Abstract
Androgen aktivitet spiller en nøkkelrolle i prostata kreft progresjon. Androgenreseptoren (AR) er den viktigste mediator for androgen aktivitet i prostata, gjennom sin evne til å virke som en mediator transkripsjon. Her utførte vi et genom-bred analyse av humant AR-binding til promotorer i nærvær av en agonist eller antagonist i en androgen-avhengig prostata kreft cellelinje. Mange av AR bundet promotorene er bundet i alle undersøkte betingelser, mens andre bare er bundet i nærvær av en agonist eller antagonist. Flere motiver er beriket i AR bundet arrangører, inkludert AR Response Element (ER) halv stedet og anerkjennelse elementer for transkripsjon faktorer Oct1 og SOX9. Dette tyder på at disse 3 faktorene kan definere en modul av samarbeidende transkripsjonsfaktorer i prostata. Interessant, AR bundet promotorer fortrinnsvis lokalisert i AT-rike genomiske regioner. Analyse av mRNA-ekspresjon identifisert kylling ovalbumin oppstrøms promoter-transkripsjonsfaktor 1 (COUP-TF1) som en direkte AR målgen som er nedregulert etter binding av agonisten liganded AR. COUP-TF1 immunfarging viste nukleolært lokalisering av COUP-TF1 i epitel av human androgen-avhengig prostata cancer, men ikke i tilstøtende godartet prostata epitel. Stromale celler både i mennesker og mus prostata viser atom COUP-TF1 flekker. Vi viser videre at det er en invers korrelasjon mellom COUP-TF1 ekspresjon i prostata stromale celler og de økende nivåer av androgen med rykkende pubertet. Denne studien utvider utvalget av anerkjente antatte AR mål og identifiserer et negativt regulert mål av AR – COUP-TF1 – som kunne spille en rolle i human prostatakreft
Citation. Perets R, Kaplan T, Stein jeg , Hidas G, Tayeb S, Avraham E, et al. (2012) Genome-Wide Analyse av androgen reseptor Targets avslører COUP-TF1 som Novel spiller i Human prostatakreft. PLoS ONE 7 (10): e46467. doi: 10,1371 /journal.pone.0046467
Redaktør: Jean-Marc A. Lobaccaro, Clermont Université, Frankrike
mottatt: 31 mars 2011; Akseptert: 3. september 2012; Publisert: 04.10.2012
Copyright: © Perets et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne forskningen ble finansiert av Dr. Miriam og Sheldon G. Adelson Medical Research Foundation (AMRF), Israel Science Foundation og Prostate Cancer Foundation (EP). TK ble støttet av en European Molecular Biology Organization (EMBO) langsiktig post-doc. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Prostatakreft er den vanligste ikke-hudkreft hos menn i USA, med et anslått antall 217,730 nye tilfeller i USA i 2010 [1]. Androgen deprivasjon terapi er i dag den mest for avansert prostatakreft behandling. Androgen deprivasjon kan oppnås gjennom androgen uttømming (for eksempel behandling med GnRH-agonister) og til i kombinasjon med androgen-antagonister slik som flutamid og bikalutamid [2] -. [4]
androgen effekt på normale og maligne celler prostata medieres gjennom sin evne til å gå inn celler og binde sin reseptor – AR. I fravær av en ligand AR er lokalisert i cytoplasma i et kompleks med varmesjokkproteiner (HSP) og co-anstand [5] – [7]. Ved androgen-binding AR gjennomgår strukturelle omleiring som resulterer i dissosiering av HSP, eksponering av den nukleære lokaliseringssignal og translokasjon inn i kjernen. Nuclear AR binder DNA, rekrutterer co-aktivatorer og letter transkripsjon av målgener. Transkripsjon av målgener er ansett for å være de viktigste middel gjennom hvilket AR påvirker cellene. Ligandbundet steroidreseptorer ble kanonisk antatt å binde en konsensus-sekvens i DNA som består av to halv-heksa områder av konsensus-sekvensen 5′-TGTTCT-3 «, arrangert som inverterte repetisjoner, adskilt av tre nukleotider [8] – [ ,,,0],15]; men dette dogmet ble nylig rette med hensyn til AR. Det ble nylig foreslått, som støttes av våre data, at den halve området er tilstrekkelig for AR-binding til DNA i nærvær av androgen [16] – [18]
I nærvær av en AR-antagonist, f.eks. som flutamide, gjør AR transkripsjonen kompleks fortsatt former, men transkripsjon av kjente AR målgener oppstår ikke muligens via rekruttering av co-repressors. For eksempel, ved tilsetning av antagonisten bikalutamid, skifter AR til kjernen, binder promotoren av sine velkjente målgen PSA og rekrutterer ko-repressorer som SMRT og NCoR [19], [20]. Dannelsen av antagonisten bundet AR transkripsjonen-kompleks ble omfattende undersøkt på enkeltpromotorer [19] – [21]. Men genom-wide promoter belegg på antagonist bundet AR ble aldri studert før. Vi antok at i androgen avhengige prostatakreftceller antagonist bundet AR binder et unikt sett av målgener, som kan avvike fra målgener av agonist bundet AR.
