Abstract
Økende bevis indikerer at ulike kreftcelletyper kan produsere IgG. Den nøyaktige funksjon av kreft-avledede IgG er imidlertid ikke blitt klarlagt. Her demonstrerte vi uttrykket av IgG gener med V (D) J rekombinasjon i 80 tilfeller av kolorektal kreft, fire tykktarmskreft cellelinjer og en svulst bærende immunmangelfull mus modell. IgG uttrykk var assosiert med tumor differensiering, pTNM scenen, spredning til lymfeknuter og inflammatorisk infiltrasjon og positivt korrelert med de uttrykk for cyclin D1, NF-kB og PCNA. Videre undersøkte vi effekten av kreft-avledede IgG på de ondartede atferd av kolorektal kreft celler og viste at blokkering av IgG resulterte i økt apoptose og påvirkes negativt potensial for forankringsuavhengig kolonidannelse og kreftcelle invasjon. Disse funnene tyder på at IgG syntetisert av kolorektal kreft celler er involvert i utvikling og vekst av tykktarmskreft og blokkering av IgG kan være en potensiell terapi i behandling av denne kreft
Citation. Niu N, Zhang J, Huang T Sun Y, Chen Z, Yi W, et al. (2012) IgG Expression i Human tykktarmskreft og dens forhold til Cancer Cell atferd. PLoS ONE 7 (11): e47362. doi: 10,1371 /journal.pone.0047362
Redaktør: Georgina L. Hold, University of Aberdeen, Storbritannia
mottatt: 9. juni 2012; Godkjent: 11 september 2012; Publisert: 01.11.2012
Copyright: © 2012 Niu et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra unge og middelaldrende Forskere Forskning Awards Fundation i Shandong-provinsen (No. BS2011SW051), og Natural Science Foundation of China National til NN (nr 81100885). Forfatterne erkjenner også National Natural Science Foundation i Kina for å JG (nr 30971150). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Nylig flere rapporter er publisert beskriver uttrykket av immunglobuliner i ikke-lymfoide celler inkludert flere sarkomer og karsinomer [1] – [4]. Før disse rapportene, immunoglobuliner har alltid vært kjent for å bli produsert utelukkende av B-lymfocytter. IgG er påvist i tykktarm kreft vev av noen få tilfeller og fragment av IgG konstant region har blitt sett i et par av tykktarmskreft cellelinjer. Med et antistoff mot CA215, som var en del av immunoglobuliner uttrykt av eggstokkreft celler, Lee et al oppdaget at IgG-tung kjede konstante regioner i colon cancer vev med en positiv andel på 44% [1], [5]. I 2003, Qiu et al demonstrerte ekspresjonen av IgG i vev av 6 tilfeller av kolorektal kreft (CRC) og i en colon carcinoma cellelinje (HT29) [3]. Med RT-PCR, Kimoto et al oppdaget at IgG-tung kjede-konstant område fra en tykktarmskreft cellelinje SW116 [2].
In vitro
studie med en HT-29 colon carcinoma cellelinje indusert med ASODN antydet at kreft-avledede IgG undertrykkes apoptose [6], som var i tråd med resultatene av Lee et al [1] og Qiu et al [3] som viser tumorvekstinhibering med et karsinom cellelinje i dyr og in vitro-eksperimenter. Disse observasjonene gir opphav til hypotesen om at kreft-avledet IgG fremmer tykktarmskreft vekst og dette er fokus for denne studien
Så langt, forholdet mellom IgG uttrykk og clinicopathological funksjoner og biologiske markører [7]. – [9] assosiert med prognose og respons på behandlingen i CRC er ikke undersøkt. I denne studien undersøkte vi først ekspresjonen av IgG i vev på 150 CRC tilfeller og analysert korrelasjonen av IgG ekspresjon og flere clinicopathological og biologiske egenskaper. Da IgG-produksjonen ble bekreftet i fire CRC-cellelinjer ved både protein og mRNA-nivåer. Flere deler av IgG tunge og lette kjeder og viktige enzymer for syntese IgG ble påvist i prøvene. Effektene av IgG på ondartede biologiske atferd som spredning, klone formasjon, invasjon og apoptose ble undersøkt med eksperimenter av antistoff nøytralisering og siRNA hemming. Resultatene gir innsikt i nye klinisk-patologiske roller kreft-avledet IgG i CRC og styrke begrunnelsen for å utvikle behandlingsformer som er rettet mot kreft-avledet IgG.
