Abstract
Tumor genomisk ustabilitet og selektiv behandlingstrykk føre til klonal sykdom evolusjon; molekylær stratifisering for molekylært målrettet Drug Administration krever gjentatt tilgang til svulst DNA. Vi antok at sirkulerende plasma DNA (cpDNA) i pasienter med fremskreden kreft i stor grad er avledet fra tumor, har prognostisk verktøy, og kan utnyttes for multipleks sekvensering tumor mutasjon når gjenta biopsi er ikke gjennomførbart. Vi utnyttet Sequenom MassArray System og OncoCarta panel for somatisk mutasjon profilering. Matchet prøver, kjøpt fra samme pasient, men ved ulike tidspunkt ble vurdert; disse består formalinfiksert parafin-embedded (FFPE) arkiv svulstvev (primær og /eller metastatisk) og cpDNA. Mulighets, følsomhet og spesifisitet av høy gjennomstrømming, ble multiplex mutasjonsdeteksjon tilnærming testet utnytte prøver ervervet fra 105 pasienter med solide tumorer som er nevnt for deltakelse i fase I-studier av molekylært målrettede medikamenter. Median cpDNA konsentrasjonen var 17 ng /ml (variasjon: 0,5-1600); Dette var tre ganger høyere enn hos friske frivillige. Videre høyere cpDNA konsentrasjoner forbundet med dårligere total overlevelse; det var en total overlevelse (OS) hasardratio på 2,4 (95% KI 1,4, 4,2) for hver 10-dobling i cpDNA konsentrasjon og i multivariate analyser, cpDNA konsentrasjon, albumin og ytelse status forble uavhengige prediktorer for OS. Disse data tyder på at plasma-DNA i disse kreftpasienter er hovedsakelig avledet fra tumor. Vi har også observert høye oppklarings samstemmighet for kritisk «hot-spot» mutasjoner (
KRAS
,
BRAF
,
PIK3CA
) i matchet cpDNA og arkivering svulst vev, og viktige forskjeller mellom arkiv svulst og cpDNA. Dette multipleks sekvensering analysen kan anvendes for å påvise somatiske mutasjoner fra plasma hos pasienter med fremskreden kreft, når sikker gjenta tumorbiopsi er ikke gjennomførbart og genomisk analyse av arkiv tumor anses utilstrekkelig. Totalt sett sirkulerende nukleinsyre biomarkør studier har klinisk viktig multi-purpose verktøy i avanserte kreftpasienter og videre studier for å forfølge sin innlemmelse i standard vare er garantert
Citation. Perkins G, Yap TA, Pope L, Cassidy AM, Dukes JP, Riisnæs R, et al. (2012) Multi-Purpose Utility av sirkulerende plasma DNA-testing hos pasienter med avansert kreft. PLoS ONE 7 (11): e47020. doi: 10,1371 /journal.pone.0047020
Redaktør: Jose Luis Perez-Gracia, universitetsklinikken i Navarra, Spania
mottatt: May 15, 2012; Godkjent: 07.09.2012; Publisert: 07.11.2012
Copyright: © 2012 Perkins et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. The Drug utvikling Enhet for Royal Marsden NHS Foundation Trust og The Institute of Cancer Research støttes delvis av et program stipend fra Cancer Research UK. Støtte ble også gitt av Experimental Cancer Medicine Centre (The Institute of Cancer Research) og Nasjonalt institutt for Health Research Biomedical Research Centre (sammen til Royal Marsden NHS Foundation Trust og The Institute of Cancer Research). GP ble støttet av en bevilgning fra den franske National Institute of Cancer (Institut National du Cancer, Inca, Frankrike). TY er mottaker av 2011 Scott Minerd Prostate Cancer Foundation Young Investigator Award. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
utviklingen av kreft er først og fremst på grunn av genetiske avvik som driver onkogenese og bestemmer kliniske manifestasjoner av svulster; disse kan også påvirke behandlingsrespons [1]. Vår forbedret kunnskap om den underliggende biologi av kreft og tilgjengeligheten av moderne bioteknologisk verktøy er i ferd med å føre til vellykket utvikling av nye antitumor-molekylære terapeutiske midler, så vel som en bedre anerkjennelse av resistensmekanismer [2], [3]. Kjente eksempler er
KRAS
mutasjoner i kolorektal tumorer forutsi resistens mot anti-epidermal vekstfaktor reseptor (EGFR) rettet mot monoklonale antistoffer (cetuximab [Imclone og Bristol-Myers Squibb] og panitumumab [Amgen]) [4], [5], og
KIT
mutasjoner forutsi antitumor respons på imatinib (Novartis) i gastrointestinal stromal tumor [6]. Molekylær analyse av disse genomiske avvik blir vanligvis utført på arkiv svulstvev på grunn av etiske og sikkerhetsmessige utfordringer knyttet til gjentatte biopsier. Men i betraktning av potensialet for genomiske ustabilitet, gjelder fortsatt, om gyldigheten av denne metode for å analysere arkiv tumorvev, i stedet for å rebiopsying tumor for molekylære analyser på hver terapeutisk beslutningspunkt. For eksempel, er det uklart om analyse av arkiv tumor-biopsier tatt mange år og ofte multippelterapier tidligere, reflekterer tilstrekkelig sykdom biologi på tidspunktet for behandlingen. Rebiopsy av en valgt tumorlesjon kan imidlertid ikke gi tilstrekkelig informasjon om intra-pasient sykdom molekylær heterogenitet og rebiopsying flere lesjoner fortsatt klinisk upraktisk. Forbedret strategier for å forfølge pasienten molekylær stratifisering er sterkt behov.