Vi har benyttet genome-wide plassering analyse av AR i tilstedeværelsen av agonist, antagonist eller ingen ligand for å studere forskjeller og likheter mellom AR målgener i disse betingelsene. Vi har sett flere promotorer som er konstitutivt bundet i nærvær av en agonist og antagonist, så vel som promotorer som er bundet bare i nærvær av enten en. Vi karakteriserer en roman AR negativt regulert målet genet COUP-TF1, som arrangøren er bare bundet i nærvær av antagonisten videre.
Resultater
androgen reseptor målgener i menneskelig prostata kreft celler
LAPC4 prostatakreftceller uttrykker vill type AR [22], noe som reflekterer den AR statusen mest androgen avhengige prostatakreft. I noen prostata kreftcellelinjer, kan visse AR-antagonister virke som agonister, sannsynligvis på grunn av tilstedeværelsen av en mutant AR [23] – [27]. Således vi først testet effekten av androgen, eller AR antagonist på vekst av LAPC4 celler in vitro sammenlignet med celler behandlet med bærer alene. LAPC4-celler proliferert i nærvær av androgen, men ikke i nærvær av en antagonist. Når kombinert sammen flutamide motvirker den proliferative effekten av androgen (figur S1). Disse resultatene bekrefter androgen avhengighet av LAPC4 celler, viser at flutamide fungerer som en motstander av AR er proliferativ effekt og utelukke muligheten for at flutamide kan tjene som en funksjonell AR-agonist i denne cellelinjen.
For å identifisere den direkte målgener av AR i prostata kreftceller i nærvær av en AR-agonist, AR antagonist, eller i fravær av begge, LAPC4 ble cellene først androgen ablateres i tre dager. Cellene ble deretter inkubert med bærer alene, 10 nM R1881 eller 40 uM flutamid i 16 timer. Lengden av aktivisering og R1881 konsentrasjon ble valgt i henhold til tidspunktet for maksimal AR rekruttering til sitt beste studert målgenet PSA [28]. Kromatin immuno-nedbør (chip) av AR bundet kromatin ble utført som beskrevet i materialer og metoder. Den immuno-utfelt fraksjon og en prøve av inngangs DNA ble hybridisert til en microarray som representerer 19.000 menneskelige gen-arrangører. Binding data fra tre ChIP-chip eksperimenter ble analysert og sonder som var bundet med p-verdi. 0,001 ble betraktet som AR bundet arrangører (ARB)
En analyse av AR målgener med bilen alene, R1881 og flutamide avslørte tre grupper av ARB. Det er en viss overlapping mellom målgener i de tre tilstander, så vel som ARB er spesifikke for hver tilstand (figur 1a og tabell S2). Listene over målgener avdekket noen gener som var kjent for å være regulert av AR som HOXB13 [29], [30]. Noen velkjente AR målgener slik som PSA ble ikke gjenfinnes i disse rekker til tross for det faktum at genet bestemt ChIP indikerte at det fortrinnsvis blir bundet av AR (figur S2A). Dette innebærer en viss hastighet for falske negative funn. Men som det komplette settet av mål er ukjent den feilaktig negative klassifiseringen ikke kan estimeres.
