Abstract
Vi har tidligere rapportert at pasienter med lunge adenokarsinomer med KRAS genmutasjoner og sterk prolifererende aktivitet hadde dårligere resultater, selv i tidlig stadium av sykdommen. Målet med denne studien var å belyse potensialet molekylære grunnlaget for disse svært ondartet lungesvulster ved å fokusere på S100 proteiner (S100A2, S100A7 og S100A11), som er nedstrøms mål for onkogene KRAS og arrangører av tumorprogresjon. Immunhistokjemisk ekspresjon av S100 proteiner ble undersøkt i 179 primær lunge adenokarsinomer, og de potensielle forholdet mellom deres nivå og clinicopathologic faktorer ble analysert. Blant de tre undertyper, S100A11 nivåene var signifikant høyere i adenokarsinomer med KRAS mutasjoner og sterk prolifererende aktivitet. De var også høyere i adenokarsinomer med dårlig differensierte svulster. Videre ble høyere nivåer av S100A11 assosiert med kortere sykdomsfri overlevelse. Disse resultatene tyder på at oppregulering av S100A11 spiller en rolle i tumorprogresjon, spesielt i KRAS-mutert lunge adenokarsinomer
Citation. Woo T, Okudela K, Mitsui H, Tajiri M, Rino Y, Ohashi K , et al. (2015) oppregulering av S100A11 i Lung Adenocarcinoma – dens potensial Forholdet til kreft progresjon. PLoS ONE 10 (11): e0142642. doi: 10,1371 /journal.pone.0142642
Editor: William B. Coleman, University of North Carolina School of Medicine, USA
mottatt: 1 august 2015; Godkjent: 23 oktober 2015; Publisert: 06.11.2015
Copyright: © 2015 Woo et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Dette arbeidet ble finansiert av departementet for utdanning, kultur, sport og Science of Japan (Tokyo Japan), og Yokohama Medical Facility (Yokohama, Japan) . Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Lungekreft er en av de vanligste årsakene til kreft-relaterte dødsfall i den industrialiserte verden [1-2]. En stor andel av pasientene, selv de med tidlig stadium ikke-småcellet lungekreft, dør på grunn av tilbakevendende sykdom [3-4]. Selv om noen lungesvulster er følsomme for konvensjonelle kjemoterapi eller visse molekylære målsøkende midler, mange er ikke [5-6]. Dermed er en dypere forståelse av det molekylære grunnlaget for lunge kreftutvikling er nødvendig for å utvikle nye terapeutiske strategier.
Vi har tidligere rapportert at pasienter med lunge adenokarsinomer med KRAS genmutasjoner og sterk prolifererende aktivitet hadde dårligere resultater, selv i den tidlige fasen av sykdommen [6]. Derfor er målet med denne studien var å belyse den potensielle molekylære grunnlaget for disse svært maligne lungesvulster ved å fokusere på S100 proteiner. S100 proteinfamilie binder seg til kalsium og modulerer overføring av ulike cellulære signaler. Vi har tidligere vist at S100A2, S100A7 og S100A11 var nedstrøms mål for onkogene KRAS (tabell 1 og 2) [7-8]. Ekspresjon av S100-proteiner ble også vist å være endret i forskjellige cancere [9-20] (laryngal [10], bryst [11], lunge [12-13], gastrisk [14], kolorektal [15], hepatocellulær [16 ], pankreas [17], prostata [18], nyre [19], og blærekreft [20]), inkludert lungekreft [12-13], og disse proteinene er blitt foreslått for å fremme utviklingen av kreftutvikling ved å modulere cellemigrering og proliferativ aktivitet [21].
Vi her undersøkt 179 kirurgisk resected primære lunge adenokarsinomer for immunhistokjemisk uttrykk for S100 proteiner (S100A2, S100A7 og S100A11), og analysert potensielle relasjoner mellom deres nivåer og clinicopathologic faktorer.
Materialer og metoder
Primær Lung Cancer
Alle 179 lungekrefttilfellene undersøkt var tilfeller av stadium i adenokarsinom som gjennomgikk radikal kirurgisk reseksjon ved Kanagawa Hjerte og åndedretts~~POS=TRUNC Senter (Yokohama, Japan). Forskningsplanen ble godkjent av etiske komiteer i Yokohama City University og Kanagawa hjerte og luftveier Center. Skriftlig informert samtykke til forskningsbruk av resected materiale ble innhentet fra alle forsøkspersoner materialer.