Vi dro ut for å optimalisere nytte for pasienter med langtkomne solide tumorer er nevnt for fase I kliniske forsøk med å tildele spesifikke målrettet terapi til pasienter som havnen kreft molekylær avvik målrettet av middel i spørsmålet [2], [3], [7]. Vi evaluerte svulster hentet fra disse pasientene med høy gjennomstrømning Sequenom MassArray plattform utnytte OncoCarta mutasjon panel (versjon 1.0, Sequenom, San Diego, California). Dette panelet benytter forhåndsutformede og pre-validert massespektrometrisk SNP genotyping teknologi for parallell multipleks analyser av 238 enkle og komplekse mutasjoner på tvers av 19 vanlige onkogener, minimere mengden av prøven som kreves og maksimere følsomheten [8]. Det har tidligere vært brukt med hell for screening av mutasjoner i formalinfiksert parafin-innleiret (FFPE) tumorvev [9] [10].
En alternativ kilde til tumor-DNA sirkulerende plasma DNA (cpDNA) [ ,,,0],11], som kan være lett og gjentatte ganger ekstrahert fra plasma og kan være tumor-avledede [11], [12], med cpDNA konsentrasjoner assosiere med sykdomsprogresjon byrde og [13]. Studier har også demonstrert muligheten for mutasjonen deteksjon fra cpDNA hos pasienter med fremskreden kreft [14], [15], [16], [17], [18]. Vi dro ut for å utforske den potensielle nytten av multiplex mutasjonsdeteksjon fra cpDNA med høy gjennomstrømning Sequenom MassArray plattform utnytte OncoCarta mutasjon panel (v1.0) for å finne ut om dette kan brukes som et supplement til vev biopsi for å berike og støtte svulst data for pasientens valg. Delmål var å undersøke om måling av cpDNA konsentrasjoner har prognostisk verdi.
Materialer og metoder
kliniske prøver
Pasienter med sent stadium avanserte solide svulster som ble henvist til Drug Development Unit i Royal Marsden NHS Foundation Trust mellom september 2009 og august 2010, og som var kvalifisert for en fase i studie ble inkludert i denne studien. Alle pasienter gitt skriftlig informert samtykke for genetisk analyse av deres svulster og plasmaprøver før deltakelse i denne studien. Åtte ml perifert blod ble samplet i en BD Vacutainer Cell Forberedelse Tube (CPT) som inneholder natrium heparin, som tillater plasma og mononukleære celle separasjon løpet av en enkelt sentrifugeringstrinn. Røret ble invertert minst 8 ganger for å sikre grundig blanding av prøven, og deretter sentrifugert ved 1800 g i 15 min. Det resulterende plasma Supernatanten ble overført til et rent rør og lagret ved -80 ° C inntil analyse. I tillegg 20 friske frivillige gitt 8 ml blod for analyse ved hjelp av denne metoden. Tilsvarende FFPE- prøver (primær og /eller metastaser) for hver pasient ble også bedt om. Den relevante regulatoriske og uavhengig etisk komité (nasjonale forskningsetiske Tilbud (NRES) Committee London-Chelsea, Storbritannia) godkjent denne studien før rettssaken begynner.