Materialer og metoder
Vevsprøver
formalinfiksert, parafininnstøpte vev fra 150 saker som hadde blitt behandlet /analysert for CRC og de matchet normale tykktarmsslimhinnen prøver (brukt som negative kontroller) og tjue friske biopsiprøver av kolorektal adenokarsinom ble samlet inn fra Affiliated Hospital Weifang Medical University. pTNM fasen ble gjort i henhold til TNM staging system av AJCC /UICC [10]. Differensiering av kreft ble gradert og /moderat eller dårlig. Inflammatorisk infiltrasjon ble vurdert i henhold til kriteriene for kronisk betennelse (mononukleære celleinfiltrasjon) beskrevet tidligere [11]. Studien ble godkjent av etisk komité Weifang Medical University og skriftlig samtykke er innhentet fra pasienter
Cellelinjer
Menneske CRC cellelinjer av ulik differensiering (moderat differensiert, HT29 og SW480.; dårlig differensiert, LoVo og HCT116) [12] og Raji (B lymfatisk leukemi-cellelinje som en positiv kontroll), Jurkat (T lymfatisk leukemi-cellelinje som en negativ kontroll) ble anskaffet fra ATCC (juni 12, 2008). CRC-cellelinjer ble dyrket i DMEM med ultralav-IgG føtalt bovint serum (Gibco, Carlsbad, CA, USA) og i DMEM bare 12-24 timer før forsøket.
Immunhistokjemi
Immunhistokjemi ( IHC) ble utført på CRC og som samsvarer marginale vev med hensiktsmessige kontroller som tidligere beskrevet [13], [14]. Detaljer om primære antistoffer mot immunglobulin γ kjeden (Igγ), immunoglobulin κ kjeden (Igκ), CEA (carcinoembryonic antigen), CD16 (FcγR III), CD32 (FcγR II), CD64 (FcγR I), P53, PCNA, BCL-2 , MMP-2, NF-kB, og Cyclin D1 er oppført i tabell S1. Normalt geiteserum i stedet for primært antistoff ble anvendt som negative kontroller. Dobbel merking av IgG og NF-kB eller Cyclin D1 eller PCNA i kreftceller ble utført som tidligere beskrevet [15].
Scoring immunoreaktivitets
De fargede seksjonene ble undersøkt og scoret uavhengig av to av forfatterne (NN og WY) uten informasjon om de clinicopathological data. Evalueringen ble utført på fem tilfeldig utvalgte kreft regioner på en 400 × forstørrelse. Nivåene av IgG uttrykk i kreftcellene var basert på summen av score på prosentandelen av positive celler (scoret som 0 = 5%, 1 = 5-25%, 2 = 25-50%, 3 = 50%), og som av fargeintensitet (scoret som: 0, fravær av signal, 1, lys rød eller rosa, 2, rød, 3, mørk rød). Sakene med score til 0-3 ble merket som «svakt farget «og sakene med 4-6 som» sterkt farget «. Atom beliggende proteiner ble bare scoret i henhold til deres positive prosent i kreftceller [16]. 25% ble gruppert som «negative», ≥25% ble gruppert som «positive»
cRNA sonde forberedelse og in situ hybridisering
Den passende lengde probe for ISH var 300-500 bp, og de konstante regioner av κ og λ kjeden var for kort til å være effektive sonder. Derfor to spesifikke cRNA antisense-prober rettet mot humant immunoglobulin-tung kjede G1 (IGHG1) ble fremstilt og in situ hybridisering (ISH) ble utført som beskrevet tidligere [4], [17]. Mandel vev og vev av lymfatiske knuter i kolorektal veggen ble anvendt som den positive kontroll, og mandel vev lysbilder inkubert med sense prober eller CRC vev inkubert med en ubeslektet probe ble anvendt som negative kontroller.
korte tandem gjentagelse analyse
Short tandem repeat (STR) analyse av CRC cellelinjer ble utført av LAND · HUAGENE BIOSCIENCES CO., LTD (Guangzhou, Kina) med
flowcytometri PowerPlex 16 HS System (Promega).
for påvisning av IgG, flowcytometri med HT29, SW480, HCT116, ble Lovo-cellelinjer utført som beskrevet tidligere [3]. Monoklonale mus anti-human Igγ (1:500, Sigma) og FITC-merket geite-anti-mus IgG (1:100, Jackson, West Grove, PA, USA) ble anvendt som de primære og sekundære antistoffer. Raji-cellelinjen ble brukt som en positiv kontroll. FITC-CD19 (Sigma) ble brukt for å undersøke for mulig forurensning av B-lymfocytter.
