Abstract
DNA skade respons kinase ATR kan være et nyttig kreft terapeutisk mål. ATR hemming synergizes med tap av ERCC1, ATM, XRCC1 og DNA skade kjemoterapi agenter. Kliniske studier har begynt å bruke ATR-hemmere i kombinasjon med cisplatin. Her rapporterer vi det første syntetiske dødelighet skjerm med en kombinasjonsbehandling av en ATR-hemmer (Atri) og cisplatin. Kombinasjonsbehandling med Atri /cisplatin er syntetisk dødelig med tap av TLS polymerase ζ og 53BP1. Andre DNA reparasjons trasé inkludert homolog rekombinasjon og mismatch reparasjon ikke viser syntetiske dødelige interaksjoner med Atri /cisplatin, selv om tap av noen av disse reparere veier sensitizes celler til cisplatin som en mono. Vi rapporterer også at Atri sterkt synergizes med PARP-hemming, selv i homolog rekombinasjon-dyktig bakgrunn. Til slutt, ATR-inhibitorer var i stand til å resensitize cisplatin-resistente cellelinjer til cisplatin. Disse dataene gir en omfattende analyse av DNA-reparasjons trasé som viser syntetisk dødelighet med ATR-hemmere i kombinasjon med cisplatin kjemoterapi, og vil hjelpe pasienten utvalgsstrategier som ATR-hemmere videre til kreftklinikken
Citation. Mohni KN, Thompson PS, Luzwick JW, Glick GG, Pendleton CS, Lehmann BD, et al. (2015) En syntetisk Lethal Screen Identifiserer DNA Repair Pathways at bevisstkreftceller til å Kombinert ATR Blokker og Cisplatin behandlinger. PLoS ONE 10 (5): e0125482. doi: 10,1371 /journal.pone.0125482
Academic Redaktør: Robert W. Sobol, University of South Alabama Mitchell Cancer Institute, USA
mottatt: 16 november 2014; Godkjent: 18 mars 2015; Publisert: 12. mai 2015
Copyright: © 2015 Mohni et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra National Institutes of Health [CA102792 til DC, T32CA093240 til KNM, CA95131 til JAP], Susan G. Komen [SAC110030 til JAP, PDF14302198 til KNM] og Breast Cancer Research Foundation [DC]. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
DNA-skade kjemoterapi agenter som cisplatin er standard av behandlinger for mange solide tumorer inkludert trippel-negativ brystkreft (TNBC) og ikke-småcellet lungekreft (NSCLC). Disse agentene fungerer ved å plassere en økt avhengighet av DNA-skade svar for overlevelse og spredning. Mutasjoner i DNA-reparasjonsgener er hyppige i TNBC og NSCLC, og genomiske studier indikerer betydelig genom instabilitet i en undergruppe av TNBC tyder defekter i DNA-reparasjon [1-5]. TNBC har ofte en god første respons på kjemoterapi, inkludert platina medisiner, men pasientene nesten alltid tilbakefall, og kan utvikle resistens [6, 7]. NSCLC pasienter får platina som en første-linje narkotika og vanligvis overleve mindre enn ett år [8].
DNA skade respons kinase ATR (ATM- og Rad3-relatert) koordinerer mange av de cellulære responser til DNA-skader ATR er nødvendig for å stabilisere fastlåste replikering gafler og la gaffel omstart etter skade [9]. I fravær av ATR, stoppet replikering gafler kollaps i dobbel tråd pauser, noe som kan føre til genomisk rearrangements eller celledød [10, 11]. ATR aktivisering er også nødvendig for å bremse cellesyklusen for å gi tid for reparasjon, gjennom fosforylering av sin effektor kinase CHK1 [9]. ATR er en viktig kinase, og mange kreftcellene har en økt avhengighet av ATR for å kompensere for onkogen-induserte spenning replikasjon [12-14].
Selektiv ATR-inhibitorer er blitt beskrevet av Vertex Pharmaceuticals [15, 16] og Astrazeneca [17] og er for tiden i fase i kliniske studier i kombinasjon med DNA skadelige cellegift eller strålebehandling. For å identifisere i hvilken genomisk sammenheng ATR-inhibitorer kan med fordel brukes som en monoterapi vi tidligere har foretatt en syntetisk dødelig siRNA-skjermen for å identifisere gener som når inaktivert sensibiliserte celler til ATR-inhibering. Inaktivering av ERCC1-XPF endonuklease samt tap av kjente ATR pathway proteiner og DNA replikering proteiner sterkt lysfølsomt celler til ATR hemming [18]. ATR-hemming er også syntetisk dødelig med tap av XRCC1 og ATM samt overekspresjon av Cyclin E [18-21].