DNA isolering og kvantifisering
For analysene av tumorprøver, hemotoxylin- og eosin-farget lysbilder ble anmeldt av en bord-sertifisert patologen (KT) for å sikre tilstrekkelig levedyktig svulsten og å bestemme tumor sone til kjernen. DNA fra FFPE prøver ble ekstrahert fra 1 mm kjerner når det er mulig, eller fra 10 mikrometer ufargede seksjoner med mindre biopsier bruker QIAamp DNA FFPE Tissue Kit (Qiagen, Valencia, CA, USA), i henhold til produsentens anbefalinger. Det ekstraherte DNA ble deretter eluert i 30 ul av ATE-buffer og lagret ved -20 ° C inntil videre analyse. DNA ble kvantifisert ved hjelp av Nanodrop 1000 spektrofotometer (Thermo Scientific).
For cpDNA utvinning, plasma ble tint ved romtemperatur og cpDNA hentet fra 2 ml plasma ved hjelp av en QIAamp DNA Blood Midi Kit (Qiagen, Valencia, CA , USA), ifølge produsentens instruksjoner, med følgende modifikasjoner: for hver 2 ml prøve av plasma, ble et ytterligere sentrifugeringstrinn (16 000 g, 5 min, RT) tilsatt før ekstraksjonsprosedyren for å fjerne cellulært avfall fra plasma. På slutten av prosedyren, ble DNAet eluert i 100 ul AE elueringsbuffer. DNA-konsentrasjon ble målt med selvlysende flekker, ved å bruke Quant-iT ™ Pico-Green® dobbelttrådet DNA (dsDNA) Assay Kit (Invitrogen, Carlsbad, California) og SynergyHT mikroplateleser (Biotek). DNA fra kreftcellelinjer analysert ble hentet fra pellets bruker QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA, USA), i henhold til produsentens anbefalinger. Til sammenligning er alle cpDNA konsentrasjoner som presenteres i dette manuskriptet uttrykt som ng /ml plasma.
massespektrometri TypePLEX teknologi og OncoCarta panel (v1.0)
OncoCarta panel (v1 0,0) består av 24 bassenger av primerpar og skjøte primere, og har kapasitet til å oppdage 238 mutasjoner i 19 gener. Protokollen levert av Sequenom (San Diego, CA), ble fulgt med mindre modifikasjoner. Mengden av DNA tilsatt til polymerase-kjedereaksjon (PCR) var 20 ng per reaksjon for FFPE DNA-prøver. For plasma DNA-prøver ble 30 ul DNA tilsatt til 30 pl av rent vann, og brukes til OncoCarta panel (v1.0) -behandling. DNA ble amplifisert ved hjelp av PCR-primeren OncoCarta ansamlinger ble uinkorporerte nukleotider inaktivert ved reke alkalisk fosfatase (SAP), og en enkelt base rekstensjonsreaksjon ble utført ved anvendelse av skjøte primere som hybridiserer umiddelbart tilstøtende til mutasjoner og en tilpasset blanding av nukleotider. Saltene ble fjernet ved tilsetning av et kation-bytterharpiks. Multipleksede reaksjoner ble prikket inn SpectroCHIP II arrays, og DNA-fragmenter ble løst ved MALDI-TOF på Compact Mass Spectrometer (Sequenom, San Diego, California).
Dataanalyse
Dataanalyse ble utført bruker MassArray Typer Analyzer programvare 4.0.4.20 (Sequenom), som muliggjør visualisering av data mønstre og rå spektra. Typer automatiserer identifisering av mutanter ved å sammenligne prosenter av villtype topp til at av alle mistenkte mutanter og genererer en OncoMutation rapport med detaljer spesifikke mutasjoner og prosenter av hvete og mutasjons topper. Alle mutasjoner fra Oncomutation rapporten ble gjennomgått manuelt av 2 blindet operatører, med utvalgte anmeldt mutasjoner fra OncoMutation rapporten sammenlignes og bekreftet å være konkordant. Manuell gjennomgang av mutasjoner på alle OncoCarta spektra ble utført for å identifisere «ekte» mutant topper fra salt topper eller andre bakgrunns topper. Statistiske analyser er beskrevet i supplerende metoder S1.
FFPE mutasjon bekreftelse
KRAS
mutasjoner ble også påvist ved hjelp av TheraScreen KRAS mutasjon kit (Qiagen, Tyskland) basert på Amplification ildfast Mutation System (ARMS) -Scorpion PCR [19].