Histologiske undergrupper ble klassifisert i henhold til 2011 IASLC /ATS /ERS klassifisering av lunge adenokarsinom [22], og tumorstadier ble bestemt henhold til den internasjonale TNM klassifiseringssystem (syvende utgaven av UICC) [23].
Western blotting
Tissue lysater ble underkastet SDS-polyakrylamid-gel-elektroforese og overført til PVDF-membraner (Amersham, Piscataway, NJ). Membranene ble deretter inkubert med fettfri tørrmelk i Tris-bufret saltvann som inneholdt Tween-20 (TBS-T) for å blokkere ikke-immunspesifikke proteinbinding, og deretter med et primært antistoff mot S100 A11 (Santa Cruz, Santa Cruz, CA ), og beta-aktin (Sigma, St. Louis, MO). Etter vasking med TBS-T, ble membranene inkubert med dyre-matchet HRP-konjugerte sekundære antistoffer (Amersham). Immunoreaktivitets ble visualisert med en forbedret kjemiluminescens system (Amersham).
Immunohistochemistry
Kreft seksjoner ble kuttet fra formalinfiksert, parafininnstøpte vevsblokker. Snittene ble deparaffinized, rehydrert, og inkubert med 3% -ig hydrogenperoksyd, fulgt av 5% geiteserum for å blokkere endogen peroksidase aktivitet og ikke-immunspesifikke proteinbinding. Snittene ble kokt i citrat-buffer (0,01 M, pH 6,0) i 15 minutter for å hente maskerte epitoper, og deretter inkubert med primære antistoffer mot S100A2, S100A7, og S100A11 (Santa Cruz) samt Ki-67 (DAKO, Ely, UK ). Immunoreaktivitets ble visualisert ved hjelp av en Envision deteksjonssystem (DAKO), og kjerner ble kontra med hematoksylin. Den immunhistokjemiske ekspresjonsnivåene av S100 proteiner ble evaluert av et poengsystem som beskrevet under resultatene. Merkingen indeks av Ki-67 ble beregnet som andel av celler med positive kjerner mellom 500-1000 kreftceller. Ki-67 merking indekser av 10% og = 10% ble klassifisert som lave og høye nivåer basert på resultatene av vår tidligere studie [6].
Statistical Analysis
Forskjeller i score blant de gruppene som er klassifisert basert på clinicopathologic fagene ble analysert ved Mann-Whitney eller Kruskal-Wallis test. Sammenhengene mellom score og clinicopathologic fagene ble analysert ved hjelp av en multippel lineær regresjonsmodell. Den postoperativ sykdomsfri span ble definert som perioden som strekker seg fra datoen for operasjonen til datoen da tilbakefall ble diagnostisert. En observasjon ble sensurert i siste oppfølging dersom pasienten var i live eller døde av en annen enn lungekreft årsaken. Gjentakelse kurver ble plottet ved hjelp av Kaplan-Meier-metoden, og den absolutte risikoen for tilbakefall på fem år ble anslått fra disse kurvene. Forskjeller i sykdomsfri overlevelse spenn ble analysert ved hjelp av Log-rank test. P-verdier mindre enn 0,05 ble betraktet som signifikant. Alle statistiske analyser ble utført ved hjelp av SPSS programvare (SPSS for Windows versjon 10.0, SPSS, Chicago, IL, USA).
Resultater
Immunhistokjemisk uttrykk for S100 proteiner
S100A11 protein ble uttrykt i kjernen og cytoplasmaet av de normale epitelceller bronkiolene (figur 1A), mens den S100A2 proteinet ble uttrykt overveiende på den apikale side av cytoplasma i en granulær form (figur 1E).
Representative fotografier fra normale bronkioler (A, E) og tumorer, i hvilken ekspresjonen av S100A11 og S100A2 var negativ (B, F), svak (C, G) og sterk (D, H), er vist.
S100 proteinnivåene varieres på neoplastiske celler, og til og med i enkelte svulster. Ekspresjonen av disse proteiner var høyere i visse neoplastiske celler enn i bronchiolar epitelceller (Fig 1D og 1E), mens andre celler uttrykte dem svakt (figur 1C og 1G) eller på et upåviselig nivå (fig 1B og 1E). På den annen side ble det S100A7 proteinet uttrykkes bare i noen få adenokarsinomceller. Det var sterkt uttrykt i keratiniserende celler av plateepitelkarsinom (S1 Fig). Dermed ble S100A7 proteinet ekskludert fra følgende analyse.
