for å forstå sykdom etiologi og for biomarkører, men de viser en lang ventetid til avansert sykdom, noe som gjør timingen av kohorten produksjon for prekliniske studier utfordrende. I tillegg, på grunn av tilstedeværelsen av p53
R172H allel (en null allel før rekombinasjon), kan SEOC GEM modeller utvikle tumorer utenfor eggstokk som lymfomer og sarkomer [26], noe som reduserer forutsigbar gruppestørrelse. Disse funksjonene gjør modellene sub-optimale for prekliniske terapeutiske studier.
For å tilpasse disse modellene til effektive prekliniske verktøy bevare SEOC stromale egenskaper og immunocompetency, optimalisert vi orthotopic transplantasjon av tumorfragmenter fra primær GEM-avledet SEOCs inn i eggstokkene bursa av resipientmus (fig. 1A). Av 35 primære svulster, ble 17 svulster vellykket passert inn syngene mottaker mus (tabell 1). Den tar sats i passasjen en variert fra 20-100% mellom ulike tumorlinjer med markert forskjell ta sats mellom
BRCA1
null (
TgK18G
T121
tg /+ /BRCA1
Δ /Δ /p53
Δ /Δ) Hotell og
BRCA1
vill type
(TgK18G
T121
tg /+ /p53
Δ /Δ)
svulster (95% ± 5,0 vs 64,5% ± 5,6, p 0,01). For begge genotyper, ble latensen for utvikling for å endebit vesentlig forkortet fra 9,95 ± 1,29 til 2,12 ± 0,61 måneder sammenlignet med de novo-modellen (tabell 1). Påfølgende
in vivo
aging ytterligere forkortet ventetider og ofte bedre take priser (tabell 1). Vi observerte også forskjeller i ventetid mellom passert svulster
TgK18G
T121
tg /+ /BRCA1
Δ /Δ /p53
Δ /Δ
v
s TgK18G
T121
tg /+ /p53
Δ /Δ
genotyper i den første (P1) (2,8 ± 0,2 måneder vs 3,6 ± 0,1 måneder, p 0,01) og andre (P2) passasje (1.8 ± 0,1 måneder kontra 2,7 ± 0,2 måneder, p 0,01). Av notatet, også vi forsøkte å etablere ortotopiske allograft modeller med celler dyrket fra primære svulster eller ascites. Selv om slike kulturer kan lett etableres
in vitro
og viste seg å være nyttige for evaluering av medikament cytotoksisitet (se nedenfor), ortotopisk implantering
in vivo
var mye mindre vellykket på en effektiv måte å etablere tumorer med nødvendig nøyaktighet sammenlignet med direkte transplantasjon av tumorvev i syngene mottakere (data S1).
A, ble allograft modeller av SEOC generert ved transplantasjon av en ovarian tumor fragmenter fra
de novo
modeller av SEOC under bursa av syngene immunkompetente mus. Primær eggstokkkreft cellelinjer ble generert samtidig. Ventetid for kreftutvikling i ortotopiske modeller forkortet betydelig sammenliknet med latency på
de novo
modell. B, H E av primære tumorer (PT) og tilhørende passasje 1 (P1) svulster fra 4 forskjellige tumorlinjer som indikerer SEOC histologi i PT og avledet ortotopiske kreft transplantasjoner. Scale bar representerer 100 mikrometer. C, Principal komponent analyse av normal eggstokk overflaten epitel, primær eggstokksvulster og ulike passasjer av avledet ortotopiske svulster. D, Cluster analyse av sammenslåtte humane og muse data ved hjelp av klassifiserings gensettene viste at passeres svulster, på samme måte som primære svulster, representert alle 4 undergrupper av menneske SEOC opprinnelig stammer fra TCGA studie [5].
For å avgjøre om vesentlige endringer i tumor fenotype var forbundet med økt passasje nummer, grunnskole og ortotopiske kreft histopathologies ble vurdert og klassifisert som SEOC papillær, SEOC dårlig differensiert papillær eller udifferensiert karsinom (se data S1). Det var en høy samstemmighet i klassifiseringen av donor og P1 og P2 svulster, selv om en trend mot tap av brønn differensiert SEOC histologi ble observert med økt passasje nummer (Fig. 1B, tabell 1). Som med
de novo
SEOC musemodell og sykdom hos mennesker, en betydelig andel av mus med ortotopiske svulster utviklet mage karsinomatose (gjennomsnitt = 32%) eller fjernmetastaser (gjennomsnitt = 40%).