BRAF
V600E mutasjoner ble også påvist ved hjelp av kapillær elektroforese-enkelt strand konformasjon analyse (CE-SSCA). Ytterligere detaljer er gitt i supplerende metoder S1.
Resultater
Pasient egenskaper
Totalt 105 pasienter henvist for fase I studie deltakelse ble registrert mellom september 2009 og august 2010 (Tabell 1; Tabell S1). En pasient ble senere funnet å være kvalifisert for fase I-studier og derfor denne studien som han ikke hadde brukt opp alle linjer av tilgjengelige antitumor behandlinger. De forskjellige tumortyper som er representert i de gjenværende 104 pasienter ble kolorektal kreft (CRC) (n = 25), brystcancer (n = 19), melanom (n = 15), eggstokk-kreft (n = 15), kastrering motstandsdyktig prostatakreft ( CRPC) (n = 11) og andre krefttyper (n = 19), inkludert ikke-småcellet lungekreft (NSCLC), mesothelioma, sarkom, glioblastom, adenokarsinom med ukjent primær (ACUP), kolangiokarsinom, og cervical, endometrial, duodenal , esophageal, bukspyttkjertelen og nyrekreft (tabell 1).
av de 104 pasientene som ble analysert i studien, ble FFPE- primær tumorprøver innhentet for 69 (66%) pasienter med FFPE nodal og /eller metastatiske tumorprøver som er tilgjengelig i ytterligere 31 (30%) pasienter. cpDNA ble oppsamlet fra 101 (97%) pasienter; det var ikke mulig å trekke blod fra en pasient av tekniske grunner og blod ble ikke oppsamlet fra 2 pasienter på grunn av logistiske feil. Totalt 60 pasienter døde under oppfølging, mens data for 44 pasienter ble sensurert for anvendelsen av denne publikasjonen. Median oppfølgingstid var 5,8 måneder (variasjon 0,3 til 17,5) (tab 1).
DNA serieutvannings eksperimenter for analysen utvikling
Fortynninger av DNA hentet fra
KRAS
mutant HCT116 humane tykktarmskreft cellelinje viste at
KRAS
G13D-mutasjon var reproduserbart registreres av OncoCarta v1.0 panel på DNA konsentrasjoner så lave som 40 ng /ml (Figur S1). cpDNA ble også oppsamlet fra friske frivillige (Tabell 2); i disse prøvene, ble det cpDNA konsentrasjonen funnet å være lav: Det ble ikke detektert median 6,5 ng /ml plasma (variasjon 4,5 til 13,3 ng /ml plasma), og ingen mutasjoner i enhver prøve. En pasient med avansert brystkreft, som hadde svært høye cpDNA nivåer (1600 ng /ml plasma) ble funnet å ha en
PIK3CA
mutasjon i både FFPE og cpDNA prøver; serielle fortynninger av denne cpDNA viste at
PIK3CA
mutasjon påvises opp til en konsentrasjon på 2,5 ng /ml plasma utnytte denne analysen.
Plasma cpDNA konsentrasjonsnivåer og mutasjon deteksjon
Den samlede median cpDNA konsentrasjonen var 17 ng /ml hos disse pasientene med avanserte svulster (variasjon: 0,5-1600) (Figur 1, Tabell S1). Median cpDNA konsentrasjonen var 18 ng /ml (variasjon: 5-230) for pasienter med CRC; 7 ng /ml (variasjon: 2-50) for pasienter med føflekkreft, 17 ng /ml (variasjon: 0,5-1600) for pasienter med brystkreft, 15 ng /ml (variasjon: 4-49) for pasienter med eggstokkreft og 53 ng /ml plasma (Område: 7-1177). for pasienter med CRPC som hadde de høyeste plasma DNA-konsentrasjoner
Skap og whisker plott som viser
th 25, 50
th og 75
th persentiler, øvre og nedre grenser verdier (værhår) og Tukey utliggere (•). P-verdi er for en to-sidig uparet t-test på log10 DNA-konsentrasjoner ved hjelp av Welch korreksjon for ulike variasjoner.