LACP4 celler ble fratatt androgen i 72 timer og deretter behandlet med bærer (ethanol), et syntetisk androgen (R1881) eller AR antagonist Flutamide. Cellene ble fiksert 16 timer etter behandling og chip på chip analyse ble utført for å identifisere AR bundet arrangører. A. Antall AR bundet arrangører i hver behandlingsgruppe, og overlapp mellom gruppene er presentert i Venn-diagram. I hver behandlingsgruppe sekvensen av promoteren er sonden i matrisen ble analysert for tilstedeværelse av den klassiske AR responselement (er), eller den halve området. Vist er frekvenser av sekvenser inneholdende det er eller halv område som finnes i hver behandlingsgruppe og frekvensen i alle probene i matrisen (bakgrunnen). En p-verdi på anrikning ble beregnet på grunnlag av gruppe frekvens i forhold til bakgrunnen av matrisen ved anvendelse av standard t-test. Inset boksen viser den klassiske AR respons element sekvens. B. Tabellen viser berikelse av ARE og en halv side i overlappinger mellom grupper. For hvert par av eksperimentelle betingelser hyppigheten av ARE-og halvparten området beregnes i overlappende aktivatorer, og i alle promotorene av begge gruppene. P-verdien til berikelse i overlappende arrangører i forhold til alle arrangører er beregnet med hypergeometrisk fordeling. C. Co-immunoprecipitation av AR og SOX9 i LAPC4 celler.
Genome-wide plassering analyseresultater ble validert ved hjelp av genet bestemt kromatin IP for åtte av de ARB i alle tre behandlinger (se figur S2 og figur 2c). Kromatin IP ble utført som beskrevet i materialer og metoder, og PCR ble anvendt for å kvantifisere mengden av et spesifikt DNA-fragment i den utfelte fraksjonen. Kvantifisering av berikelse ble gjort i en beregnings objektiv metode. Vi brukte tre fold berikelse som vår binding cutoff (basert på PSA-promoter bindende, se figur S2A). Vi har validert binding i åtte genomiske steder, hver i nærvær av kjøretøyet, agonist eller antagonist. Ut fra de 24 testede betingelser 18 ble vist å være bundet av AR i matrisen. Ut av disse, ble 16 også bundet av genet bestemt IP. Derfor konkluderte vi at i 16/18 (89%) promotor-tilstander som ble testet, gense spesifikke data bekreftet array-data, noe som indikerer en falsk positiv rate på 11%.
A. LAPC4 celler ble berøvet androgen i 72 timer og deretter behandlet med en syntetisk androgen (R1881), en AR-antagonist (flutamid) eller bærer (etanol) i 24 timer. Sanntids-PCR ble anvendt for å kvantifisere mRNA-nivåer av de angitte gener. Hvert uttrykk nivå ble regulert til GAPDH mRNA nivå og vist som gangers endring fra kjøretøyet behandlet kontrollgruppe. Hver stolpe representerer minst fire eksperimenter som hver utført i triplikater. P-verdien ble beregnet ved anvendelse av Students t-test, sammenlignet med vehikkel behandling. B. Western blot-analyse viser COUP-TF1 og AR uttrykk nivåer etter behandling med R1881 eller flutamid i 48 timer. Hver behandlingsgruppe ble utført og vist i duplikater. C. Analyse av AR binding til COUP-TF1 genomisk locus. LAPC4 celler ble berøvet androgen i 72 timer og deretter behandlet med en syntetisk androgen (R1881), en AR-antagonist (flutamid) eller bærer (etanol) i 16 timer. Brikke med et anti AR-antistoff ble utført. PCR for de angitte områdene rundt COUP-TF1 transkripsjon start stedet sammenlignet med ikke-bundet gen presenteres for 3 ganger fortynninger av innspill og immunopresipitert brøkdel. Anrikning av binding til hver region sammenlignet med en ikke-bundet promoter (GAPDH) blir kvantifisert under hvert bilde. PCR for 5 «UTR av COUP-TF1 er presentert i øverste panel (COUP-TF1 5’UTR), binding til COUP-TF1 promoter er presentert i midten panel og binding til en region oppstrøms til promoter (COUP-TF1 oppstrøms) er presentert i den nederste panel. D. Skjematisk fremstilling av AR bindingssteder i genomisk locus rundt kuppet-TF1 TSS, vist i figur C. Grønne streker representerer områder analysert for AR bindende. Genomiske plassering av AR bindende i nærvær av flutamide og R1881 er preget av grønne og oransje trekanter hhv.