ATR hemming synergizes med DNA-skade kjemoterapi narkotika som cisplatin og gemcitabin å drepe kreftceller [15 , 19]. ATR inhibering har vist effekt i en musemodell av bukspyttkjertelkreft i kombinasjon med gemcitabin, og i pasientavledet lunge tumorxenografter i kombinasjon med cisplatin [16, 22]. Dermed vil kliniske studier inkluderer kombinasjonsbehandling med en ATR-hemmer og cisplatin, gemcitabin, eller etoposid (ClinicalTrials.gov: NCT02157792). Her rapporterer vi den første systematiske siRNA syntetisk dødelighet skjermen kombinere ATR hemming og cisplatin behandling for å lete etter mer målrettede anvendelser av ATR-hemmer i kombinasjon med kjemoterapi. Som forventet, identifiserte vi ATR vei, DNA replikering gener, og ERCC1-XPF. Det var ingen ekstra fordelen av å kombinere Atri og cisplatin i enten homolog rekombinasjon (HR) -deficient eller mismatch reparasjon (MMR) -deficient celler. Vi fant at tap av translesion DNA polymeraser og 53BP1 hyper-sensitizes celler til Atri /cisplatin kombinasjonsbehandling. Siden inaktive mutasjoner er funnet i disse genene i krefttyper, tyder våre data terapeutisk verdi for kombinert Atri /cisplatin i disse miljøene.
Materialer og metoder
Cells og reagenser
U2OS og HCT-116 ble innhentet fra Stephen Elledge, august 2002. MDA-MB-468 (HTB-132), HCC1806 (CRL-2335), BT549 (HTB-122), H157 (CRL-5802), og A549 (CCL -185) ble oppnådd fra ATCC og opprettholdt som tidligere beskrevet [18]. Følgende cellelinjer ble tidligere beskrevet: BRCA2 defekte og supplert VC8 celler [23], HCT-116 + kromosom 3 [24], hec59, og hec59 + kromosom 2 [25]. MDA-MB-468 cisplatin-resistente celler ble samlet ved kontinuerlig seleksjon i cisplatin, og opprettholdt i media supplert med 3 um cisplatin. Den cisplatin-resistente celler ble dyrket uten cisplatin i 7 dager før begynnelsen av hvert eksperiment for å kontrollere for eventuelle virkninger av cisplatin behandling. ATR inhibitor (Atri) VE-821 [19] ble syntetisert ved Vanderbilt Institute for Chemical Biology kjemisk syntese Facility. PARP-hemmere (PARPi) BMN673 [26] ble kjøpt fra Selleck Chemicals. Cisplatin ble kjøpt fra Calbiochem.
Syntetisk dødelig siRNA skjermen
Den syntetiske dødelig siRNA skjermen ble gjort som beskrevet tidligere [18]. Kort fortalt, vi utnyttet en tilpasset siRNA bibliotek targeting 240 kjente DNA-reparasjon og replikering gener med 4 sirnas per genet i en 96-brønners format. U2OS-celler ble transfektert med siRNA-biblioteket og delt inn i fire 96-brønners plater 72 timer etter transfeksjon. Cellene ble deretter enten venstre ubehandlet eller behandlet med 1 um Atri, 0,5 pm cisplatin, eller 1 um Atri og 0,5 pm cisplatin. Cellelevedyktigheten ble bestemt etter ytterligere 72 timer ved anvendelse av Alamar blue (Invitrogen). Den prosentvise levedyktighet av hver prøve ble bestemt ved sammenligning av medikamentet behandlede prøve til den ubehandlede prøven for hvert gen for å kontrollere for eventuelle siRNA-spesifikke virkning på cellevekstrater. Robuste z-score ble beregnet ved hjelp av median og median absolutte avvik fra loggen
10 (prosent levedyktighet) verdier. De presenterte verdier er gjennomsnitts robuste z-score fra tre uavhengige trans. Gener valgt som stiller syntetiske dødelige relasjoner med noen av de medikamentelle behandlinger ha minst 2 sirnas med robuste z-score mindre enn -1,3. Den eneste atri arm av skjermen er tidligere publisert [18].
