Abstract
kreft hemmer av protein fosfatase 2A (CIP2A) er et onkogen faktor som stabiliserer c-myc protein. CIP2A er overuttrykt i flere svulster, og uttrykk nivåer er en uavhengig markør for langsiktig utfall. For å avgjøre om
CIP2A
uttrykk er forhøyet i tykktarmskreft og om det kan tjene som en prognostisk markør for å overleve, vi analysert
CIP2A
mRNA uttrykk ved real-time PCR i 104 tykktarm kreft prøver.
CIP2A
mRNA ble overuttrykt i tykktarm kreft prøver og
CIP2A
uttrykk nivåer korrelerte signifikant med tumorstadium. Vi fant ut at
CIP2A
fungerer som en uavhengig prognostisk markør for sykdomsfrie og total overlevelse. Videre undersøkte vi CIP2A avhengige effekter på nivåene av c-myc, Akt og på celleproliferasjon i tre tykktarmskreft cellelinjer ved å kneble CIP2A ved hjelp av små interfererende (SI) og kort hårnål (SH) RNA. Nedbryting av CIP2A vesentlig hemmet veksten av kolon cellelinjer og redusert c-myc nivåer uten å påvirke uttrykk eller funksjon av oppstrøms regulatoriske kinase, Akt. Uttrykk for CIP2A ble funnet å være avhengig av MAPK aktivitet, knytte forhøyet c-myc uttrykk for deregulert signaltransduksjon i tykktarmskreft
Citation. Wiegering A, Pfann C, uthe FW, Otto C, Rycak L, Mäder U, et al. (2013) CIP2A Påvirker overlevelse i tykktarmskreft og er avgjørende for å opprettholde Myc Expression. PLoS ONE 8 (10): e75292. doi: 10,1371 /journal.pone.0075292
Redaktør: Gnanasekar Munirathinam, University of Illinois, USA
mottatt: 23 april 2013; Akseptert: 12. august 2013, Publisert: 01.10.2013
Copyright: © 2013 Wiegering et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. AW har finansiering fra universitetet i Würburg for en skjerm i sammenligning med APC finansieringen nummeret~~POS=HEADCOMP er: IZKF B-186. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet for denne studien. Denne publikasjonen ble finansiert av den tyske Research Foundation (DFG) og Universitetet i Wuerzburg i finansieringsprogram Open Access Publishing. Ingen nåværende eksterne andre finansieringskilder for denne studien
Konkurrerende interesser:. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Tykktarmskreft (CRC) er den mest. felles gastrointestinal malignitet. Det er ca 664 000 nye tilfeller hvert år på verdensbasis. Halvparten av disse pasientene vil dø av denne carcinoma [1]. For tiden, er standard behandling primær kirurgi og, avhengig av tumorstadium, ytterligere kjemoterapi [2]. På grunn av den høye tilbakefall, nye potensielle mål og prognostiske markører for å identifisere pasienter som er sannsynlig å dra nytte av tilleggsbehandling.
I 2007 Junttila og Westermarck identifisert kreft hemmer av protein fosfatase 2A (CIP2A) som et menneske oncoprotein. CIP2A er overuttrykt i hode og hals plateepitelkarsinom og i kolon karsinom [3]. CIP2A hemmer proteinfosfatase 2A (PP2A). PP2A i sin tur har en avgjørende rolle i omsetningen av c-myc oncoprotein, siden PP2A dephosphorylates c-myc på serin-62 (S62). Defosforylering ved S62 er nødvendig for ubiquitinering av c-Myc av ubiquitin ligase Fbw7 og dermed initierer nedbrytning av c-Myc [4]. Overekspresjon av CIP2A hemmer PP2A aktivitet og dermed stabiliserer c-myc. Følgelig induserer dette immortalisation og ondartet transformasjon av humane celler [3]. c-myc seg fortsatt den viktigste onkogene driver i tykk- og endetarmskreft [5].