Immunofluorescence dobbeltfarging
Immunofluorescence (IF) dobbel farging med Igγ og Igκ ble utført på cellelinjer som beskrevet tidligere [4], [13]. Geit-anti-kanin-IgG-TRITC (1:100, Jackson) eller geite-anti-muse-IgG-FITC (1:100, Jackson) ble anvendt som det sekundære antistoff. Normal mus IgG og normal kanin IgG (Santa Cruz) ble anvendt i stedet for de primære antistoffer. DAPI (blå signal) (1:500; Sigma) ble anvendt for å visualisere kjernene
RT-PCR
Total RNA ble isolert fra cellelinjer under anvendelse av TRIzol reagens (Invitrogen, Carlsbad,. CA, USA). RQ1 RNase-fri DNase (Promega, Madison, WI, USA) ble anvendt for å behandle RNA prøver for å utelukke forurensning av genomisk DNA. Fem mikrogram total RNA ekstrahert ble revers transkribert med oligo (dT)
18 primer (Fermentas, Burlington, Ontario, Canada) bruker Super III revers transkriptase (Invitrogen) i henhold til produsentens protokoll.
PCR var utføres med LA Taq polymerase (Takara, Dalian, Kina). Spesifikke primere for IGHG1, den tredje komplementaritetsbestemmende region (CDR3) av den tunge kjedegenet (som inkluderer VDJ-sekvensen), konstant (Igκ) og variable (Vκ) region av Igκ, konstant område Igλ (Igλ), Iγ-Cγ sterile bakterie linje transkripter (Iγ-Cγ), aktiverings-indusert cytidin deaminase (AID), rekombinasjon aktivere disse -1 og 2 (RAG1 og RAG2) var de samme som beskrevet tidligere [3], [4]. CD19 ble amplifisert for å utelukke forurensning av lymfocytter og β-actin ble amplifisert som intern referanse [3]. Detaljer om primere ble oppført i tabell S2. Identifisering av PCR-produktet ble bekreftet ved DNA-sekvensering og sandblåsing.
Laser fange mikrodisseksjon (LCM) assistert RT-PCR
LCM assistert RT-PCR ble utført på 20 tilfeller av ferskt frosset kirurgisk CRC prøvene som er beskrevet tidligere [4]. IGHG1, Igκ, CDR3 rekombinasjon segment, CD19 og β-aktin ble amplifisert med de samme primerne som for RT-PCR. Lymfocytter av lymfatiske knuter i tarmveggen ble anvendt som en positiv kontroll, og vann i stedet for cDNA-templat ble brukt som en negativ kontroll. Prøver med påviselig CD19 ble ekskludert fra etterfølgende eksperimenter.
Western blot og siRNA nedregule
cytosol proteiner av fire menneske CRC cellelinjer (40 mikrogram /kjørefelt) ble analysert med 10% SDS siders (Igγ henhold reduserende betingelser og Igκ under reduserende forhold). Standard humant serum IgG (0,02 ug /kjørefelt, Sigma) ble anvendt som positiv kontroll. Geit-anti-humant Igγ (1:2500; Sigma) eller muse anti-humant Igκ (1:2000, Abcom) ble anvendt som det primære antistoff
siRNA (5′-CCAAGGACACCCUCAUDAUTT-3 «, 5. «-AUCAUGAGGGUGUCCUUGGTT-3») ble utformet i henhold til den konstante regionen av kreft-avledet IgG og transfektert inn i Lovo celle med X-tremeGene siRNA Transfection Reagent (Roche, Mannheim, Tyskland) i henhold til produsentens protokoll. En tilfeldig sekvens ble anvendt som den negative kontroll. Effektiviteten av IgG ned regulerende ble bekreftet med Western blot.