RNA-interferens og celleviabilitet assays
Alle siRNA transfeksjoner ble utført som tidligere beskrevet med 10 nM siRNA og Dharmafect 1 (Invitrogen) [ ,,,0],18]. Følgende siRNA sekvenser ble brukt: siREV3L-2 GAAGUUAUCUGGCUGCUUU, siREV3L-4 CAAAGAUGCUGCUACAUUA, si53BP1-2 GGACAAGUCUCUCAGCUAU, si53BP1-3 GAUAUCAGCUUAGACAAUU. Den ikke-måls siRNA var Qiagen All Star Negativ kontroll. De kortsiktige Celleviabilitet analysene ble utført som tidligere beskrevet [18]. I korthet ble cellene sådd ut i 96-brønners plater 72 timer etter transfeksjon med siRNA og deretter behandlet med medikamenter i 72-96 timer som indikert i figuren sagn. Cellelevedyktigheten ble sammenlignet med en ubehandlet kontroll etter trekke tomme brønnverdier fra alle data. Den maksimale DMSO-konsentrasjon ved den høyeste dosen av medikament var 0,01% og hadde ingen virkning på cellevekst. Klonogene analyser med U2OS celler ble utført som tidligere beskrevet [27]. I alle celleviabilitet analyser verdiene representerer gjennomsnitt (n = 3) og Feilstolpene representerer standardavviket av ett eksperiment. Alle forsøkene ble utført minst to ganger.
Synergy Analyse
Bliss uavhengighet log synergi volumer (mikrometer
2%) ble beregnet med hjelp MacSynergy II og rapportert på 95% konfidensintervall for en replikere (n = 3) [28]. Topper på grafen tilsvarer synergi og høyere topp sterkere grad av synergi. Isobologram-analyse ble utført som beskrevet [29, 30]. Fraksjonelle inhiberende konsentrasjoner ble bestemt ved å dividere IC
50 Atri med en fast konsentrasjon av cisplatin eller PARPi av IC
50 av atri alene (x-koordinaten). Y-koordinaten er fastsatt konsentrasjon av cisplatin /PARPi dividert med IC
50 av cisplatin /PARPi alene. Den faste diagonal linje på grafen representerer additivity og verdier under linjen representerer synergi. IC
50-verdier ble bestemt med Prism versjon 6.
Immunofluorescensanalyse
Utført og kvantifisert som tidligere beskrevet [27].
Resultater
ATR hemming synergizes med cisplatin og resensitizes cisplatin-resistente kreftceller
ATR-hemmere (Atri) utstillings synergi med cisplatin i å drepe HCT-116 tykktarmskreftceller som tyder på kombinasjoner av Atri og cisplatin kan være nyttig terapeutisk [15, 19] . Konsistent med dette resultatet, økende mengder Atri redusere konsentrasjonen av cisplatin kreves for å drepe U2OS osteosarkom celler og begge legemidlene utviser merket synergi i kortsiktige levedyktighet analyser (Fig 1A og 1B). Synergy er rapportert i en 3-dimensjonal graf med to enkelts-agenter (Atri eller cisplatin) plottet i X og Z dimensjoner og en Bliss uavhengighet logg synergi volum plottet i Y dimensjonen. Topper på grafen svarer til den grad av synergi med høyere topper indikerer større mengder synergi [28]. Synergi ble også evaluert ved bruk av isobologram analyse (figur 1C). Den fraksjonelle hemmende konsentrasjoner (FIC) Atri og cisplatin vises på x-aksen og y-aksen henholdsvis. Verdier under den heltrukne linjen representerer synergi. For å bekrefte disse observasjonene i langsiktige levedyktighet analyser, ble U2OS celler behandlet med Atri, cisplatin, eller Atri /cisplatin kombinasjon for 24, 48 eller 72 timer, og anledning til å danne kolonier i 14 dager (figur 1D). Ved de konsentrasjoner som benyttes, både atri og cisplatin behandling alene noe redusert evne til celler til å danne kolonier. Den Atri /cisplatin kombinasjonsbehandling redusert kolonidannelse med nesten to størrelsesordener mer enn de enkle behandlinger alene. Dermed er det stor synergi mellom Atri og cisplatin i langsiktige levedyktighet analyser. I tillegg har nesten alle av det celledrepende virkning av den kombinerte behandling er formidles i løpet av de første 24 timer etter eksponering, som lengre inkubasjonstider ikke ytterligere redusere kolonidannende evne av cellene.