Nyere studier har vist at CIP2A er overuttrykt i flere menneskelige kreftformer. CIP2A uttrykk nivåer korrelerer med total overlevelse (OS) og sykdomsfri overlevelse (DFS) i mage karsinom, i serøs eggstokkreft, i nyrecellekreft og brystkreft [6]; [7]; [8]; [9]. Ved kronisk myelogen leukemi (KML),
CIP2A
uttrykk på tidspunktet for diagnosen er en prognostisk markør for utvikling av en blastkrise senere [10]. Videre har en del onkogene faktorer, inklusive
helicobacter pylori
og papillomavirus E7 16, oppregulerer ekspresjonen av CIP2A, og dette kan være kritisk for deres onkogene aktivitet [11]; [12].
Nylig har to grupper rapporterte motstridende resultater når det gjelder virkningen av prognostisk CIP2A i kolorektal cancer [13], [14]. Böckelman et al. studerte 752 pasienter, men kan ikke fastslå noen prognostisk betydning; I motsetning Teng et al. studerte 167 pasienter og identifisert CIP2A uttrykk som en prognostisk faktor for tykktarmskreft.
Formålet med denne studien var å ta relevansen av CIP2A uttrykk i tykktarmskreft. Først analyserte vi uttrykk for
CIP2A
i en kohort av 104 kolon kreftpasienter med dokumentert oppfølging og bekreftet sin overekspresjon. Dernest undersøkte vi sammenhengen mellom
CIP2A
mRNA uttrykk og klinisk-patologiske variabler; til slutt, ønsket vi å bestemme molekylveiene som regulerer CIP2A uttrykk, og er regulert av CIP2A. Våre data støtter tanken om at deregulert uttrykk for CIP2A er en kritisk onkogen hendelse i colon carcinoma.
Pasienter og metoder
Pasientprøver
Ett hundre og fire pasienter med tykktarmskreft ble inkludert i studien. Alle pasienter operert ved Universitetssykehuset i Würzburg, Tyskland, mellom 2003 og 2012. Ingen av pasientene hadde fått kjemoterapi eller strålebehandling før operasjonen. Behandlinger etter operasjonen ble utført i henhold til retningslinjer for behandling av tykktarmskreft. Diagnosen ble bekreftet ved histopatologisk undersøkelse av prøvene. Etter operasjonen ble tumorprøver samlet opp og lagret i flytende nitrogen. Kliniske data av alle pasientene ble samlet inn fra sykehus poster og påfølgende poster ble samlet inn via Comprehensive Cancer Centre Main.
Etikk erklæringen
Etisk godkjenning for denne forskningen ble hentet fra Human forskningsetiske komité ved Universitetet i Würzburg. Alle pasienter som ga svulstvev og prøvene normale kolon vev for denne forskningen undertegnet en samtykkeerklæring før kirurgisk fjerning av tarmkreft.
Cellelinjer og cellekultur
Caco2, HCT116 og SW620 -celler ble kjøpt fra American Type Culture Collection. Alle celler ble dyrket i DMEM supplert med 10% føtalt kalveserum und 1% penicillin /streptomycin.
Sanntids Kvantitativ Reverse Transcription-PCR analyse
Gene uttrykk for
CIP2A
ble analysert ved hjelp av real-time PCR. Totalt cellulært RNA ble ekstrahert fra tumorprøver og cellelinjer med RNeasy MINIKIT (Qiagen, Hilden, Tyskland) i henhold til produsentens instruksjoner. Primersett (Qiagen) som målrettede
CIP2A
RNA ble designet av Biomers (Ulm, Tyskland). Matchet menneskelige kolon cDNA (Pharmingen, Heidelberg, Tyskland) fungerte som en positiv kontroll, standardisert til baseline. Renhold gener, glyseraldehyd-3-fosfat dehydrogenase (
GAPDH
) og beta-2 mikroglobulin (
b2MG
) ble brukt som interne standarder for relativ kvantifisering og cDNA kvalitetskontroll. Alle PCR reaksjoner ble utført med en DNA Engine Opticon 2 System (MJ Research, Biozym; Oldendorf, Tyskland). Relativ kvantifisering, basert på den ganger forskjell, ble beregnet med terskelsyklusen (Ct) -metoden, uttrykt som 2
-ΔΔCt (Primer-sekvensen i tabell S1).