Matchet plasma og FFPE var tilgjengelige for analyse fra 84 pasienter. Totalt 42 mutasjoner ble oppdaget i en eller begge FFPE svulst og cpDNA prøver hentet fra disse pasientene (Tabell 3, Tabell S1, Tall S2A-S2D). Den samlede samsvars i detekterte mutasjoner mellom FFPE og cpDNA prøvene var 60% (25 av 42 detekterte mutasjoner) (tabell 3). Nonparametric ROC-analyser ble brukt for å vurdere grensen for Sequenom plattform for å oppdage OncoCarta panel mutasjoner i cpDNA (figur 2A). Konsentrasjonen av cpDNA med den optimale evne til å påvise en mutasjon var 29,95 ng /ml (likelihood ratio = 7,3043). AUC beregnet var 0,8075 (95% KI 0,6552 til 0,9598). Figur 2B viser de forskjellige typer mutasjoner i en rekke tumortyper ved de respektive cpDNA konsentrasjonene de ble detektert ved
2A:.-Parametrisk ROC-analyser ble brukt for å vurdere grensen for Sequenom plattform for å detektere OncoCarta panel mutasjoner i cpDNA. Hvert punkt på grafen svarer til sensitivitet og spesifisitet ved en av de observerte konsentrasjoner. Mutasjoner ble betraktet som «tilgjengelig for påvisning «hvis de ble detektert i pasientens FFPE vev. Mutasjoner ble påvist i FFPE-prøver fra 37 pasienter. Konsentrasjonen av cpDNA med den optimale evne til å påvise en mutasjon er 29,95 ng /ml (sannsynlighetsforhold = 7,3043). AUC beregnet er 0,8075 (95% KI 0,6552 til 0,9598). Pasienter som FFPE var utilgjengelig eller testet negativt for mutasjoner ble ekskludert fra analysen. De spesifisitet referanselinjer for kvartiler av DNA-konsentrasjoner er angitt i røde stiplede linjer. 2B: graf som viser de typer mutasjoner og cpDNA konsentrasjoner ved hvilke de ble påvist i forskjellige tumorer. Mutasjoner ble påvist i seks onkogener. Symboler representerer ulike krefttyper.
Sammenheng med pasientens utfall.
Median total overlevelse (OS) for alle pasienter var 7,9 måneder (95% KI 5,8, 9,2) . Pasientene ble kategorisert i lave og høye cpDNA konsentrasjons grupper basert på den maksimale friske frivillige kohort DNA konsentrasjon på 13,3 ng /ml; 61 pasienter ble klassifisert som har høye konsentrasjoner cpDNA med 40 som har lave nivåer. Median OS for pasienter kategorisert som har lave cpDNA konsentrasjoner var 10,5 måneder (95% KI 6,0, NC), mens de i høy cpDNA konsentrasjon gruppen hadde en median OS på 6,5 måneder (95% KI 4,5, 8,4) (logrank p = 0,0383) (figur 3A). Som en kontinuerlig variabel, det var et OS hasardratio på 2,4 (95% KI 1,4, 4,2) for hver 10-dobling i cpDNA konsentrasjon (Figur 3B).
(3A) Kaplan-Meier kurve som viser overlevelse kurver av cpDNA konsentrasjon i 101 pasienter med langtkomne solide tumorer. Pasienter i ugunstig kategori hadde konsentrasjoner som er større enn en frisk frivillig kohort maksimum på 13,3 ng /ml (logrank p = 0,0383). (3B) Overlevende funksjon beregnes ut fra univariate Cox regresjon viser de forutsagte overlevelseskurver for en rekke cpDNA konsentrasjoner. En hasardratio på 2,4 (p = 0,002) er avbildet mellom tilstøtende kurver.
Sammenheng med RMH prognostisk poengsum.
Vi har nylig prospektivt validert en prognostisk score (RMH score) for pasienter som deltar i fase i kliniske studier basert på kombinasjonen av tre prognostiske faktorer: serumalbumin mindre enn 35 g /l; laktat dehydrogenase (LDH) større enn den øvre normalgrense (ULN); og to eller flere områder av metastaser. Tilstedeværelsen av hver av disse variabler knyttet til forverring utfall [20]. Gjennomsnittlig cpDNA konsentrasjonen var høyere hos pasienter med en verre RMH prognostisk score (F [3,98] = 9,97, p 0,0001); Post-tester viste en signifikant positiv lineær trend mellom log10 (cpDNA) og RMH score (beta = 0,247, p 0,0001) (figur 4)
scatterplot viser forholdet mellom cpDNA konsentrasjon og RMH prognostisk poengsum.. Det var en signifikant positiv lineær trend mellom log
10 (cpDNA) og RMH score (beta = 0,252, p 0,0001)..