(A og B U2OS) celler ble behandlet med økende doser av cisplatin eller ATR-inhibitor (atri) alene eller i kombinasjon i 72 timer. Cellelevedyktigheten ble bestemt ved Alamar blue og rapportert som en prosent av de ubehandlede kontrollceller. Analyse av synergi mellom cisplatin og atri ved hjelp av Bliss Independence (B) og isobologram analyse (C) som beskrevet i materialer og metoder. (D) U2OS celler ble behandlet med 1 um cisplatin, 1 um Atri, eller begge (Atri + Cis); Cellene ble frigjort i mediet uten medikamenter etter 24, 48 eller 72 timer og tillatt å danne kolonier. (E) Cellene ble behandlet med 1 um cisplatin eller 1 um Atri for 24 t, Atri (24 t), etterfulgt av cisplatin (24 t) A → C, eller cisplatin (24 t), etterfulgt av Atri (24 t) C → A. Feil barer i alle paneler er standardavvik (n = 3).
Neste vi spurt om rekkefølgen på behandling er viktig for synergi. U2OS celler ble enten behandlet med Atri eller cisplatin alene i 24 timer, eller behandlet med Atri i 24 timer etterfulgt av cisplatin i 24 timer eller vice versa (Fig 1E). Celler behandlet med atri, cisplatin, eller atri etterfulgt av cisplatin oppviser en 2-5 gangers reduksjon i evnen til å danne kolonier. Påfallende, celler behandlet med cisplatin fulgt av atri viste en 1000 gangers reduksjon i sin evne til å danne kolonier. Sammen indikerer disse data at den maksimale synergi er observert når cellene behandles med atri og cisplatin samtidig, eller når cisplatin behandling forut atri. Ingen synergi ble observert når Atri behandling innledes cisplatin.
Den sterke synergi observert mellom Atri og cisplatin førte oss til hypoteser som Atri kan resensitize cisplatin-resistente kreftformer. For å teste denne ideen, genererte vi cisplatin-resistente MDA-MB-468 trippel negativ brystkreft (TNBC) celler ved kontinuerlig trinnvis eksponering for økende konsentrasjoner av cisplatin (Fig 2A). Disse cellene ble behandlet med økende konsentrasjoner av atri alene, eller i kombinasjon med 0,5 pm eller 3 um cisplatin (Fig 2B og 2C). Som forventet, foreldrecellelinje utstilt synergi med 0,5 pm cisplatin og ble fullstendig drept av 3 um cisplatin (Fig 2D). Den cisplatin-resistente cellelinje viste ingen synergi med 0,5 pm cisplatin men viste synergi med 3 um cisplatin, om enn ikke til nivået av de parentale celler (Fig 2E). Således ATR hemning var i stand til å resensitize cisplatin-resistente celler overfor cisplatin, men disse cellene var fremdeles ikke så sensitiv som foreldrecellene. I disse eksperimentene, ble synergi observert når dosen av cisplatin begynner å ha en effekt på cellelevedyktighet (5-10 prosent reduksjon i levedyktighet) og maksimale synergi ble observert når dosen av cisplatin redusert cellelevedyktighet med 25-50 prosent av den ubehandlede kontroll. Uventet, cisplatin-resistente cellelinje var litt mer følsom for ATR-inhibitoren alene, noe som tyder på at mekanismen for resistens overfor cisplatin gjort cellene mer avhengige av ATR-signalering for å overleve.
(A) MDA-MB-468 (468) og MDA-MB-468 cisplatin-resistente (468-CR) celler ble behandlet med økende doser av cisplatin for 96h før målecelle levedyktighet med Alamar blå. (B og C) MDA-MB-468 og MDA-MB-468 cisplatin-resistente celler ble behandlet med atri alene eller atri og cisplatin ved 0,5 pm (B) eller 3 um (C) for 96h før måling av cellenes levedyktighet med Alamar blue . (D og E) Bliss uavhengighet synergi mellom cisplatin og atri i MDA-MD-468 (D) og MDA-MB-468 cisplatin-resistente celler (E). Feil barer i alle paneler er standardavvik (n = 3).