immunoblotanalyse
dyrkede celler ble skylt tre ganger med iskald PBS, høstet, og lysert direkte i RIPA-prøvebuffer for Immunoblot-analyse. Celleavfall ble fjernet ved sentrifugering ved 12.000 g i 10 min ved 4 ° C, og supernatanten ble anvendt som totalt protein lysatet. For hver prøve ble 10 ug av totalt protein lysat ble underkastet 10% natriumdodecylsulfat-polyakrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE), fulgt av Immunoblot-analyse. Immunoblotter ble analysert med antistoffer mot CIP2A (A301-454A; Bethyl Laboratories), c-myc C33 (C33, # 42; Santa Cruz), beta-aktin (AC-15 /A5441, Sigma), vinculin (V9131, Sigma), AKT, Pakt
473 (cs-9271), gsk3 (cs-9315), pGSK Serine-9 (cs-9336), S6 (cs-2212), PS6 (cs-2215); pmTOR (cs-2917), og mTOR (cs-2972). Alle antistoffer var fra Cell Signal og ble brukt i henhold til produsentens instruksjoner. Blottene ble visualisert med sekundære antistoffer (GE Healthcare) mot mus (NA9310) eller kanin (NA9340) primære antistoffer.
Immunohistochemistry
CIP2A antistoff var den samme som for immunoblotanalyse, isotypekontrollantistoff antistoff ble kjøpt fra eBioscience (San Diego, USA). Det sekundære antistoff var et Cy3-konjugert AffiniPure anti-kanin-IgG ved en fortynning 1:200. CIP2A farging ble utført på kryostatsnitt av snap-frosne tykktarmskreft prøver uttrykker ulike CIP2A mRNA nivåer med nabo normal kolon vev og 10 normale kolon prøver. Kryostatsnitt (5 um) ble inkubert med det primære antistoff eller kontroll-antistoff, etterfulgt av inkubasjon med det sekundære Cy3-konjugert antistoff. Lysbilder ble kontra med DAPI (4 «, 6-diamidino-to-phenylindoldihydrochlorid) (Sigma-Aldrich, Steinheim, Tyskland) og dekket med polyvinyl-alkohol montering medium (DABCO, Sigma-Aldrich) og analysert ved hjelp av en Zeiss-kamera (Oberkochen, Tyskland).
siRNA Transfeksjon
For å dempe genuttrykk, celler ble transfektert med små interfererende RNA (siRNAs). On-target pluss SMART basseng (Dharmacon) siRNA å målrette CIP2A (L-014135-01-005) og en kontroll siRNA (D-001810-10-05) ble brukt. SiRNA bassenger (endelig konsentrasjon 100 nM) ble transfektert inn i cellene med RNAimax kit i henhold til produsentens protokoll. Cellene ble høstet 72 timer senere; uttrykk av proteiner ble bestemt ved immunoblotanalyse.
shRNA og Lentivirus
For å dempe CIP2A mRNA uttrykk med kort hårnål RNA (shRNA) sekvenser, målretting
CIP2A
ble klonet inn i en lentivirus vektor (plko1 puro), i henhold til produsentens protokoll. Vektoren ble transient transfektert inn HEK293t cellene sammen med pakken plasmider. Etter 48 og 72 timer ble supernatanter inneholdende virus samlet opp og filtrert. Tykktarmskreft cellelinjer ble infisert med CIP2A lentivirus og 24 timer senere, infiserte celler ble valgt med puromycin. Forsøkene ble utført med de valgte cellene.
Colony Forming analyse
2,5 × 10
3 celler infisert med shRNA CIP2A eller Scr. ble sådd ut på seks brønns plater. Koloniene ble farget med 0,5% krystallfiolett i 20% etanol. Bilder ble tatt og relativ tetthet bestemt med ImageJ.