Våre forsøk viste konstituerende binding av AR til Ptil arrangøren i nærvær av kjøretøy, R1881 eller flutamide (figur S2A), som forventet [20]. Konstituerende AR-binding ble validert i flere andre gener som de nye ARB
sox5 plakater (figur S2B),
dock1 plakater (figur S2C) og
slitrk3 plakater (figur S2E).
IL1R2
er en ny ARB, bundet i nærvær av enten agonist eller antagonist, men ikke uten en ligand (figurene S2f).
B3gnt5
arrangøren er bundet av AR bare i nærvær av en agonist (figur S2D).
AR målgener er jevnt fordelt langs de forskjellige kromosomene for alle ligander testet, som analyseres av Webgestalt [31] (figur S3).
Gene ontologi merknad (GO) analyse ble utført for å finne funksjonelle grupper som er beriket innen ARB. I alle ligand innstillinger undersøkt, til tross for stor variasjon i mål gener, de beriket kategorier, var disse kategoriene er involvert i DNA bindende og transkripsjon aktivitet (tabell 1).
ER halv nettstedet er utbredt i AR bindingssteder
Vi så for utbredelsen av den kanoniske androgen anerkjennelse element i ARB sett vi identifisert, sammenlignet med alle 18,051 sonder på tabellen. Vi har tillatt for inntil to uoverensstemmelser i 15 bp androgen respons element (ER) sekvens. Den ARE ble funnet i 4% av alle sonder på tabellen. Når du skanner for ARE i de tre listene over ARB var det bare mild berikelse av ER i forhold til bakgrunnen i R1881 og Flutamide grupper (figur 1a). Når du skanner for ARE i arrangører som var bundet i to av forholdene, i forhold til sin utbredelse i arrangører av begge gruppene, var det ikke lenger anrikning (figur 1b). Lignende resultater ble beskrevet av andre, både i AR bundet promotorer og AR bundet enhancere [16] – [18]. Dermed våre resultater støtter forestillingen om at den dogmatiske kanoniske ER området ikke, på egen hånd, spiller en nøkkelrolle i AR rekruttering.
Deretter spurte vi om ER halv side (5′-AGAACA-3 «) er anriket på en hvilken som helst av gruppene, uten feiltilpasninger. Halv nettstedet ble søkt i ARB sammenliknet med utvalg bakgrunn. Halv-site ARE ble funnet å være høyanriket i alle tre grupper av ARB (figur 1a). Derav tidligere rapportert halvdel område som er utbredt i ARB i nærvær av en agonist [16] – [18] er også anriket i nærvær av en antagonist. Den halve området er ytterligere beriket i arrangører som er bundet i to forhold, i forhold til sin utbredelse i begge gruppene sammen (figur 1b). Derfor i forholdene undersøkte vi den halve området er en allmenn anerkjennelse element for androgen reseptor, uavhengig av liganden.
SOX9 og Oct1 er antatte AR ko-faktorer
A sekvensanalyse av ARB ble anvendt for å åpenbare AR co-transkripsjonsfaktorer som kan vanligvis forbindes med den. For å lete etter anerkjennelse elementer av kjente transkripsjonsfaktorer vi brukte CIS [32] for å skanne ARB for tidligere definerte anerkjennelse elementer av kjente transkripsjonsfaktorer. De anrikede elementene i hver gruppe av ARB kan sees i tabell 2. Blant de elementer, hvorav noen, slik som oktober og gaffelhode familier av transkripsjonsfaktorer, ble tidligere rapportert å være involvert i AR-aktivitet [17].