Identifikasjon av syntetiske dødelige interaksjoner med Atri /cisplatin kombinasjonsbehandling
For å identifisere genetiske determinanter av den observerte synergi mellom Atri og cisplatin, gjennomførte vi tre syntetiske dødelige siRNA skjermer for å søke etter gener, at når oppbrukt, sensitive celler til Atri eller cisplatin alene samt Atri /cisplatin kombinasjonsbehandling. Vi brukte en tilpasset siRNA bibliotek som inneholder 240 kjente DNA-reparasjon og replikering gener med 4 individuelle sirnas per genet i separate brønner på 96-brønners plater [18]. U2OS-celler ble transfektert med siRNA-bibliotek. 72 timer senere hver 96-brønns plate ble delt i fire 96-brønners plater og enten ubehandlet eller behandlet med 1 uM atri, 0,5 pm cisplatin, eller en kombinasjon av 1 uM atri og 0,5 pm cisplatin i 72 timer (figur 3A). Cellelevedyktigheten ble målt med Alamar blue, og prosent levedyktigheten til hver siRNA ble beregnet ved å sammenligne Alamar blue verdien av den behandlede siRNA sammenlignet med den ubehandlede siRNA. Denne fremgangsmåten kontrollerer for eventuelle siRNA-spesifikke virkninger på cellevekst. Stoffet doser ble valgt slik at de hadde en minimal effekt på cellelevedyktigheten til ikke-målsøkende siRNA og hadde en maksimal effekt på ATR siRNA kontroller til hver plate av skjermen (figur 3B). Vi har foreslått at lavere doser av atri er tilstrekkelig til å drepe ATR-utarmet celler fordi mindre atri er nødvendig for fullstendig å hemme den gjenværende ATR-proteinet [18]. Alle tre medikamentelle behandlinger ble analysert uavhengig av hverandre, og den prosentvise levedyktighet ble brukt til å beregne en robust z-poengene for hvert medikament behandling som beskrevet i materialer og metoder. Skjermen ble gjennomført i triplikat, og de midlere robuste z-skår ble plottet for hver siRNA for hver av de medikamentelle behandlinger (figur 3C-3E). De interne positive kontroll sirnas rettet mot ATR og Atrip er uthevet i rødt og solid rød linje angir terskelen cutoff brukes til å velge sirnas. S1 Datasett presenterer den komplette resultatene fra alle de tre skjermene. Gener med minst 2 sirnas ha en robust z-score på -1,3 eller mindre ble valgt som stiller syntetiske dødelige relasjoner. En relativt beskjeden robust z-poeng cutoff ble valgt fordi dette er en partisk bibliotek av DNA skade respons og replikering proteiner som vi forventer å ha en høyere frekvens av syntetiske dødelige interaksjoner enn en tilfeldig bibliotek.
(A) Skjematisk av siRNA skjermen. U2OS celler ble transfektert med sirnas og deretter enten ubehandlet eller behandlet med 1 um Atri, 0,5 pm cisplatin, eller Atri og cisplatin. Cellelevedyktigheten ble målt med Alamar blue. (B) Livskraftig av de ikke-targeting (NT) og ATR siRNA kontroller ved hjelp av skjerm forhold. Verdiene representerer gjennomsnittet ± SD av de tre uavhengige replikater av skjermen. (C-E) Den robuste z-score av behandlet gruppe sammenlignet med ubehandlet cellenes levedyktighet ble bestemt for hver siRNA i biblioteket for atri (C), cisplatin (D), og Atri og cisplatin (E). De røde sirklene representerer de 8 unike sirnas rettet mot ATR og Atrip stede i biblioteket og den røde linjen viser en robust z score på -1,3. (F) Oppsummering av overlapping av syntetiske dødelige relasjoner med Atri, cisplatin, eller Atri og cisplatin. (G) Fullstendig liste av gener som viser en syntetisk dødelig forhold til Atri, cisplatin, eller Atri og cisplatin. Gener med 2 eller flere sirnas med robuste z-score på mindre enn -1,3 regnes som syntetisk dødelig. Den Atri mono skjermen ble tidligere utgitt og inkludert for forhold til de andre medikamentelle behandlinger [18].