Statistical Analysis
Univariat analyser for å fastslå tilknytning til overlevelse ble evaluert med Kaplan-Meier-kurver, og sammenligninger ble utført av Mann-Whitney U-test. Multivariate analyser ble utført med en Cox regresjonsmodell. P-verdier 0,05 ble ansett som statistisk signifikant
Resultater
Uttrykk for CIP2A og Clinicopathological variabler for tykktarmskreft Pasienter
Uttrykk for
CIP2A
mRNA. ble først vurdert ved hjelp av uttrykk datasett avledet fra en publisert microarray analyse, som opprinnelig ble utført for å identifisere prognostiske markører for kolorektal karsinom i henhold til lymfeknutemetastase status [15]. Komplett datasett (DFS, tumor etapper), sammenligner
CIP2A
mRNA uttrykk i carcinoma som i matchet tilstøtende vev, var tilgjengelig for 226 karsinomer.
CIP2A
uttrykk ble testet ved hjelp av to uavhengige sonder til stede på denne matrisen. Vi fant ingen sammenheng mellom
CIP2A
uttrykk og alder ved diagnose eller kjønn i dette datasettet, men
CIP2A
mRNA ble uttrykt på et høyere nivå i kolorektal kreft vev enn i de matchet tilstøtende vev i begge probe sett (data ikke vist). Forbløffende høy
CIP2A
mRNA uttrykk korrelerer signifikant med redusert sykdomsfri overlevelse (DFS) (fig. S1 A, B). I separate analyser av pasienter i Union for International Cancer Control (UICC) stadium I (tumorinfiltrasjon til muskularis propria), II (tumorinfiltrasjon utover muskularis propria) eller III (lymfeknutemetastase), bare pasienter i stadium UICC III viste en signifikant korrelasjon mellom
CIP2A
uttrykk og DFS. Til sammenligning pasienter i stadium UICC I og II viste bare en svak sammenheng mellom lav
CIP2A
uttrykk og forlenget overlevelse som nådde ikke statistisk signifikans. Dette kan være på grunn av det lille antallet av prøver og færre tilbakefalls arrangementer i forhold til pasienter i stadium UICC III (fig. S2A-C). Som DFS ikke kan nås i trinn UICC IV (fjernmetastaser), var det ikke mulig å analysere korrelasjonen av
CIP2A
uttrykk for overlevelse av pasienter i stadium UICC IV med dette datasettet.
Vi videre analysert
CIP2A
mRNA nivåer i et uavhengig sett av 104 kolorektal kreft vevsprøver ved hjelp av en RT-QPCR tilnærming. Uttrykket av
CIP2A
mRNA ble bestemt i forhold til to housekeeping gener, beta-2 mikroglobulin (
b2MG
) og glyseraldehyd-3-fosfat dehydrogenase (
GAPDH
). Uttrykket nivåer ble sammenlignet med median
CIP2A
mRNA-ekspresjon i normalt mucosal vev.
CIP2A
uttrykk i forhold til
b2MG
eller slektning til å
GAPDH
viste en høy korrelasjon (R
2 = 0,86) (fig. S3). I samsvar med tidligere funn på CIP2A uttrykk i kreft, fant vi
CIP2A
mRNA uttrykk i 93 av 104 (89,4%) kreftprøver for å være minst fire ganger høyere enn hos normale tykktarm slimhinnevevet. Videre
CIP2A
ekspresjonsnivået var signifikant korrelert til UICC trinnet, lymfeknutemetastase, fjern metastase, og histologisk gradering tumor (fig. 1). Vi fant ingen sammenheng mellom
CIP2A
uttrykk og pasientens alder, kjønn eller kreft plassering (høyre vs venstre colon) (tabell S2).
Panelene Vis boks og whisker tomter dokumentere relative
CIP2A
mRNA-nivåer i tumorer stratifisert i henhold til UICC trinn (A) (UICC i sammenlignet med II p 0,0001; II vs. III p = 0,0046; III IV vs. p = 0,0002), i henhold til lymfe metastaser (B; N- vs. N + p 0,0001), i henhold til fjernmetastaser (C; M0 vs. M1 p 0,0001), og i henhold til histologisk gradering (D: G2 vs. G3 p = 0,0084) .