Vi fant SOX9 element for å bli betydelig anriket i ARB i alle tre forholdene som ble testet. Spesielt i flutamid behandlede gruppen av ARB SOX9 gjenkjenningselementet ble funnet i 15% av ARB (p = 0,0003). Interessant nok SOX9 ble nylig beskrevet som aktive i prostata karsinogenese og embryogenese [33], [34] [35] og aktivert i respons til androgen behandling tidlig i prostata utvikling [34]. Følgelig SOX9 og AR co-immunpresipitatet i LAPC4 celler (figur 1c). Til sammen tyder Våre data SOX9 som en antatt AR co-faktor.
Vi videre ønsket å se etter nye motiver som ble beriket i ARB gjennom
de novo
motiv søk. Weeder [36], et Antalls
de novo
motiv søkealgoritme, avslørte motivet GCAAATCA å bli betydelig anriket på agonisten bundet gruppe, og ytterligere analyse viste den å bli anriket i alle ARB grupper (tabell 3 øvre parti ). Denne sekvensen overlapper den kanoniske Oct1 anerkjennelse element ATGCAAAT. Den kanoniske Oct1 anerkjennelse element er også utbredt i vår liste over ARB men ikke så betydelig som GCAAATCA (tabell 3 nedre del).
ARB ligger på AT-rike genomiske regioner
for ytterligere å karakterisere de ARB beregnet vi GC-innholdet i alle ARB, og sammenlignet med matrisen bakgrunn GC innhold. Overraskende fant vi at ARB er høyt og betydelig AT rik. GC-innholdet i hele matrisen er 54,3%, mens GC-innholdet i agonist og antagonist ARB er 46,4% (p = 1.6 * 10
-13) og 48,5% (p = 3.4 * 10
-5 ), respektivt. For å bekrefte at dette fenomenet er ikke et utvalg skjevhet i matrisen, vi sammenlignet det til GC innholdet i MLL1 bundet sonder som ble publisert ved hjelp av samme matrise [37]. MLL1 bundet prober inneholdt 56,1% GC, lik matrisen bakgrunn. For ytterligere å validere dette resultatet vi beregnet GC innholdet i tidligere publiserte AR bundet arrangører. I Massie
et al.
Datasett som analyserte androgen bundet promotorer i nærvær av androgen [16] har vi funnet et GC-innhold på 52,6% sammenlignet med 53,6% i hele matrisen (p = 0,0004). For å fastslå at dette ikke er et generelt fenomen av transkripsjonsfaktorer undersøkte vi GC-innhold av p53-bindingsseter som respons på bestråling [38]. GC-innhold av p53-bindingsseter er 55,7% i forhold til 52,5% for bakgrunnen. Derfor konkluderer vi med at AR har en tendens til å assosiere med AT rike arrangører.
AR-binding til arrangøren gjør ikke nok for androgen regulering av tilstøtende gener
For å vurdere relevansen av AR binding til transkripsjon vi målte mRNA uttrykk av flere ARB gener under 3 forskjellige androgen behandlinger der de ble funnet å binde, ved hjelp av sanntids PCR. Som ventet noen ARB viste økt ekspresjon på androgen behandling og redusert ekspresjon ved tilsetning av antagonisten flutamid. Men gjorde andre ARB som DOCK1 og GLI3 ikke vise en androgene respons under testforhold (figur 2a). COUP-TF1, som ble foreslått av genomet, bred analyse å være bundet av AR på flere steder rundt transkripsjons-startsetet (TSS), er negativt regulert av androgen (figur 2a).
Syntaxin 6 ( STX6) er en vesikkel transportproteinet som nylig ble vist å være regulert av p53 og som kreves for kreft celle adhesjon og overlevelse [39]. STX6 ble avslørt av genomet, bred sted analyse å være bundet av AR i nærvær av enten R1881 eller flutamid. STX6 mRNA nivåer ble litt nedregulert med R1881, selv om dette ikke statistisk signifikant. Men STX6 var signifikant oppregulert ved flutamide (figur 2a).
Som forventet, den velkjente AR mål PSA er oppregulert ved androgen og ned regulert av Flutamide.