De tre skjermene identifisert gener som viste syntetiske dødelige forhold i ett eller flere av de medikamentkombinasjoner og i flere forskjellige DNA reparasjon baner (fig 3F og 3G). Den Atri arm av skjermen er tidligere publisert og tatt med her for forhold til kombinasjonsbehandling skjermen [18]. Som tidligere rapportert, den største familien av gener identifisert som viser syntetisk dødelighet med Atri alene var ATR pathway gener og DNA replikering gener, inkludert en tidligere urapporterte syntetisk dødelig interaksjon med ribonukleotidreduktase (
RRM1 Hotell og
RRM2
). Vi identifiserte også kromatin remodelers, Fanconi Anemi pathway gener, translesion DNA polymeraser, og
ERCC1 product: [18].
ATM Hotell og
XRCC1
nå ikke våre cutoff med mer enn én siRNA og ble ikke inkludert i listen av syntetiske dødelige interaksjoner. Disse interaksjonene ble tidligere identifisert ved hjelp av null og supplert cellelinjer samt lavmolekylære inhibitorer [19, 20]. Det er mulig at fullstendig stanse /hemming er nødvendig for å observere den syntetiske dødelighet rapportert og ble ikke oppnådd med siRNA brukes i vårt bibliotek.
Ved hjelp av cisplatin som monoterapi, vi observerte syntetisk dødelighet med HR-gener som forventet siden dette er en viktig mekanisme som kreves for å reparere cisplatin addukter. Celler som mangler
ATR
, translesion DNA polymerase trasé, XPF (
ERCC4
),
XAB2
, og
XRCC1
er også overfølsomme for cisplatin.
Den kombin Atri /cisplatin følsomhet skjermen ble utført ved de samme doser av Atri og cisplatin som ble brukt i de enkelte narkotika-skjermer. Denne skjermen også identifisert ATR pathway gener og en undergruppe av DNA replikering gener, som trolig til stede basert på deres syntetisk dødelighet med Atri alene. Nye genfamiliene som finnes i den kombinerte behandlingen inkluderer mismatch-reparasjonsgener, polymeraser ekstra translesion DNA, XPF (
ERCC4
),
TP53BP1
,
DDB2
, og Soss-A (
INTS3
). Med kombinasjonen av Atri /cisplatin behandling,
ATM
,
RAD50
, og
RAD54
L tilnærmingen vår cutoff terskelen med en siRNA betydning for hver som gir en z-poeng mindre enn -1,3 og en andre siRNA med en robust z-scorer mindre enn -0,9.
Syntetisk relasjoner mellom HR eller MMR og Atri /cisplatin
Interessant, tap av HR gener forårsaker ikke synergi med Atri /cisplatin selv om det er synergistisk med cisplatin alene. Vi bekreftet dette resultatet ved hjelp av BRCA2-mangel VC8 celler. Disse cellene er ekstremt følsomme for cisplatin sammenlignet med isogene celler konstruert for å re-uttrykke villtype BRCA2 (Fig 4A). Men de er ikke overfølsomme for Atri alene og kombinasjonsbehandling av Atri /cisplatin resulterte ikke i noen synergistisk drap ved lave eller moderate cisplatin doser (fig 4B og 4C). Den store mengden av død sett i cisplatin kombinasjonsbehandling høy dose er nesten all grunn til økt toksisitet av cisplatin i HR-defekte celler. Mangelen av syntetisk dødelighet kan skyldes hemming av ATR reduserer effektiviteten av HR slik at ingen ytterligere synergi er observert i HR-mangelfull bakgrunn [31].
BRCA2-mangel VC8 celler eller VC8 celler supplert med en BRCA2 uttrykk vektor ble behandlet med Atri, cisplatin, og Atri /cisplatin i kombinasjon. (A) Sensitivitet av BRCA2-mangel celler til cisplatin. (B og C) Følsomhet for BRCA2-mangel celler til Atri alene og Atri med enten 0,05 eller 0,1 gM cisplatin. Cellelevedyktigheten ble målt med Alamar blue etter 72 timer og rapportert som en prosent av de ubehandlede kontrollceller. Feilfelt er standardavvik (n = 3).