CIP2A mRNA uttrykk og Postoperativ Survival of Colon kreftpasienter
Total overlevelse (OS) ble brukt for overlevelsesanalyse. Total overlevelse ble definert som tidsintervallet mellom kirurgi og tumorassosiert død. Univariate 1-, 3- og 5-års OS analyser viste at pasienter med avansert primær tumor stadium, lymfeknutemetastase, fjernmetastaser, avansert UICC-scenen, og høye histologiske karakterer hadde verste utfall (tabell 1). For ytterligere analyse, ble pasientene delt inn i to grupper, med
CIP2A
uttrykk ovenfor (høy) eller under (lav) medianverdien. Pasienter med høy
CIP2A
mRNA uttrykk hadde signifikant lavere OS enn de med lav
CIP2A
mRNA uttrykk (Fig. 2A, B). Sammenligning av pasienter i UICC stadier I-IV separat med høy og lav
CIP2A
mRNA uttrykk, bare i UICC III scenen, pasienter med høyt
CIP2A
nivåer hadde en redusert OS (Fig. 2C, D). I tillegg viste en multivariat analyse som et avansert UICC-scenen og høy
CIP2A
uttrykk (
CIP2A
over median og
CIP2A
uttrykk som brukes som en kontinuerlig markør) var uavhengig prognostiske faktorer for dårlig utfall hos pasienter med tykktarmskreft (tabell 2).
grafene viser Kaplan-Meier-kurver av OS etter
CIP2A
mRNA uttrykk. (Red:
CIP2A
mRNA uttrykk under median kaste uttrykk verdi av 10,5 over normalt vev), grønn:
CIP2A
mRNA uttrykket over median kaste uttrykk verdi av 10,5 over normalt vev) (A B) Alle pasienter med hensyn til
CIP2A
mRNA uttrykk normalisert til husholdningsgenet (n = 75) (A: b2MG; B: GAPDH) (C) pasienter i Stage UICC II med hensyn til
CIP2A
mRNA uttrykk normalisert til husholdningsgenet GAPDH (n = 29) (D) Pasienter i Stage UICC III med hensyn til
CIP2A
mRNA uttrykk normalisert til husholdningsgenet GAPDH (n = 21).
For å teste om
CIP2A
mRNA uttrykk er korrelert med CIP2A protein uttrykk i CRC, ti normale slimhinner vevssnitt, fire CRC vevsprøver uttrykker lav
CIP2A
mRNA nivåer og prøver fem vev uttrykker høy
CIP2A
mRNA nivåer ble farget for CIP2A protein uttrykk. I normale slimhinner vevssnitt, ingen eller bare en meget svak farging for CIP2A kunne påvises (resultater ikke vist). Kreft uttrykker lave nivåer av
CIP2A
mRNA viste en svak farging for CIP2A protein, mens kreft uttrykker høy
CIP2A
mRNA nivåer viste en sterk farging for CIP2A protein. Dette viser resultatene at CIP2A protein og mRNA nivåer korrelerer tett
in vivo
. (Fig. 3).
Panelene viser representative eksempler på immunfluorescens farging, viser CIP2A protein uttrykk i kreftceller hos pasienter med lav (A + B) eller høy
CIP2A plakater (C + D ) mRNA uttrykk (A + C x100, B + D x200 forstørrelse).