Sammenheng med univariat og multivariat analyse
Univariat testing ble brukt til å bestemme en signifikant prediktor for total overlevelse, som inkluderte cpDNA konsentrasjon som en kontinuerlig variabel (HR 2,4 per 10-dobling, 95% CI 1.4 til 4.2), albumin 35 g /L (logrank p = 0,0003 ), og ECOG funksjonsstatus lik 2 (logrank p = 0,0007). Når cpDNA, albumin og funksjonstilstand ble innlemmet i en multivariat modell, ble alle tre parametre funnet å være uavhengige prediktorer for overlevelse (tabell 4). Antallet metastaser ble ikke funnet å være en signifikant prediktor for overlevelse i univariat analyse og ble derfor ekskludert fra den multivariate modellen.
mutasjonsdeteksjon og samsvar mellom FFPE og cpDNA
tykktarmskreft.
av 25 pasienter med CRC, ble cpDNA prøver innhentet fra alle pasienter, mens FFPE- tumorprøver var tilgjengelig for analyse for 22 pasienter. Total, mutasjoner ble påvist i 15 av 22 (68,2%) som er tilgjengelige FFPE-tumorer og 14 av 25 (56%) cpDNA prøver (Tabell S1). Spesielt
KRAS
,
BRAF Hotell og
PIK3CA
mutasjoner ble påvist i 10 (45%), 3 (14%) og 2 (9%) vevsprøver, henholdsvis . Relativt, 9 (36%)
KRAS
, 3 (12%)
BRAF Hotell og 3 (12%)
PIK3CA
mutasjoner ble oppdaget i cpDNA prøver.
Concordance i deteksjon av mutasjoner mellom matchet FFPE- arkiv svulster og cpDNA eksemplarer av Sequenom OncoCarta analyser var 70% (7 av 10 pasienter) for
KRAS Hotell og 100% (3 av 3 pasienter) for
BRAF
mutasjonsstatus (tabell 3). Ingen pasienter med villtype
KRAS
eller
BRAF
tumorvev genotyper hadde mutasjoner i sine respektive cpDNA. Fem pasienter hadde påvisbare
PIK3CA
mutasjoner i ett eller begge FFPE svulst og /eller cpDNA: en pasient hadde en Q546K mutasjon påvist i både FFPE vev og cpDNA; En pasient hadde en E545K mutasjon påvises bare i FFPE, men ikke cpDNA; 1 pasient hadde en E542K mutasjon detektert i en levermetastase (FFPE), men ikke i den primære tumor (FFPE) eller cpDNA; En pasient hadde E545K oppdaget bare i plasma, men ikke FFPE; og en pasient hadde en Q546K mutasjon som finnes i cpDNA men ingen FFPE prøven var tilgjengelig. Den nylig rapportert onkogene
akt1
E17K mutasjon [21] ble oppdaget i en pasient i både vev og plasma. Ingen mutasjoner i andre testede onkogener ble oppdaget.
Det var 90% (9 av 10
KRAS
muterte prøver) samstemmighet for FFPE tumor
KRAS
mutasjonsstatus mellom OncoCarta panel og armene-Scorpion PCR-plattformer. BRAF samsvar mellom OncoCarta panel og CE-SSCA metoden var 100% (3 av 3
BRAF
muterte prøver).
melanom.
Av de 15 pasienter med føflekkreft , FFPE-tumorprøver var tilgjengelig for analyse for 10 pasienter, mens cpDNA prøver ble oppnådd fra alle 15 pasienter. Totalt sett mutasjoner ble oppdaget i 8 av 10 (80,0%) tilgjengelig FFPE- svulster og 6 av 15 (40%) cpDNA prøver (Tabell S1).
BRAF
,
NRAS
og
MET
mutasjoner ble detektert i 5 (50%), 3 (30%) og en (10%) av 10 FFPE-tumorprøver, henholdsvis, og 3 (20%), 2 (13,3% ) og 2 (13,3%) av 15 cpDNA prøver, henholdsvis. Konkordans i påvisning av mutasjoner mellom matchet FFPE og cpDNA var 60% (3 av 5 pasienter) for
BRAF
, 66,7% for
NRAS product: (2 av 3 pasienter) og 100% for
MET
mutasjonsstatus (1 av 1 pasient) (tabell 3). En annen
MET
mutasjon, T992I, ble funnet i en cpDNA prøve, men ingen FFPE- kreft prøven var tilgjengelig. Ingen pasienter med villtype svulstvev genotyper hadde mutasjoner i sine respektive cpDNA.