Dermed AR binding til arrangøren nettsteder kan være assosiert med enten oppregulering, nedregulering eller ingen endring av transkripsjon.
COUP-TF1 regulering av AR agonister og antagonister
Vi ønsket videre å spørre om flutamide bundet AR har en funksjonell transkripsjonen rolle . For å besvare dette spørsmålet valgte vi å fokusere på en flutamide aktivert arrangøren – arrangøren av kylling ovalbumin Upstream Promoter – transkripsjonsfaktor 1 (COUP-TF1). Coup-TF1 er en foreldreløs kjernefysisk reseptor som virker hovedsakelig som en transkripsjon repressor [40], [41]. Vår
in vivo
bindende analysen antydet at AR binder genomisk sekvens oppstrøms til transkripsjon start stedet for kupp-TF1 på flere steder og 5 utranslaterte område (UTR) av
kuppet-TF1
genet. For å studere reguleringen av COUP-TF1 av AR vi først ytterligere validert binding av AR til de genomiske sekvenser som omgir kupp-tf1 transkripsjonsstartsetet. I nærvær av AR antagonist flutamid AR er bundet i området 1-2 KB oppstrøms til TSS, i kupp-tf1 promoteren og i 5 «UTR av genet. Men i nærvær av androgen AR binder området 1-2 kb oppstrøms til TSS, men ikke den promotor eller 5’UTR (figur 2c og 2d).
Som beskrevet ovenfor, COUP-mRNA-nivåer TF1 er negativt regulert av androgen og positivt regulert av Flutamide. Vi har videre bekreftet denne observasjonen på proteinnivået ved western blot-analyse. COUP-TF1 proteinnivåer i LAPC4 cellene endrer ikke etter tilsetning av R1881 i 48 timer for å androgen fratatt celler. Men i nærvær av flutamide i 48 timer, Coup-TF1 protein nivåer stige (figur 2b). Interessant, samtidig til oppregulering av COUP-TF1, AR ekspresjon nedregulert ved tilsetning av flutamid, viser en negativ tilbakekoblingssløyfe av AR aktivering i LAPC4 celler. I konklusjonen, som dokumentert av kvantitativ real-time PCR og Western blot analyser, antagonist bundet AR positivt regulerer COUP-TF1 i LAPC4 celler.
COUP-TF1 er uttrykt i maligne prostata epitelceller og ikke i normal prostata epitel
for å undersøke uttrykk mønster av COUP-TF1 i menneskelig prostata og prostatakreft vi brukte immunhistokjemi for å påvise COUP-TF1 i 28 humane tumorprøver. Vi oppdaget COUP-TF1 i ondartet epitel 21 av 28 primærprostatakreft undersøkte prøvene. Vi kunne ikke finne en sammenheng mellom COUP-TF1 flekker og Gleason score eller tilbakefall av sykdommen i enten epitelceller eller stromale celler. Men vi fant betydelig høyere nivåer av COUP-TF1 flekker ved neoplastisk prostata epitel og i pre-maligne prostata intraepitelial neoplasi (PIN) sammenlignet med farging av tilstøtende benign prostata epitel (figur 3a og 3b). Dette tyder på at COUP-TF1 kan spille en rolle i tidlige stadier av prostata tumorigenesis. Interessant nok var COUP-TF1 distribueres i epitelceller i en nukleolært distribusjon, mens stromale celler som omgir epiteliale neoplasier viste en kjernefysisk mønster av flekker.
A. Immunhistokjemisk farging av menneskelige prostata kreft prøver og tilstøtende godartede kjertler for COUP-TF1 viser en nukleolært fordeling av COUP-TF1 i maligne celler (øverst til venstre) og ingen COUP-TF1 flekker i tilstøtende godartet kjertelen (nederst til høyre). Stromale celler viser atom farging av COUP-TF1. En representant for 28 analyserte prøvene er vist. B. prostata intraepitelial neoplasi (PIN) viser nukleolært fordeling av COUP-TF1 og tilstøtende stromale celler viser atom farging. C. farging av LAPC4 xenografter viser nukleolært COUP-TF1 farging.