Effekter av CIP2A Nedbryting på cellevekst og Myc Expression i CRC
Vi ønsket videre å avklare innflytelse av CIP2A på sin target proteiner i CRC cellelinjer. Protein uttrykk for CIP2A ble betydelig redusert i tre kolon cellelinjer (Caco2, HCT116 og SW620) etter behandling med spesifikke siRNA mot
CIP2A
. Videre CIP2A knockdown ført til betydelige reduksjoner i c-myc nivåer i alle tre cellelinjer (figur 4A;. N = 3 for hver cellelinje). Dette skyldes posttranskripsjonelt regulering av c-myc protein nivåer, siden vi oppdaget ingen endring i
MYC
mRNA uttrykk (fig 4B,. N = 3). Tidligere studier indikerte at CIP2A knockdown førte til en redusert aktivitet av Akt, vist ved redusert fosforylering på serin 473 (Pakt
473), og dermed hemmet PI3K /mTOR veien. Men vi har ikke funnet noen vesentlige endringer i fosforylert Akt etter CIP2A knockdown i Caco2, HCT116 eller SW620 celler. Videre fosforylering av nedstrøms Akt målene, inkludert pmTor, PS6, og pGsk3, ble ikke signifikant endret etter knockdown av CIP2A (fig 4C,. N = 3 for hver cellelinje). Alt i alt viser dette at c-myc-protein er under kontroll av CIP2A i CRC, mens PI3K /mTOR-ser ut til å være uavhengig av CIP2A.
(A) Immunoblot-analyse av CIP2A og c-Myc-protein ekspresjon i Caco2, HCT116 og SW620 celler transfektert med siRNA rettet mot CIP2A eller kontrollere siRNA. Cellene ble høstet 72 timer etter transfeksjon (n = 3 for hver cellelinje). (B) Real-time PCR-analyse av
CIP2A Hotell og
c-myc
mRNA uttrykk i HCT116-celler transfektert med siRNA rettet mot CIP2A eller kontrollere siRNA (n = 3). (C) Nedbryting av CIP2A ikke endrer aktiveringsstatusen til AKT eller nedstrøms mål. Panelene viser immunoblot av de angitte proteiner og fosforylerte proteiner (p) i Caco2, HCT116 og SW620 celler transfektert med siRNA rettet mot CIP2A eller kontrollere siRNA som før (n = 3 for hver cellelinje).
fordi sirnas er vanligvis tapt over tid, og for å utelukke off-target effekter, testet vi to forskjellige shRNAs målretting
CIP2A
å evaluere veksthemmende effekten av CIP2A knockdown. HCT116-celler ble infisert lentiviral med vektorer som bærer shRNAs mot
CIP2A
. Immunoblotanalyse analyser viste betydelig knockdown av CIP2A protein med tilsvarende reduksjon av c-myc proteinnivåer (figur 5A;. N = 2). Følgelig celleproliferasjon ble merkbart endret i celler infisert med shRNA mot
CIP2A plakater (figur 5B;. N = 2).
(A) Immunoblot-analyse av CIP2A og c-Myc-protein ekspresjon i HCT116-celler infisert lentiviral med shRNA targeting CIP2A eller en ctr. shRNA. Tallene under linjene angir det c-myc-proteinekspresjon i forhold til c-myc nivået i kontrollcellene (N = 2). (B) kolonidannelse av HCT116-celler etter 7 dager. (
Top
), tetthet av kolonier farget med krystallfiolett; (
nederst
), representant for de angitte kulturer (n = 3).
CIP2A Expression er Nedstrøms MEK kinase i CRC
For å identifisere potensielle oppstrøms regulatorer av
CIP2A
uttrykk, vi behandlet Caco2, HCT116 og SW620 celler med UO126, en godt karakterisert MEK1 /2-hemmer [16]. Behandling med UO126 i 24 timer førte til en betydelig reduksjon i
CIP2A
mRNA og CIP2A proteinekspresjon i forhold til DMSO-behandlede celler (figur 6A, B,. N = 3 for hver cellelinje). Denne effekten var mer uttalt hos celler som næret en MAPK sti mutasjon som SW620 (
KRAS
) og HCT116 (
KRAS
), enn i Caco2 celler som er villtype for
KRAS
.