Flere MMR gener utstilt syntetisk dødelighet med Atri /cisplatin kombinasjonsbehandling i skjermen. Siden MMR-mangel er et felles trekk ved mange kreftformer, forsøkte vi å kontrollere at tumorceller med MMR-mangel er overfølsom mot kombinert Atri /cisplatin behandlinger. Tykktarmskreft cellelinje HCT-116 er MMR-mangelfull på grunn av mangel på MLH1. Overraskende, sammenlignet med HCT-116 + kromosom 3 som MLH1 uttrykk har blitt restaurert [24], vi fant ingen forskjell i følsomheten for Atri alene eller kombinasjonen av Atri /cisplatin i både kortsiktige og langsiktige levedyktighet analyser ( figur 5A og 5B). Vi testet også rollen MMR i HEC59 livmorkreftceller, som er mangelfull i MSH2 og følgelig ikke uttrykker MSH3 eller MSH6. Disse cellene viste ikke noen syntetiske dødelighet med Atri alene eller kombinasjonen av Atri /cisplatin sammenlignet med suppleres cellelinje i både kortsiktige og langsiktige levedyktighet analyser (Fig 5C og 5D). Sammen disse dataene indikerer at mismatch reparasjon ikke er en nyttig indikator på syntetisk dødelighet med Atri eller Atri /cisplatin kombinasjonsbehandling. Således flere DNA-reparasjonsbaner oppviser ingen syntetisk letalitet med ATR hemming eller en kombinasjon av ATR /cisplatin inkludert HR og MMR.
(A og C) Celler ble behandlet med økende doser av atri alene eller i kombinasjon med 0.5 uM cisplatin i 72 timer. Cellelevedyktigheten ble målt med Alamar blue og rapportert som en prosent av de ubehandlede kontrollcellene for hver cellelinje. (B og D) Celler ble behandlet med 1 uM atri, 0,5 pm cisplatin, eller begge deler (A + C); Cellene ble frigjort i mediet uten medikamenter etter 24 timer og tillatt å danne kolonier. (A og B) MLH1-mangel HCT-116 celler og HCT-116 celler supplert med MLH1. (C og D) MSH2-mangel HEC59 celler og HEC59 celler supplert med MSH2. Feil barer i alle paneler er standardavvik (n = 3).
ATR hemming er syntetisk dødelig med PARP hemming
PARP-inhibitorer stille syntetisk dødelighet med tap av HR, og er for tiden i kliniske studier for behandling av BRCA-mangel svulster [32-34].
PARP1
,
PARP2
, og
PARP4
var i vårt bibliotek og ikke føre til syntetisk dødelighet med noen av de medikamentelle behandlinger som indikerer at genetiske tap av PARP ikke bevisst celler til ATR hemming. Men ATR ble identifisert som den tredje høyeste scoring genet i en skjerm på jakt etter syntetiske dødelige interaksjoner med PARP hemming [35] og ATR hemming sensitivisert eggstokkreft celler til PARP hemmer Veliparib [36]. PARP-inhibering kan gi forskjellige resultater sammenlignet med genetisk tap av PARP-gener på grunn av flere PARPs i celler og behovet for fangst PARP-komplekser med DNA for celledrepende [34, 37-39]. U2OS celler behandlet med økende doser av BMN673 signifikant redusert mengden av atri er nødvendig for å drepe celler og viste markert synergi over et vidt område av doser i korttids levedyktighet-analyser (fig 6A-6C). Denne observasjonen ble enda mer uttalt i langsiktige kolonidannende analyser hvor kombinasjonsbehandling av Atri og BMN673 reduserte evnen til cellene til å danne kolonier med over 1000 ganger (Fig 6D). Lignende resultater ble oppnådd i HCT-116-celler.
(A) U2OS-celler ble behandlet med økende doser av ATR og PARP-inhibitorer i 96 timer. Cellelevedyktigheten ble målt med Alamar blue og rapportert som en prosent av den ubehandlede kontroll. Synergi mellom ATR og PARP-inhibering ved hjelp av Bliss Independence (B) og isobologram analyse (C) som beskrevet i materialer og metoder. (D) Celler ble behandlet med 1 uM atri, 2 nM PARPi, eller begge deler (A + P), og cellene ble frigjort inn i mediet uten medikamenter etter 72 timer og tillatt å danne kolonier. Feil barer i alle paneler er standardavvik (n = 3).
Tap av Rev3 og 53BP1 sensitizes kreftceller til Atri og cisplatin
Andre gener identifisert i skjermen som stille sterke syntetisk dødelighet med Atri /cisplatin kombinasjonen var
REV3L Hotell og
TP53BP1
.