Dyrestudier
Dyrkede Løvø celler (5 × 10
6) ble SC inokulert i fremre venstre armhulene av alvorlig kombinert immunsvikt (SCID) mus. Femti mikroliter blod ble erholdt fra øyet venen ved hjelp av kapillarrørene ved 0., 7., 14. og 21. dag etter inokulering. 1 pl serum ble analysert med 10% SDS-PAGE under ikke-reduserende betingelser med de samme antistoffer som beskrevet ovenfor. På dag 21, ble tumorene høstet og H . E farging, IHC og ISH ble utført på vevssnitt
celleproliferasjon og apoptose analyse
A MTS celleproliferasjonsanalyse (CellTiter 96 AQ One oppløsning Cell Proliferation Assay Kit, Promega) ble utført i en 96-brønners plate i henhold til produsentens instruksjoner. Mus anti-humant Igγ antistoff (10-1000 nM, Sigma) ble tilsatt til serumfritt kulturmedium og inkubert i 48 timer og OD490 ble analysert [18]. Mus anti-humant IgM-antistoff (μ kjede spesifikk, 10-1000 nM, Sigma) ble anvendt som negativ kontroll. Alle forsøkene ble utført in triplo. Nøytralisering av IgG-antistoff med kanin-anti-muse-IgG ble utført med økende konsentrasjoner (0-1000 Nm) av kanin-anti-mus IgG tilsatt til supernatanten umiddelbart etter tilsetning av 100 nM av mus anti-human Igγ.
for apoptotisk analysen ble CRC celler inkubert i 48 timer i serumfritt dyrkningsmedium med 100 nM IgG og analysert med Annexin V-PI kit (Peking University menneskelig sykdom Genomics Research Center, Beijing, Kina) som beskrevet tidligere [3]. IgM-antistoff (100 nM, Sigma) ble anvendt som en negativ kontroll. Løvø celler transfektert med siRNA ble også undersøkt for proliferative og apoptotiske eiendom som beskrevet ovenfor.
Soft agar assay på klone dannelsen
Soft agar-analysen ble utført som beskrevet tidligere [19]. Mus anti-human Igγ (100 nM, Sigma) ble anvendt og anti-humant IgM-antistoff (100 nM, Sigma) eller PBS i stedet for Igγ antistoff ble brukt som kontroller.
celle invasjon assay
Modifisert Cellemigrering migrering~~POS=HEADCOMP analysen ble utført med LoVo-celler og 100 nM mus anti-humant IgG-antistoff (Sigma) som beskrevet tidligere [20]. Membranen ble farget med H E. Fem tilfeldige felt per membran ble fotografert med en BX51 mikroskop (Olympus) ved × 400 forstørrelser. Den invaderte celler ble tellet og gjennomsnittlige tall ble beregnet for hver membran. Løvø celler transfektert med siRNA ble også undersøkt.
Statistisk analyse
Forskjell i IgG uttrykk mellom normal slimhinne prøver og primære svulster, forskjell i IgG uttrykk blant de ulike clinicopathological funksjoner, og sammenhengen mellom IgG uttrykk og ulike kreftrelaterte biologiske variabler ble testet ved hjelp av χ
2 test. Tosidige p-verdiene på mindre enn 5% ble betraktet som statistisk signifikant. De fleste beregninger ble utført med SPSS 12.0.
Resultater
Expression og distribusjon av IgG-proteinet og dets mRNA i human CRC vev
I alle tilfeller undersøkt, både Igγ og Igκ ble detektert hovedsakelig i cytoplasma av kreftceller og B-lymfocytter i stroma (figur 1A-E), og også i den mesenchymale bindevev (men ikke den glatte muskel) av kreftvev (figur 1A, E). Co-uttrykk for CEA med IgG og dens mRNA ble oppdaget på rad vevssnitt (Figur 1a). I de matchet normal slimhinne prøver, IgG var ikke påvises i kjertel epitel (figur 1B). Igγ ble svakt uttrykt i 83 (55,3%) og sterkt uttrykt i 67 (44,7%) av 150 adenokarsinomer. IgG reseptorene ble kun påvist i stromale betennelsesceller, men ikke i kreftcellene
A:. Samtidig uttrykk for CEA, IgG protein og IGHG1 mRNA i CRC celler. B-D: Ekspresjon av IgG (røde signaler) i normal tykktarm vev (B), godt differensiert (C) og dårlig differensiert (D) CRC. E: Uttrykk av IgG i celler i kreft reir (piler) infiltrere inn i dyp muskel lag av tarmveggen. Ekspresjonsnivået av IgG er høyere i infiltrerende kreftceller (E) enn i kreftcellene av «primær» tumor som er vist i D. F: CRC reirene (CRC) og lymfeknuter (LN) før og etter LCM. G: agarosegel-elektroforese av RT-PCR-amplifisering av microdissected CRC-celler og lymfeknuter. H: Co-lokalisering av IgG-protein uttrykt i cytoplasma (rødt signal) og Cyclin D1 (venstre panel), NF-kB (midtre panel) og PCNA med (høyre panel) nukleære lokaliserings (purpur-blå signaler). ML: Muskel lag. Barer = 50 mikrometer (A-E, G), 20 mikrometer (F).