Caco2, HCT116 og SW620 celler ble behandlet med DMSO eller MEK hemmer UO126 for 24 (n = 3 for hver cellelinje). (A) Immunoblot-analyse av CIP2A og p-ERK proteinekspresjon i Caco2, HCT116 og SW620. (B) Real-time PCR-analyse av
CIP2A
mRNA uttrykket (* 0,05; ** 0,005)
Diskusjoner
Nylig «The. Cancer Genome Atlas Network «viste at deregulert c-myc ekspresjonen er et kjennetegn på praktisk talt alle CRC, uavhengig av settet av spesifikke mutasjoner som er til stede i hver tumor [5]. For eksempel mutasjoner i tumor suppressor
APC Hotell og onkogen
KRAS
føre til en oppregulering av
MYC
mRNA [5]. På posttranskripsjonelt nivå, tap av miR34 familie av hypermethylation, som forekommer i over 90% av alt CRC, stabiliserer
MYC
mRNA [17], [18]. Videre, en musemodell for tykktarmskreft drevet av tap av
APC
viser at kolon tumordannelse er avhengig av kontinuerlig c-myc uttrykk [19].
Så langt er lite kjent om posttranslational regulering av c-myc-nivåer i CRC. I denne studien, viste vi at
CIP2A
uttrykk er forhøyet i colon carcinoma prøvene, sammenliknet med sitt uttrykk i normal, tykktarmen vev, og at
CIP2A
uttrykket er negativt korrelert med både OS og kliniske patologiske parametre. Siden det er ingen validerte cut-off poeng for
CIP2A
uttrykk nivåer for å avklare høye kontra lave uttrykk grupper, vi brukte median mRNA uttrykk nivå som cut-off point. Til tross for et relativt lavt antall pasienter i vår studie, og dermed et relativt lavt antall kreftrelaterte dødsfall i subgruppeanalyser, kunne vi påvise en signifikant korrelasjon på
CIP2A
nivåer med tumor-assosiert overlevelse.
to tidligere studier analysert ekspresjonsnivåer av CIP2A i CRC og viste forbedrede nivåer i CRC relativt til normal slimhinne, i samsvar med de resultatene som presenteres her, [13], [14]. Videre er en nær sammenheng mellom CIP2A og MYC nivåer har vært nevnt før [3], [13] og vi viser her at forhøyede nivåer av CIP2A er nødvendig for å opprettholde Myc uttrykk i CRC cellelinjer. Overraskende nok korrelasjon med OS ble sett i bare en av de tidligere studier [14]. Selv om vi ikke vet den nøyaktige årsaken til avviket, vi oppmerksom på at både Teng et al. [14] og vårt studium tilordnet en forholdsvis høy prosentandel av pasienter til den lave ekspresjon gruppen (68 og 50%, respektivt), mens Böckelman et al. [13] er definert bare 15% av pasientene som lave CIP2A uttrykk svulster. Vi foreslår at disse forskjellene i lagdelingen av pasienter i henhold til CIP2A nivåer kan forklare de ulike resultatene. Oppfatningen om at CIP2A er overuttrykt i tykktarmskreft, og dermed styrke MYC protein nivåer og påvirke tumorrelatert overlevelse, er i samsvar med tidligere resultater i andre solide tumorer [6]; [7]; [8]; [9]. En prospektiv studie vil være nødvendig å vurdere om CIP2A uttrykk på mRNA eller protein nivå kan tjene som en prediktiv markør for overlevelsen av pasienter med CRC.
Det ble tidligere vist at CIP2A stabiliserer c-myc ved å hemme PP2A mediert degradering i tumorceller [3]. I samsvar med denne modellen, viser den foreliggende studie som nedregulering av c-Myc-proteinet er observert når CIP2A er dempet med sirnas eller shRNAs i kolorektal karsinom celler. På grunn av det faktum at vi brukte cellelinjer som bærer forskjellige mutasjoner for onkogene veien ofte mutert i CRC (Caco2: APC
Mut, KRAS
vekt, PI3K
vekt, HCT116: APC
vekt, ß catenin
Mut, KRAS
Mut, PI3K
Mut, SW620: APC
Mut, KRAS
Mut, PI3K
wt), postulerer vi at avhengigheten av c-myc protein uttrykk på CIP2A er uavhengig av nærværet av mutasjoner i WNT, PI3K /mTOR eller MAPK-reaksjonsveier, men dette må evalueres ytterligere. Vi fant også at shRNA-mediert uttømming av CIP2A i HCT116 kolon carcinoma celler markert redusert sine vekstpotensial. Dette er konsistent med rapporter som CIP2A hemming resulterte i vekst arrest og redusert klonogene potensial i flere andre kreftformer [6]; [7]; . [8]
PP2A dephosphorylates Pakt og CIP2A forbedrer PI3K /mTOR signal ved å hemme PP2A mediert defosforylering av Pakt i hepatocellulært karsinom (HCC) [20]; [21], [22]. Våre resultater viser at uttømming av CIP2A ekspresjon i kolorektal kreftceller ikke påvirker Akt signalering, i motsetning til observasjoner i HCC celler. Vi fant heller ingen eller kun små endringer i pakt nivåer eller kjente Akt nedstrøms mål. Mest sannsynlig, derfor skiller PP2A aktivitet mot noen av sine substrater (Akt) mellom ulike vev.