For å bekrefte COUP-TF1 antistoffspesifisiteten vi har farget LAPC4 xenografter for COUP-TF1 og fant en nukleolært fordeling av COUP-TF1 ( figur 3c) i likhet med fordelingen vist i human prostata cancer epitel. Western blot analyse av disse cellene med samme COUP-TF1 antistoff avslørte et enkelt bånd av 46 KD, tilsvarende COUP-TF1.
For å validere den negative regulering mellom AR og COUP-TF1 i prostata vi brukte pre-pubertale Balb /c mus. Prepubertale mus har et lavt testosteronnivå i tre uker, med nivåer øker som mus når puberteten [42] – [44]. Vi undersøkte COUP-TF1 nivåer i prostata av mus ved alder 3, 5 og 7 uker. I samsvar med våre observasjoner i humane prøver, var det ingen COUP-TF1 farging i normal mus prostata epitel. Men vi var spesielt interessert i COUP-TF1 nivåer i prostata stroma (uro-genital mesenchyme), på grunn av godt anerkjent avgjørende rolle stromal AR i prostata utvikling [45], [46]. Stromal-celle COUP-TF1 nivåer redusert med musen alder (figur 4a). Spesielt kan vi se en negativ korrelasjon mellom AR og COUP-TF1 nivåer i enkelt prostata kanaler i alle lysbilder undersøkt (sammenlign figur 4b og 4c). Disse funnene viser en invers sammenheng mellom AR aktivering og COUP-TF1 uttrykk i normal prostata utvikling.
prostates fra pre pubertal Balb /c mus på alderen 3, 5, ble 7 uker innhentet og en immunhistokjemisk flekken for ko- TF1 ble utført. For hver aldersgruppe på minst 4 mus ble analysert. A. stromal cellefarging for COUP-TF1 ble kvantifisert ved en patolog som prosent av stromale celler farget. Et gjennomsnitt av alle lappene ble beregnet for hver mus og anvendt for ytterligere analyse. P-verdien ble beregnet ved anvendelse av Students t-test sammenlignet med alder 3 uker. B. En vanlig 3 ukers gamle mus prostata ble farget for AR og c. COUP-TF1. Seriesnitt fra samme kjertelen er vist. Epitelceller er positive for AR og negative for COUP-TF1. Peri-epitelceller stromale celler, mellom blå og gule linjer, er negative for AR og positivt for COUP-TF1. Stromale celler fjernere fra kjertelen, mellom gule og grønne linjer, er positive for AR og negative for COUP-TF1. Lignende omvendt korrelerte fargemønstre ble sett i alle lysbilder undersøkt.
Diskusjoner
Overgangen av prostatakreft til hormonet ildfast staten er et viktig vendepunkt i utviklingen av prostatakreft, og AR spiller en stor rolle i denne overgangen. Foreløpig brukes AR antagonister som flutamide og bikalutamid, overtar rollen som reseptorantagonister når sykdommen blir hormon ildfast. Den første bevis for denne overgangen fra antagonist til agonist ble utledet fra klinisk observasjon at prostatakreftpasienter hadde en 30% meningsfull respons til tilbaketrekking av et steroidhormon antagonist som første manøver etter primær hormonbehandling svikt [47]. Dette fenomenet blir bedt forskere til å utforske hvordan AR antagonist kan virke som agonister i hormon ildfast prostatakreft. To studier viste at i hrpc, AR antagonister rekruttere coactivators (i stedet for co-repressors) til AR bundet målgener PSA og KLK2 gi en mekanistisk forklaring på dette fenomenet [19], [20]. Vi antok at i tillegg til denne endringen finner sted på enkelt mål genet nivå, er det en global endring i AR målgener som kan legge en annen forklaring på klinisk observasjon. For å oppnå dette, må vi først ønsket å sammenligne in vivo DNA binding av AR bundet til enten Flutamide eller androgen.
Bindingen av AR på DNA, selv om ligand avhengige, er ikke avhengig av co-aktivatorer. Ved induksjon med flutamide, AR binder seg til Ptil arrangøren. PSA-promoteren ble også vist i forskjellige forsøk for å bli bundet av AR uten ligand (figur S2A), mens forsterkeren ikke binder unliganded AR [28]. Dette fikk oss til å definere spekteret av ARB mellom unliganded AR, agonist bundet AR (R1881) og antagonist liganded AR (Flutamide).