For adenokarsinom, skilte uttrykk for IgG blant differensiering karakterer. Vanligvis er bare noen få isolerte kreftceller ( 25%) ble funnet positive i godt differensierte adenokarsinomer (figur 1C), mens flere enkeltkreftceller eller i klynger som var positive i moderat differensierte adenokarsinomer, og de fleste kreftceller (mer enn 50% ) var positive i dårlig differensierte adenokarsinomer (figur 1D). I kreft reir infiltrere inn i dypere muskellaget, det positive forholdet var høyere og fargeintensitet sterkere enn i de ikke-infiltrerende kreftceller som ligger i slimhinner (figur 1E og D).
IgG mRNA (IGHG1 ) ble observert i cytoplasma av kreftceller med in situ-hybridisering (figur 1A, høyre panel, figur S1 A). Spesifisiteten av probene og nivåene for ISH ble godt etablert med 2 par av prober (antisense og sense) for forskjellige regioner av IgG konstant område og en tilfeldig urelatert probe. Alle 2 antisense probene ga helt identitical i distribusjon og intensitet av positive signaler. I den positive kontrollen, det lymfatiske knuter av kolorektal vegg (fig S1 B), ble IGHG1 lokalisert i cytoplasma av B-lymfocytter. I de negative kontroller (tilfeldig probe anvendt på CRC vev og avføle prober anvendt for å mandel vev), ingen positive signal ble påvist (figur S1 C og D). Alle saker testet positivt for IgG farging var også positivt for IGHG1 mRNA in situ hybridisering. Tilstedeværelsen av IgG-mRNA ble også bekreftet med LCM assistert RT-PCR (figur 1F og G). IGHG1 og Igκ var både vellykket forsterket etter isolering av kreftceller fra frosset CRC prøver. Alle tjue prøver testet positivt. Dessuten, CDR3, inkludert V-D-J-sekvensen, ble også vellykket amplifisert fra disse prøvene. Ingen CD19 transkripsjoner var synlig, og dermed, med unntak av B-lymfocytter forurensning. CD19, IGHG1, Igκ, og CDR3 ble alt forsterket fra de positive kontrollprøver. Ingen bandet var detekterbare når den negative kontrollen ble brukt.
Korrelasjonen av IgG uttrykk med clinicopathological og biologiske funksjoner i CRC
Tabell 1 viser korrelasjonen av IgG uttrykk i primærkreftceller med ulike clinicopathological variabler. Det var en høyere hyppighet av sterk IgG uttrykk i dårlig differensiert adenokarsinom (67,3%) enn i bedre differensiert seg (vel og moderat differensiert, 33,7%, p = 0,035). IgG uttrykk viste ikke signifikant forskjell mellom de enkelte pTNM stadier (P = 0,091). Men når vi sammenlignet IgG uttrykk i stadium I-II svulst med at i stadium III-IV, sistnevnte hadde en høyere frekvens av sterk farging enn gjorde tidligere (59,7 vs 32,5%, p = 0,027). Når kreftformer med svak inflammatorisk infiltrasjon ble sammenlignet med de med sterk inflammatorisk infiltrat, var det en tendens for den første for å ha en høyere frekvens av sterk farging enn den sistnevnte forbindelse (49,5 vs. 33,3%, p = 0,041). På sikt av lymfeknute iscenesettelse, CRC av scenen N
1 og N
2 okkupert en betydelig høyere IgG-positive forhold (54,8, 63,9 vs 32,5%, p = 0,042). Det var ingen signifikant korrelasjon av IgG uttrykk med alder, kjønn, kreft sted eller vekstmønster (alle P 0,05)
Tabell 2 viser forholdet mellom IgG uttrykk og uttrykk for flere biologiske markører.. IgG uttrykk viste positiv korrelasjon med uttrykk for cyclin D1 (P = 0,046), NF-kB (P = 0,019), og PCNA (P = 0,037), og negativ korrelasjon med uttrykk av Bcl-2 (P = 0,041), og ingen signifikant korrelasjon med de uttrykk for MMP-2 og p53 (både P 0,05). Ko-lokalisering av Cyclin D1, NF-kB eller PCNA (nukleær farging) og IgG (cytoplasmatisk farge) ble klarlagt med dobbel-farging (figur 1 H).