for å overvåke passert svulster på molekylnivå, sammenlignet vi transkripsjons profiler av en tidligere utgitt datasett [26] består av normal eggstokk overflaten epitel og primær SEOCs med en nylig generert sett med matchende primære SEOC og avledet ortotopiske svulster. Ved prinsipal komponent analyse (PCA), normale prøver klart adskilt fra svulstene, mens passert svulster gruppert med primære svulster som indikerer deres likhet med de novo SEOCs (Fig. 1C). I tillegg viste cluster analyse av sammenslåtte humane og muse data ved hjelp Klassifiserings gensettene som passeres svulster, på samme måte som primære svulster, representert alle 4 undergrupper av menneske SEOC opprinnelig identifisert i TCGA studien [5] (Fig. 1 D). Derfor ortotopiske trans eggstokkreft modeller rekapitulere den menneskelige sykdommen på molekylære og histopatologiske nivåer.
Murine ovarialcancer celler vise et medikament følsomhet profil ligner menneskelige cellelinjer
For sammenligning av narkotikabehandlingsrespons i murine og humane celler, målte vi cytotoksisitet etter eksponering for cisplatin og olaparib i etablerte menneske ovarialcancer celler og tumorcellekulturer som stammer fra mus primære SEOCs og ascites (fig. 1a). Mens den menneskelige linjen UWB1.289 uttrykker en avkortet inaktiv BRCA1 protein, BRCA1 status i menneske linjer 1A9 (en subklon av linje A2780), 1A9CP80 og HeyA8 er ukjent. For å finne ut om disse menneskelige cellelinjer var i stand til å RAD51 rekruttering og derfor homolog rekombinasjon-mediert reparasjon, vurdert vi stråleindusert foci dannelsen av γH2AX og RAD51. Mens γH2AX markerer områder av DSB sin uavhengige av BRCA1 funksjonalitet, RAD51 rekruttering til DSB sin er BRCA1-avhengig. 1A9CP80 og HeyA8 celler utsatt for 10Gy bestråling og farget 6 timer senere, viste dyp dannelsen av RAD51 og γH2AX foci. I kontrast, ble fullstendig fravær av RAD51 foci sett i 1A9 og UWB1.289 celler (figur S1.), Noe som indikerer mangel på BRCA1 funksjonalitet
Som tidligere rapportert [27] -. [29] UWB1.289 og 1A9 var mest følsomme for behandling med cisplatin, mens IC50s av linjene 1A9CP80 og HeyA8 var generelt 2-2,5 ganger større enn sine sensitive kolleger (fig. 2A). Olaparib behandling produserte den største cytotoksisitet i 1A9 celler, mens 1A9CP80, HeyA8 og UWB1.289 var lik og omtrent 2-ganger mindre sensitiv (Fig. 2B).
Humant (A, B) og murint (C- H) eggstokkreft celler ble utsatt for cisplatin, olaparib eller vehikkel i 7 dager, hvoretter cellelevedyktighet ble målt ved bruk av XTT-reagens. Proporsjonal levedyktighet ble beregnet ved å sammenligne stoffene med bærerkontroller som har levedyktighet ble antatt å være 100%. C. Panel av murine cellelinjer ble valgt basert på
BRCA1
status som inneholder
BRCA1
-deficient (stripete bar) og -wild type linjer (fylte søyler) opprettholde lik
BRCA1
uttrykk som deres svulster opprinnelse (D). IC50-verdiene for de enkelte kreftcellelinjer er vist i sagn (A, B, E, G, parentes bak cellelinje betegnelse). Sammenligning av IC50 for cisplatin (F) og olaparib (H) i villtype (
TgK18G
T121
tg /+ /p53
Δ /Δ
; R5810T, R5838T) og mutant (
TgK18G
T121
tg /+ /BRCA1
Δ /Δ /p53
Δ /Δ
, 39647T, 60577T, 60580T, 82394T) murine cellelinjer viser signifikant forskjell mellom genotypene (T-test, 333,7 ± 54,1 vs 146,0 ± 8,2, p 0,01 og 18,2 ± 1,4 vs 10,4 ± 1,2, p 0,05, henholdsvis for narkotika). Gjennomsnitt og standardavvik er vist.