I vårt genom-wide plassering analyse av AR målgener har vi oppdaget arrangører som er bundet konstitutivt med agonistisk ligand, antagonist ligand eller ligand ikke i det hele tatt (figur S2). Ingen av de få gener som ble antatt å være bundet bare i nærvær av kjøretøyet i henhold til vår
in vivo
bindingsanalyse, ble validert i genet bestemt kromatin immunoutfellingsanalyse; således er det mindre sannsynlig at ligandbinding induserer AR dissosiasjon fra kromatin.
Flere gener ble differensielt bundet av AR, i nærvær av agonisten eller antagonisten (figur 2c og figur S2D). For å bedømme effekten av AR-binding på transkripsjon målte vi ekspresjonen av flere av disse genene ARB under de 3 forskjellige behandlingsforhold. Noen av de konstitutivt bundet gener ble androgen regulert (f.eks STX6 og PSA). Andre ble uttrykt i LAPC4 men ikke regulert av androgen under forhold der de binder. Derfor er AR-binding ikke er tilstrekkelig for transkripsjonen aktivering av ARB eller for androgen regulering. Det er sannsynlig at flere forhold er nødvendig, for eksempel rekruttering av co-aktivatorer, flere transkripsjonsfaktorer eller histonmodifikasjonene. Alternativt AR kunne være ansvarlig for transkripsjon initiering, men ikke for transkripsjon forlengelse som er nødvendig for aktivt transkriberte gener [48].
Denne differensial binding i nærvær av flutamide kan være spesielt viktig når de vurderer antagonist til agonist konvertering i hormon ildfast prostatakreft. Det er rimelig å anta at disse genene kan lett indusert ved overgangen til hormon refraktær siden de allerede er bundet av en AR, og trenger bare å ytterligere rekruttere co-aktivatorer og basal transkripsjon maskiner. Dette funn kan også ha terapeutisk betydning å utnytte konseptet om syntetiske letalitet. De målgener som bare aktiveres i flutamid behandlede celler kan tjene som terapeutiske mål i kombinasjon med flutamid
For å få informasjon om AR aktivitet i androgen avhengige prostatakreft en bioinformatical analyse av AR målgener ble utført. GO analyse av ARB antyder at AR utøver sin cellulære effekt ved å binde til promotorer av andre transkripsjonsfaktorer i nærvær av alle de forskjellige ligander (tabell 1). Dette tyder på at AR er en mester regulator av prostata epitelceller.
Det neste vi så etter kjente og
de novo
motivene i ARB. Denne analysen kan identifisere transkripsjonsfaktorer som fungerer som co-regulatorer av transkripsjon sammen med AR. Vår analyse avslørte et ikke-konsensus Oct1 motiv som tidligere er blitt rapportert å være involvert i AR transkripsjon [49]. Analyse av alle kjente TRANSFAC motiver avdekket både Brachyury og SOX9 motiver for å bli høyanriket i ARB i alle gruppene (tabell 2).
Brachyuri er medlem av T-box protein familie som er mye involvert i embryogenesen [ ,,,0],50], og selv om det ble rapportert å bli uttrykt i prostata i stor skala uttrykk analyser [51], og i flere av prostatakreft-cellelinjer [52], dens nøyaktige rolle er aldri rapportert.
SOX9, er en Sry-relaterte høy mobilitet Group (HMG) faktor som tidligere er rapportert å spille en rolle i utvikling prostata. Det uttrykkes på å utvikle prostata epitelceller knopper med sterkest til uttrykk i de distale tuppen av knopper. En alvorlig defekt i utviklingen av den ventrale prostata ble observert i SOX9 muterte dyr [53]. Den mulige rolle SOX9 som en AR co-regulator må vurderes nærmere. Men den kooperative samspillet av POU homeodomain proteiner som Oct1 eller Oct4 med HMG faktorer som SOX9 eller SOX2 ble tidligere beskrevet [54], [55]. en.