Ekspresjon av IgG-proteinet og dets mRNA i CRC cellelinjer
identiteter ansatt CRC cellelinjer ble verifisert med STR test og profilene viste 100% bekreftelse med de som tilbys av ATCC (Figur S2 A og B). Konsentrasjon av IgG i ultralav-IgG FBS for cellekultur ble bekreftet å være 2,3 ± 0,9 ug /ml, tilstrekkelig lave til eksperimentet. IgG-protein-ekspresjon ble påvist i alle fire CRC-cellelinjer med IF. Co-uttrykk for Igγ og Igκ ble også bekreftet (Figur 2A). Igγ og Igκ var hovedsakelig lokalisert til cytoplasmaet, og delvis i kjernen av kreftceller. Ingen IgG signal ble påvist i Jurkatceller
A: Igγ og Igκ er påvist i alle de fire CRC-linjene ved å dobbeltfarging immunfluorescens. (Igγ, TRITC; Igκ, FITC, flette, gul.). Barer = 50 mikrometer. B: Prosentandel av IgG positive celler i Raji, HT29, SW480, og Løvø. C: agarosegel-elektroforese av RT-PCR-amplifiseringsprodukter. R, DNase-behandlede RNA som templat; C, cDNA som mal. D: IgG deteksjon ved Western blot i alle fire cellelinjer. E: IgG protein og mRNA blir oppdaget med IHC og ISH i tumorer høstes på 21 dager Løvø celler i SCID-mus. IgG påvises i sera på dag 7, 14 og 21.
Forurensning av B-lymfocytter ble utelukket ved hjelp av FITC-merket farging av CD19 (figur S2 C). Prosentandelen av IgG-positive celler ble bestemt ved FACS med Igγ antistoff. Prosentandelen av IgG-positive celler var 75,2%, 20,04%, 24,4%, 39,54% og 30,91% i Raji, HT29, SW480, henholdsvis LoVo og HCT116-cellelinjer (figur 2B). Gjennomsnittlig IgG-positiv celle prosentandel av moderat differensierte HT29 og SW480 cellelinjer (22,22%) var lavere enn for dårlig differensierte LoVo og HCT116-cellelinjer (35,23%, P = 0,043).
i RT-PCR , sensitivitet og spesifisitet ble godt etablert i flere eksperimenter. Først ble RNase-fri DNase benyttes for å eliminere den mulige effekten av genomisk DNA. CD19 ble forsterket for å utelukke mulig forurensning av B-lymfocytter. For det andre, ble flere regioner av IgG tunge og lette kjeder og viktige enzymer for IgG syntese undersøkt. For det tredje ble det gjennomført omfattende positive og negative kontroller som anvendes for det samme forsterkning. Videre, ble alle amplifiserte produkter sekvensert og den identitied av de amplifiserte produktene ble bekreftet. Ved hjelp RT-PCR, IGHG1, Igκ, Vκ, Igλ og Iγ-Cγ transkripsjoner ble oppdaget i alle de fire cellelinjer, med intensiteter av de positive båndene blir svakere enn for de Raji celler. Videre CDR3, inkludert V (D) J rekombinasjon sekvens og RAG1 og RAG2 ble også oppdaget, mens AID ble påvist kun i Løvø og HCT116 cellelinjer (figur 2C og Figur S1E).
førti (40) ug av totalt protein ble ekstrahert fra hver cellelinje. Det totale protein ble kjørt på en Western blot-gel og omsatt med antistoff til IgG. Et bånd på samme molekylvekten til, men med mindre intensitet enn den som oppnås med 0,02 ug av humant IgG bånd ble påvist (figur 2D). Jo bedre cellelinjer ble differensiert, ble det mindre IgG uttrykt. Under redusert tilstand, ble Igκ band oppdaget ved 25 KD i HT29, SW480, Løvø og HCT116 cellelinjer. I likhet med observasjoner av Huang et al [21], vi også oppdaget en ekstra band på 23 KD i HT29, SW480, og Løvø cellelinjer. Mengden av Igκ var mindre enn de av standard serum IgG.