For sammenlign cytotoksisitetsassayer, mus primære SEOC cellelinjer, husing enten villtype
BRCA1
eller mutant sletting, ble dyrket. Som rapportert tidligere [31],
BRCA1
-deficient celler vokser dårlig i kultur. Således, fordi Cre-formidlet rekombinasjon in vivo er ikke 100%, er det en sterk
in vitro
seleksjon for celler med utilstrekkelig
BRCA1
delesjon i cellelinjer avledet fra overveiende
BRCA1
mangel svulster [31]. Av 32 cellelinjer screenet, fire cellelinjer som beholdt den laveste
BRCA1
uttrykk nivåer (under 20%) i forhold til
BRCA1
villtype linjer ble valgt til å representere
BRCA1
-deficiency (fig. 2C). Disse nivåene av
BRCA1
var sammenlignbar med foreldre tumorer (Fig. 2 D).
BRCA1
mangel ble også bekreftet av funksjonell analyse hvor bestrålte cellene ikke var i stand til å rekruttere RAD51 til nettstedene til DSB sin (fig. S2).
BRCA1
-deficient cellelinjer (39647, 60580, 60577 og 82394, alle
TgK18G
T121
tg /+ /p53
Δ /Δ /BRCA1
Δ /Δ
genotype) var ca 2 ganger mer følsom for cisplatin enn
BRCA1
-wild type linjer (R5810 og R5838, både
TgK18G
T121
tg /+ /p53
Δ /Δ
genotype, fig. 2E-F). Tilsvarende behandling med olaparib viste større styrke i
BRCA1
-deficient enn
BRCA1
-wild typen cellelinjer (fig. 2 G-H). Våre resultater tyder på at disse cellelinjene replikere relative følsom av humane tumorer der
BRCA
mutasjoner er funnet oftere i platina-sensitive enn platinum-resistent sykdom [32], [33].
ortotopiske transplanterte modeller rekapitulere
BRCA
-relaterte forskjeller i behandlingsrespons ble observert hos pasienter
Ideelt for effektiv bruk av preklinisk modell i utvikling av menneskelige terapi og behandlingsassosiert biomarkører, forutsigbarhet kjente menneskelige reaksjoner det bør etableres. For å oppnå dette, evaluert vi svar i
BRCA1
-deficient og -wild typen SEOC modeller til cisplatin og olaparib. Først, for å bestemme en optimal doseringsplan, undersøkte vi tumorvekstkinetikk via serie magnetisk resonans (MR) avbildning (fig. S3). Mottaker dyr utviklet små ovarietumorer av 70 til 80 mm
3 (~0.5 cm i diameter) av 21 til 28 dager etter implantasjon (s. I.) Etterfulgt av rask tumorvekst. Dyrene ble døende på grunn av store ovarietumorer og ascites med 40 til 60 dager p.i. For effektstudiene, ble behandling startes en gang en liten ( 80 mm
3). Tumormasse hadde utviklet for å etterligne pasienter med resttumorbyrde etter de-bulking kirurgi (. Studiedesign avbildet i figur 3A)
A, Skjematisk av dosering og bildebehandling i effektstudier. B, Inhibering av PAR dannelse i tumor lysater behandlet med olaparib for 2 (C). Den gjennomsnitt og standardfeil er vist. D, representant MR-bilder før og etter 2 ukers behandling med kjøretøy, olaparib, cisplatin eller kombinasjon av olaparib og cisplatin vises. Scale bar representerer 1 cm. Hvite pilene peker til tumorene, grønne piler peker på kontralaterale eggstokkene. MRI-baserte kvantifisering av tumorvolumendringer uttrykt som RTV etter 2 uke (E) og 3 ukers (F) behandlingsregime. Statistisk signifikante forskjeller mellom grupper ble analysert ved en-veis ANOVA og Tukey multippel sammenligninger test. Hvert punkt representerer en dyr. V; kjøretøy, O; olaparib, C; cisplatin, O + C; olaparib og cisplatin.
For å bestemme in vivo aktivitet og mål modulering av olaparib i orthotopic modell, vi analysert for PAR nivåer i behandlede svulster. Tumor lysatene fra alle dyrene som fikk olaparib behandling hadde sterkt redusert PAR nivåer etter kortsiktig (28 timer; p 0,01 for linje 32233, p 0,001 for linje 30200) og langsiktig (2 uker; p 0,01 for linje 29255 og 30200, p 0,0001 til linje 39877) dosering sammenlignet med mus behandlet med bærer eller cisplatin (figur 3B, C), noe som indikerer at tumoren utsettes for olaparib var tilstrekkelig for PARP-inhibering.. Som ventet var det ingen forskjell i PAR nivåer mellom
BRCA1
-deficient og villtype svulster, i samsvar med PAR dannelsen oppstår oppstrøms BRCA1, uavhengig av tilstanden i HR reparasjonsmekanisme.