Uttrykket nivåer av S100A2 og S100A11 ble klassifisert i negativ (nivå 0), svak (nivå 1), og sterk (nivå 2). Den svake nivået ble definert som nivået nesten tilsvarende som i bronchiolar epitelceller. Den sterke nivået ble definert som et utvetydig sterkere nivå enn i bronchiolar epitelceller. Den immunohistokjemiske Uttrykket resultatet ble bestemt som det gjennomsnittlige nivået i en maksimal tumor seksjon (hvis 30%, 10% og 60% av neoplastiske celler i den maksimale tumor-delen var negative, svake og sterke nivåer, henholdsvis det gjennomsnittlige nivået ble beregnet som «0.3×0 + 0.1×1 + 0.6×2 = 1,3»). Uttrykket nivåer av S100A2 og S100A11 i alle svulstene som ble undersøkt er vist i figur 2A og 2B.
Median uttrykk score var 1,30 i S100A11 (A) og 0,10 i S100A2 (B). S100A11 ble ikke uttrykt i 8 tilfeller (A), mens S100A2 ikke ble uttrykt i nesten halvparten av sakene (83 saker) (B). ADC, Adenocarcinoma.
Gyldigheten av immunhistokjemiske evalueringen ble støttet av Western blot analyse fordi S100 protein nivåer evaluert av immunhistokjemi og de av Western blotting var omtrent parallelt (Resultatet av en Western blot for S100A11 ble vist i S2 figur).
S100 protein nivåer og clinicopathologic faktorer
S100A11 nivåene var signifikant høyere i adenokarsinomer med KRAS mutasjoner og sterk prolifererende aktivitet (P = 0,038 i Kruskal-Wallis test , fig 3). De var også betydelig høyere i adenokarsinomer med dårlig differensierte svulster (p = 0,021 i Kruskal-Wallis test, tabell 3) og lymfesystemet eller vaskulære komplikasjoner (P = 0,026 i Mann-Whitney test, tabell 3). En multippel lineær regresjonsanalyse viste at dårlig differensierte tumorer korrelerte med høyere S100A11 nivåer (p = 0,039, tabell 4). På den annen side ble S100A2 nivåer ikke forbundet med KRAS mutasjoner, prolifererende aktivitet, eller en hvilken som helst av de andre clinicopathologic faktorer (data ikke vist).
fortykkede linjer angir den midlere poengsum på S100 A11 uttrykk, som var 1,00 i KRAS villtype /Ki-67 Low saker (n = 94), 1,50 i KRAS Villtype /Ki-67 Høye saker (n = 62), 1,20 i KRAS mutert-type /Ki-67 Low tilfeller (n = 11) og 1,80 i KRAS mutert-type /Ki-67 Høye tilfeller (n = 11). S100A11 ekspresjonsnivåene var signifikant høyere i adenokarsinomer med KRAS mutasjoner og sterk prolifererende aktivitet (P = 0,038 i det Kruskal-Wallis test). Wt, Vill-type; Mt, muterte-type.
S100A11 protein nivåer og sykdomsfri overlevelse
Siden de oppnådde resultatene antydet at oppregulering av S100A11 var involvert i tumorprogresjon, spesielt i KRAS-mutert lunge adenokarsinomer, sin prognostisk verdi ble senere bekreftet. Ett hundre og sytti-ni pasienter med lunge adenokarsinomer på scenen jeg ble undersøkt. S100A11 uttrykk score til 1,65 og = 1,65 ble klassifisert som lav og høy basert på en mottaker som opererer karakteristisk kurve (areal under kurven 0,629, 95% konfidensielt intervall 0,501-0.757). Ett hundre og atten pasienter var lav-expressers, mens 61 var high-expressers. Fem års sykdomsfri overlevelse priser var 90,1% og 76,3% i lav- og høy-S100A11 expressers, henholdsvis. Den sterke uttrykk for S100A11 korrelert med kortere sykdomsfri overlevelse i postoperative lunge adenokarsinomer (p = 0,0182 i Log-rank test, figur 4). På den annen side, var en sammenheng ikke funnet mellom S100A11 uttrykk nivåer og tuftene av tilbakevendende sykdom (data ikke vist).
Fem års sykdomsfri overlevelse priser var 76,3% i høy S100A11 expressers (n = 61) og 90,1% i lav-S100A11 expressers (n = 118). Den sterke uttrykk for S100A11 korrelert med kortere sykdomsfri overlevelse i postoperative lunge adenokarsinomer (p = 0,0182 i Log-rank test).