Det var 100% samstemmighet (5 av 5 prøver) for
BRAF
mutasjonsstatus mellom OncoCarta panel og CE-SSCA metode.
brystkreft.
FFPE- tumorprøver og cpDNA prøvene var tilgjengelig for analyse for alle 19 pasienter med brystkreft. Totalt sett mutasjoner ble oppdaget i 5 av 19 (26,3%) FFPE- svulster og 4 av 19 (21,1%) cpDNA prøver (Tabell S1).
PIK3CA
H1047R mutasjonen ble påvist i fire av 19 (21,5%) vevsprøver og 3 av 19 (15,8%) cpDNA prøvene, med overensstemmelse mellom tre av fire (75%) avstemt FFPE og cpDNA prøver (tabell 3).
akt1
E17K mutasjonen ble oppdaget i en pasient i både FFPE vev og cpDNA. Det er ingen mutasjoner i hvilket som helst av de andre onkogener studert ble påvist med den OncoCarta panel. Ingen pasienter med villtype svulstvev genotyper hadde mutasjoner i sine respektive cpDNA.
Kastrering resistent prostatakreft.
Av de 11 pasientene med CRPC, cpDNA prøver ble innhentet fra alle pasienter, mens FFPE- svulster var tilgjengelig for 8 pasienter. Totalt sett mutasjoner ble oppdaget i tre av åtte (37,5%) FFPE- svulster, og tre av 11 (27,3%) cpDNA prøver (Tabell S1).
PIK3CA
,
HRAS
og
akt1 plakater (alle n = 1) mutasjoner ble oppdaget i FFPE- vevsprøver, mens
NRAS
,
PIK3CA Hotell og
akt1 plakater (alle n = 1) mutasjoner ble funnet i cpDNA prøver. Den tilsvarende FFPE svulst
PIK3CA Hotell og
akt1
mutasjoner ble funnet i cpDNA prøvene, men FFPE svulst
HRAS
mutasjonen ble ikke funnet i matchet cpDNA prøven (tabell 3 ). Den Q61K
NRAS
mutasjonen ble funnet i 1 cpDNA prøven, men ikke i den tilsvarende FFPE tumorprøve.
Eggstokkreft.
Av de 15 pasienter med fremskreden kreft i eggstokkene, cpDNA prøver~~POS=HEADCOMP ble oppnådd fra alle pasienter, mens FFPE-tumorprøver var tilgjengelig for 14 pasienter. Totalt sett mutasjoner ble oppdaget i 5 av 14 (35,7%) FFPE- svulster, og 0 av 14 (0%) cpDNA prøver (Tabell S1).
KRAS
mutasjoner (G12V og G13D) (n = 3) og
PIK3CA
H1047R mutasjon (n = 1) ble påvist i FFPE- tumorprøver, men ingen mutasjoner ble funnet i noen cpDNA prøver (Tabell 3). En pasient med eggstokkreft carcinosarcoma hadde en
KIT
P585P mutasjon påvises i FFPE, men ikke i cpDNA.
Andre krefttyper.
Av de resterende 19 pasienter med en rekke tumortyper, cpDNA prøver ble innhentet fra 17 pasienter, mens FFPE- svulster var tilgjengelig for 12 pasienter.
NRAS
G12D mutasjonen ble funnet i både FFPE svulsten og plasma fra en pasient med ACUP ( tabell 3).
NRAS
G13R mutasjon ble påvist i plasma, men ikke i FFPE svulst fra en pasient med kolangiokarsinom.
KRAS
G12D mutasjonen ble funnet i FFPE svulst, men ikke i plasma fra en pasient med duodenal kreft. Ingen mutasjoner ble påvist i de andre pasientene, inkludert ingen epidermal vekstfaktor reseptor (
EGFR
) mutasjoner i de 5 pasienter med NSCLC.