Vi vurderte effekten av olaparib, cisplatin og deres kombinasjon i
BRCA1
-deficient modeller etter to ukers behandling (fig. 3D, E) ved å måle relative tumorvolum (RTV), tumorvolumet endringer fra baseline (pre-dosering) til endepunktet som bestemt ved MRI. Hvert punkt i diagrammet representerer en individuell mus. Alle 13 kjøretøy-behandlede dyr fra 2 uavhengige tumormodeller viste rask tumorvekst innen 2 uker, med 3 dyr som blir avlivet før dag 14 på grunn av sviktende helse i forbindelse med tumorvekst (Fig. 3D, E). Behandling med olaparib resulterte i beskjeden reduksjon av tumorvekst i
BRCA1
-deficient 30200 tumormodell og i betydelig reduksjon i modell 39877 (p 0,01). Men i begge tilfeller er reduksjonen i RTV var mer uttalt når de ble behandlet med cisplatin (p 0,001) og kombinasjonen av cisplatin og olaparib sammenlignet med olaparib alene (p 0,01) (Fig. 3D, E)
for å undersøke om responsen på behandlingen var avhengig av
BRCA1
status, vi utført en tre-ukers behandlingsstudie på
BRCA1
-deficient modell 30200 og en
BRCA1 Anmeldelser – vill type modell 29255. Seks av 9 kjøretøy-behandlede mus fra begge linjene ble døende før dag 21. Cisplatin mono- eller kombinasjonsterapi var like effektivt på tre og to ukers tidspunkter. Men utvidet behandling av
BRCA1
-deficient svulster med olaparib resultert i større svulst reduksjon i forhold til kjøretøy behandlet svulster (2,037 ± 0,282 RTV vs 5,598 ± 2,296 RTV, p 0,01) på 3 mot 2 ukers behandling (3,008 ± 0,509 vs 3,710 ± 1,325 RTV, ns), noe som tyder på at en terskel på DNA-skade er nødvendig for optimal styrke. I kontrast til
BRCA1
-wild typen tumormodellen ikke svare på olaparib tross PARP hemming i tumorer, som indikerer viktigheten av skadet HR reparasjon olaparib effekt (fig. 3B, F). Cisplatin terapi var like ineffektive i
Brca1-
villtype svulster (Fig. 3F).
BRCA1
genotype spesifikke reaksjoner på platina narkotika samt olaparib har også blitt dokumentert hos pasienter [34] – [37], derfor orthotopic modellen er et nyttig verktøy for å undersøke disse differensialresponser og forutsi mulige utfall.
histopatologiske endringer som følge av olaparib og cisplatin behandling reflektere forskjeller observert i tumorvolum
for å vurdere effekten av medikamentell behandling på cellenivå, H E-fargede tumorsnitt ble analysert for histologiske endringer (fig. 4AA-l). I både
BRCA1
-deficient modeller, behandling med olaparib resulterte i mindre differensiert SEOC med øket kjernefysisk størrelse og pleomorphism i forhold til brønnen for å moderat differensierte papillær strukturer av ovarietumorer i vehikkelbehandlede mus (figur 4A en. , b). I motsetning til dette, cisplatin monoterapi hadde en mer dyptgripende virkning på tumorhistologi (fig. 4Ac), som produserer dårlig differensiert papillær SEOC eller udifferensiert karsinom med en økning i tumor stroma, nekrotisk brennpunkter, og apoptotiske celler med en høy grad av kjerne pleiomorphism og nærværet av atypiske multinucleated tumor kjempeceller. Behandling av
BRCA1
-deficient modeller med kombinasjon av cisplatin og olaparib resulterte i histologi svært lik som cisplatin alene-behandlede tumorer (Fig. 4AD). I kontrast, ble minimale behandlingseffekter observert i
BRCA1
-wild typen tumormodell indikerer en samlet samsvar med histopatologiske og tumorvolumendringer følgende medikamentell behandling (Fig. S4).
A, et eksempel på histologi og IHC av
TgK18G
T121
tg /+ /BRCA1
Δ /Δ /p53
Δ /Δ
svulster behandlet med cisplatin og /eller olaparib (en l).