Man vet lite om mekanismen bak den forbedrede uttrykk for CIP2A i ondartede celler. I magekreft,
Helicobacter pylori
infeksjoner up-regulere
CIP2A
uttrykk gjennom en Src /Erk avhengig vei [11]. Humant papillomavirus 16E7 oncoprotein oppregulerer
CIP2A
i livmorhalskreft [12]. Det er foreløpig uklart hva som bidrar til CIP2A overekspresjon i tykktarmskreft. To funnene støtter hypotesen om at CIP2A uttrykk i tykktarmskreft er nedstrøms av MAPK veien. Første, tidligere arbeid viste at CIP2A uttrykket er positivt korrelert med EGFR-ekspresjon [13]. MAPK-reaksjonsveien er en av de viktigste mål for EGF signalering. For det andre viste vi at CIP2A er nedregulert etter hemme MAPK veien i tre kolon carcinoma cellelinjer; downregulation i cellelinjer huse en
KRAS
mutasjon (HCT116, SW620) er mer uttalt enn i Caco2 ikke huse en MAPK-sti mutasjon. Induksjon av CIP2A kan derfor være en kritisk megler som knytter deregulert mitogen signalisering til økt c-myc uttrykk i CRC.
I konklusjonen, resultatene av denne studien viser at
CIP2A
er assosiert med kolorektal kreft relatert overlevelse. Høy uttrykk for
CIP2A
mRNA er korrelert med redusert DFS og OS. Derfor
CIP2A
representerer en ny prognostisk faktor i diagnostikk av tykktarmskreft. I tillegg kan CIP2A være et lovende terapeutisk mål i utviklingen av behandlinger for tykktarmskreft.
Hjelpemiddel Informasjon
Figur S1.
Kaplan-Meier-kurver av sykdomsfri overlevelse av alle pasienter (n = 226) i forhold til
CIP2A
mRNA uttrykk status i publisert microarray analyse. (A B) DFS av alle pasienter i henhold til microarray probe sett
doi: 10.1371 /journal.pone.0075292.s001
(EPS)
Figur S2..
Sykdomsfri overlevelse av pasienter med tykktarmskreft i UICC I-III scenen, gruppert etter
CIP2A
mRNA uttrykk status. (A) UICC I; (B) UICC II; . (C) UICC III
doi: 10,1371 /journal.pone.0075292.s002
(EPS)
Figur S3.
Lineær regresjonsanalyse av relativ
CIP2A
mRNA uttrykk normalisert til to housekeeping gener, b2MG og GAPDH (n = 104; r
2 = 0,86). Den lineære regresjon er svært signifikant (p 0,001)
doi:. 10,1371 /journal.pone.0075292.s003 plakater (PSD)
Tabell S1. .
Primer sekvenser
doi: 10,1371 /journal.pone.0075292.s004 plakater (docx)
Tabell S2.
Kjennetegn på pasienter med CRC og sammenheng mellom
CIP2A
uttrykk og clinicopathologic variabler (lymphovascular invasjon og plassering ble dokumentert for 100 pasienter)
doi:. 10,1371 /journal.pone.0075292.s005
(DOCX)
takk
Vi takker Christian Jurowich, Christoph Isbert og Andreas Thalheimer for innsamling tumorprøver.