Concordance i mutasjonsdeteksjon mellom FPFE og cpDNA for primærtumor eller metastatisk prøver
Når du vurderer alle pasienter med matchede prøvene, inkludert de med ingen mutasjoner oppdaget (n = 83), konkordansen påvise mutasjoner mellom FFPE og cpDNA var høyere i metastaser (83,3% av 18 prøver) sammenlignet med primærtumor (78,5% av 65 prøver). Ved å betrakte bare pasienter med mutasjoner som detekteres i det minste i blod og /eller primær tumor (n = 40), konkordanssiden ved påvisning av mutasjoner mellom FFPE og cpDNA ble igjen høyere i metastaser (70,0% av 10 prøver) i forhold til primærtumor (53,3% 30 eksemplarer). Men på grunn av forskjellen i antall primærtumor (n = 65) og metastatisk (n = 18) eksemplarer innhentet, kan vi ikke trekke noen statistiske konklusjoner fra disse dataene.
Diskusjoner
Denne studien har vist, for første gang, muligheten for multipleks påvisning av tumor DNA mutasjoner utnytte multiplex OncoCarta panel fra både DNA ekstrahert fra FFPE arkiv svulstvev og cpDNA. Vi har vist at total cpDNA nivåer hos pasienter med avansert kreft er generelt betydelig høyere enn hos friske frivillige, med de høyeste konsentrasjonene er funnet i pasienter med avansert prostatakreft og brystkreft, selv om denne forskjellen var ikke signifikant i melanom og eggstokkreft (Figur 1). Den maksimale konsentrasjonen oppdaget hos friske frivillige ble funnet å dele pasientene inn i to grupper som var assosiert med signifikant forskjellige prognoser; pasienter i lave cpDNA gruppen hadde signifikant høyere OS i forhold til de i det høye cpDNA gruppe [11], [13], [22]. Videre forble cpDNA konsentrasjonen svært prognostisk for OS i en multivariat analyser utnytte prognostiske biomarkører for fase I rettssaken pasientgruppen som vi tidligere har beskrevet [20]. Vi har også vist en sammenheng mellom cpDNA konsentrasjoner og den prognostiske poengsum som vi tidligere har beskrevet for å forutsi utfallet av pasienter henvist for fase I forsøk deltakelse; cpDNA konsentrasjon, albumin 35 g /l og ytelse status hadde prognostisk verdi i vår serie av pasienter som uavhengige prediktorer for overlevelse. Disse data samlet tyder på at cpDNA i denne pasientpopulasjonen er i stor grad svulst avledet, selv om dette kan være generert av både ondartede og stromale celler.
Sequenom OncoCarta panelet har også gjort oss i stand til å analysere mer enn 230 kjente mutasjon «hot -spots «mutasjoner i over hundre pasienter i en høy gjennomstrømning mote. Den OncoCarta panel dekker et stort og økende antall onkogener og kan tilpasses til å omfatte flere gener av interesse. Den tillater tumor mutasjon deteksjon selv med minimale mengder av tumor-DNA, konservering fattig vev, og tilstedeværelsen av betydelige mengder av normal DNA. Neste generasjons sekvenseringsteknologi vil gi mer DNA dekning og datainnsamling, slik at sekvensering av hundrevis av full lengde gener, som vil være avgjørende for studiet av gener hvor mutasjoner kan finnes i flere ulike steder, slik tilfellet er for mange tumor suppressor gener som BRCA1, BRCA2, p53 og PTEN.
Når vi beveger oss mot utvikling av molekylært målrettede midler til utvalgte grupper av pasienter, er det avgjørende at molekylær karakterisering av svulster for prediksjon av effekten til målrettede terapier inkorporeres i tidlige kliniske forsøk [2], [3]. En slik tilnærming kan øke oddsen for enkelte pasientens fordel, redusere antall pasienter som får ineffektive behandlinger og ekspederer den kliniske kvalifisering av prediktive biomarkører. Arkiv svulstvev, ofte tatt mange år før, er ofte brukt for disse analysene. Tumor rebiopsy forblir uvanlig, selv om det er gjennomførbart som vist i den første kampen lungekreft adaptive rettssaken [23]. Likevel mandat flere gjentatte kreft rebiopsies utgjør logistikk, økonomiske og etiske problemstillinger, mens bremse ned prøve opptjening og ikke ta opp spørsmålet om intra-pasient lesjon-to-lesjon heterogenitet. Rebiopsy og cpDNA analyser kan både adresse bekymringer rundt svulsten genomisk ustabilitet og klonal molekylær evolusjon på grunn av terapeutiske seleksjonstrykk samtidig potensielt avhør intra-pasient heterogenitet problemet.