Diskusjoner
Blant S100 proteiner (S100A2, S100A7 og S100A11) undersøkt i denne studien, S100A11 nivåene var signifikant høyere i adenokarsinomer med KRAS mutasjoner og sterk prolifererende aktivitet (figur 3). De var også høyere i adenokarsinomer med dårlig differensierte svulster (tabell 3 og 4). Videre er den sterke ekspresjon av S100A11 korrelert med kortere sykdomsfri overlevelse (figur 4). Disse resultatene antydet at endringer i uttrykket av S100A11 spilt en rolle i tumorprogresjon, spesielt i KRAS-mutert lunge adenokarsinomer.
S100A11, også kalt S100C eller calgizzarin, tilhører S100 familien av multi-genet kalsium- bindende proteiner. Det ligger på 1q21 med 15 andre familiemedlemmer S100 og har en molekylvekt på 11.7kDa [24]. S100 familiemedlemmer regulere viktige intracellulære hendelser som enzymaktiviteter, dynamikken i cytoskeletal bestanddeler, og Ca
2 + konsentrasjoner, for å modulere cellevekst og motilitet, så vel som differensierings [9]. Oppreguleringen av S100A11 har blitt rapportert i forskjellige cancere [9], som for eksempel laryngeal [10], bryst [11], lunge [12-13], gastrisk [14], kolorektal [15], bukspyttkjertel [16], og prostata kreft [17], og har ofte blitt assosiert med kreft progresjon, impliserer sin onkogen rolle [10-17]. Tian T et al. tidligere vist at S100A11 ble oppregulert i et høyt metastatisk lungecancer cellelinje gjennom en proteomikk analyse [13]. Wang et al. rapporterte også at S100A11 nivåer økte med progresjon av sykdommen stadium i kolorektal cancer [15]. Våre resultater er i samsvar med disse funnene.
Men tidligere studier vist at S100A11 uttrykk nivåer ble redusert i svulster med høyere ondartet aktivitet i nyre [19] og blære kreft [20]. Memon AA et al. viste at S100A11 ble nedregulert i et høyere-gradert cellelinje av blærekreft ved en proteom- analyse, og den svake ekspresjon av S100A11 var assosiert med dårlig overlevelse [20]. Dette avviket innebærer kompleksiteten av kreft progresjon. For eksempel, mange former for kreft-relaterte proteiner, slik som transformerende vekstfaktor-beta, har motsatte virker som inhibitorer eller aktivatorer i forskjellige stadier av kreft progresjon [25]. Derfor kan den potensielle rollen til den avvikende ekspresjon av S100A11 i karsinogenese, varierer blant forskjellige typer av kreftformer.
I sammendrag, resultatene av den foreliggende undersøkelse antydet at oppregulering av S100A11 spilte en rolle i tumorprogresjon , spesielt i KRAS-mutert lunge adenokarsinomer. Den biologiske funksjonen til S100A11 er fremdeles uklart. Videre undersøkelser er garantert for å belyse de mekanismer som S100A11 fremmer utviklingen av lungekreft.
Hjelpemiddel Informasjon
S1 Fig. Immunhistokjemisk undersøkelse av S100A7 protein uttrykk nivåer i svulster og ikke-tumorous epitel fra lungekreftpasienter som gjennomgår kirurgisk reseksjon.
Representative fotografier fra normale bronkiolene (A), adenokarsinom (B) og plateepitelkarsinom (C) er vist. S100A7 ble ikke uttrykt i de normale epitelceller bronkiolene (A), og ble bare uttrykt i noen få adenokarsinom (ADC)-celler (B). På den annen side, var det sterkt uttrykt i keratiniserende celler av plateepitelkarsinom (SQC) (C)
doi:. 10,1371 /journal.pone.0142642.s001 plakater (TIFF)
S2 Fig.
Protein lysater fra tumorene (T) og ikke-tumorøse vev (N) av lunge adenokarsinom vev i pasienter som gjennomgikk kirurgisk reseksjon ble underkastet en Western blot-analyse for S100A11 og β-aktin (ACTB) i de representative tilfellene (A) . Signalintensitetene for bånd ble evaluert ved NIH avbildning. S100A11 nivåer ble normalisert til de av ACTB. Normaliserte nivåer er vist (B). Immunhistokjemisk ekspresjon av S100A1 i de samme tumorer ble vist (C). S100 protein nivåer evaluert av immunhistokjemi og de av Western blot var omtrent parallelt. . Cs, Case
doi: 10,1371 /journal.pone.0142642.s002 plakater (TIFF)
Takk
Vi vil spesielt takke Emi Honda og Misa Otara (Avdeling for patologi, Kanagawa hjerte-og respiratoriske senter) for deres teknisk assistanse.