Expression og utskillelse av IgG i tumorbærende SCID-mus
På dag 21 etter inokulering av dyrkede Løvø celler inn i SCID-mus, den svulster ble høstet. Svulsten besto av grupperte kreftceller med uklare cellerammer uten stroma. Alle kreftceller ble IgG-positiv, med granulært positive signaler i cytoplasma. Fordelingen av IGHG1 mRNA påvist med in situ-hybridisering var lik den til IgG-proteinet påvist ved IHC (figur 2E).
SDS-PAGE viste at etter hvert som kreft ble større, betydelig sterkere bånd av humant IgG ble detektert i sera av SCID-mus (figur 2E).
Blokkering av kreft-avledet IgG påvirker de biologiske atferd av CRC celler
Sammenlignet med de negative kontroller (museserum og anti-humant IgM) , anti-humant IgG viste signifikant øket hemming av proliferasjon av LoVo-celler, spesielt på 100 og 1000 nM konsentrasjoner (Figur 3A). For det følgende eksperiment, valgte vi 100 nM som den mest effektive konsentrasjon. Som kanin-anti-mus-IgG kan hindre binding av muse-anti-human IgG til humane IgG-molekyler som et resultat av steriske hindring [22], ble det anvendes for å motvirke effekten av anti-human IgG. Behandling med kanin anti-mus IgG effektivt avtok inhibering av kreftcellevekst ved mus-anti-humant IgG (figur 3B)
A:. MTS med en serie av konsentrasjoner av anti-humant IgG (10-1000 nM ) antistoff. B: Behandling med kanin anti-mus IgG øker apoptose priser i Lovo-celler. C: apoptotiske prosentandel av LoVo-celler er høyere etter inkubering med IgG-antistoff enn med IgM-antistoff eller museserum. D: Blokkering av kreft-avledet IgG resultater i morfologiske endringer. E: IgG antistoff reduserer ondartet anker uavhengig vekst av CRC celler. F: Blokade av kreft-avledet IgG undertrykker invasjonen potensialet i CRC celler. Barer = 50 mikrometer.
apoptose analyse (Figur 3C) viste at behandling med IgG antistoff resulterte i en høyere rate av apoptotiske Løvø celler (40.16%) sammenlignet med de som ble behandlet med IgM antistoff (13,7% , P = 0,0364) eller museserum (10,9%, P = 0,0417).
Morfologiske trekk Løvø celler ble også påvirket av behandling med IgG antistoff (Figur 3D). Når inkubert med anti-IgM antistoff (100 nM), Løvø cellene vokste løst samtidig utvikle flere celleprosesser. I motsetning til dette, inkubert med anti-IgG-antistoff (100 nM), LoVo-celler ble rund med mye mindre antall celleprosesser, og viste en begrenset klynge orientert vekst mønster.
soft agar-analyse viste at LoVo kreftceller co -cultured med anti-humant IgG-antistoff vokste saktere og genererte betydelig mindre kolonier, som ikke var gjennomsiktig og hadde uklare cellegrensene, enn de av de samme kreft LoVo-celler behandlet med anti-humant IgM-antistoff (figur 3E). Behandling med PBS i stedet for IgG-antistoffer ga lignende resultater som ble behandlet med anti-humant IgM-antistoff. Det gjennomsnittlige antallet kolonidannelse i Lovo-celler behandlet med anti-humant IgG (23,7 ± 5,2 /35 mm planet) var betydelig mindre enn den for LoVo-celler behandlet med IgM-antistoff (46,1 ± 3,2 /35 mm planet, P = 0,0374).
celle invasjon analysen viste at det gjennomsnittlige antall invaderte celler som var lavere i Lovo-celler inkubert med anti-humant IgG-antistoff (32,3 ± 3,9) enn det i de inkubert med IgM-antistoff (116,5 ± 5,2, P = 0,0293) (figur 3F).