REV3L
ble den fjerde høyeste scoring genet (etter
POLD2
,
ATR
, og
Atrip
) identifisert. Rev3 er den katalytiske subenhet av translesion (TLS) polymerase ζ. Det strukturelle subenheten av Pol ζ, REV7, ble også identifisert som syntetiske dødelig med Atri /cisplatin i kombinasjon med to av fire siRNAs. TLS er oppdelt i to trinn, innføring av et nukleotid overfor en skadet base og forlengelse etter innsetting [40]. Extension etter innsetting av flere TLS polymeraser er ofte utført av Pol ζ. Dette polymerase-veksling hendelse krever REV1. 3 av 4
REV1
sirnas forårsaket syntetisk dødelighet med Atri /cisplatin (robuste z-score til -1,9, -1,0 og -0,9), selv om omfanget av to av dem bare gått glipp av vår betydning terskel. Utseendet til begge subenheter av Pol ζ og polymerase som kreves for å laste det sterkt antyder tap av dette komplekse skaper overfølsomhet for Atri /cisplatin.
For å validere resultatene oppnådd i skjermen og vurdere deres generalizability vi slått ned Rev3 ved hjelp av to spesifikke siRNAs i NSCLC cellelinje H157. H157-celler utarmet av Rev3 var litt mer følsomme for høye konsentrasjoner av cisplatin enn celler som uttrykker ikke-målsøkende siRNA (figur 7A). Rev3-utarmet celler ble deretter behandlet med økende doser av atri alene, eller i kombinasjon med cisplatin. Nedbryting av Rev3 moderat sensibilisert H157 celler til Atri alene med både sirnas (Fig 7B og 7C). Økt syntetisk letalitet ble observert når cellene ble behandlet med atri /cisplatin i kombinasjon (figur 7B og 7C). I motsetning til dette, H157-celler transfektert med det ikke-målsøkende siRNA viste synergi med atri og cisplatin bare ved høye doser av atri /cisplatin i kombinasjon (figur 7D). Celler utarmet av Rev3 utstilt store mengder synergi over et bredt doseområdet Atri og cisplatin (Fig 7E og 7F). Maksimal synergi ble observert ved en dose av cisplatin like før den oppviser en hvilken som helst enkelt-middel dreping. Vi har også observert lignende resultater ved kolonidannende analyse (S1 figur) og kortsiktige levedyktighet analyser med andre NSCLC og TNBC kreft cellelinjer (S2-S4 Fiken).
(AF) H157 NSCLC celler ble transfektert med ikke målretting for siRNA (Sint) eller to sirnas målretting Rev3 (nummer 2 og 4 refererer til spesifikke sekvenser beskrevet i materialer og metoder). Cellene ble deretter behandlet med Atri, cisplatin, og Atri og cisplatin. Cellelevedyktigheten ble bestemt ved Alamar blue og rapportert som en prosent av de ubehandlede kontrollceller. (A) Sensitivitet av Rev3 knockdown celler til cisplatin. (B og C) Sensitivitet av Rev3 knockdown celler til Atri og Atri med 0,1 gM cisplatin. Bliss uavhengighet synergi mellom Atri og cisplatin kontroll (D) og Rev3 knockdown celler (E og F). Feil barer i alle paneler er standardavvik (n = 3).
Etter Rev3,
TP53BP1
var den nest høyeste score genet som ikke var en ATR sti eller en DNA replikasjon gen . 53BP1 er et DNA-skader respons protein med roller i dobbel tråd pause reparasjon. 53BP1 hindrer reseksjon på dobbel-strand pauser og påvirker sti valg for DNA-reparasjon ved å fremme ikke-homolog ende begynte [41-43]. 53BP1 er også nødvendig for å beskytte kromosom skjøre nettsteder og andre under-replikert regioner under mitose for eventuell reparasjon i den påfølgende G1 [44, 45].
For å generalisere 53BP1 genetiske forhold Atri /cisplatin kombinasjon, vi analysert reduksjon av 53BP1 i H157 NSCLC-cellelinjen. Nedbryting av 53BP1 hadde en mindre effekt på følsomheten av celler til mono cisplatin behandling (figur 8A). 53BP1-utarmet celler viste markert følsomhet for Atri behandling alene med begge sirnas testet (fig 8B og 8C). Celleviabilitet ble ytterligere redusert med den kombinerte behandlingen av Atri /cisplatin. Som tidligere observert, kombinasjonsbehandling med atri /cisplatin oppviste synergi bare ved høye doser av begge legemidler i celler transfektert med det ikke-målsøkende siRNA (figur 8D).