Effekt av IgG forstyrrelser på biologiske atferd av CRC celler
for å undersøke mulige roller IgG i biologiske atferd videre, nedregulering av IgG uttrykk med siRNA forstyrrelsen var utført. Som vist i fig S3 A, ble mer enn 50% IgG proteinsyntese effektivt reduseres med siRNA. I MTS, IgG nedregulering undertrykkes proliferasjon av LoVo-celler (figur S3 B). Annexin V-PI immunfluorescens dobbel farging viste at tidlig (Annexin V +) og sen (PI +) apoptotiske celler ble økt med IgG knockdown av siRNA i forhold til si-kontroll (figur S3 C). I mellomtiden, IgG knockdown også redusert Transwell celler (Figur S3 D).
Diskusjoner
Økt serumnivåer av IgG og IgA er ofte oppdages hos pasienter med epitelial kreft [23], [24] inkludert de med CRC [25], [26]. I tillegg er IgG og IgA blitt funnet å bli uttrykt på cellelinjer og vev i forskjellige epiteliale krefttyper, inkludert CRC [3], [4], [6], [27], [28]. Selv om fenomenet med Ig-ekspresjon i kreftformer har blitt etablert, er funksjonen av kreft-avledede Ig er fortsatt uklar. I tillegg er lite kjent om sammenhengene mellom kreft-avledet IgG og clinicopathological funksjoner og biologiske atferd av karsinomer. Chen et al. nylig har rapportert at uttrykket av IgG i bløtvev sacomas var assosiert med svulst klasse og uttrykk for PCNA, Ki-67 og cyclin D1 [29]. I den foreliggende undersøkelse, vi bekreftet tilstedeværelsen av IgG-ekspresjon i kolorektale celler ved både protein og mRNA-nivåer. Mangelen på immunoglobulin-reseptor ekspresjon og påvisning av IgG-mRNA i CRC-celler utelukkes muligheten for at sirkulerende IgG ble tatt opp av disse kreftceller. Vi viste en positiv sammenheng mellom IgG uttrykk, tumor differensiering klasse, pTNM scenen og spredning til lymfeknuter. Uttrykk av IgG var sterkere i CRC vev med dårlig differensiering eller med pTNM stadium III-IV, enn hos dem med bedre differensiering eller pTNM I-II. IgG uttrykk kan være negativt assosiert med inflammatorisk infiltrasjon, som kreft med lettere inflammatorisk infiltrasjon viste sterkere IgG uttrykk. Våre funn i kolorektal cancer vev er i overensstemmelse med våre observasjoner i kolorektal cellelinjer, som viser en lavere mengde av IgG i kreftceller ved moderat differensiering (HT29 og SW480) sammenlignet med de til dårlig differensiering (LoVo og HCT116). Samlet utgjør disse funnene tyder på at kreft-avledet IgG kan være involvert i prosessen med de-differensiering, infiltrasjon og metastasering av CRC, og at det kan spille en selvbeskyttende rolle under utviklingen av kreft. Faktisk er det under visse betingelser immunoglobuliner er blitt funnet å fremme veksten av kreft [30], [31], og dette fenomenet har i hovedsak blitt tilskrevet den skjerming av mål-epitoper på overflaten av kreftceller med «anti-tumor» antistoff [32 ], [33]. En studie av pasienter med kreft i eggstokkene foreslått at slike blokkerende antistoffer kan bli abnormt glykosylert IgG-molekyler, som er i stand til å fremskaffe immunresponser [24]. Foruten immunoglobulin tunge kjeder, T-celle-reseptorer (så som TCR-en og TCR-b), immunoglobulin-lignende celleadhesjonsmolekyler (slik som CD47, CD54, CD58) ble også funnet å bli uttrykt i cancerceller [34]. TCR og IgG-antistoffer har ført til komplementavhengig cytotoksisitet og apoptose av kreftcellelinjer. Så disse «immunglobulin superproteiner» ble antatt å være selvbeskyttende og involvert i spredning av kreftceller [34]. En alternativ, indirekte rolle for IgG i stimulering av tumorvekst kan omfatte transformerende vekstfaktor beta (TGF-β) som bæres av immunoglobuliner, og har vist seg å forhindre cytolytiske T-celle-responser [35].
