Abstract
Mage kreft-testis antigener (CTA) er attraktive kandidater for immunterapi. Målet med denne studien var å fastslå hyppigheten av uttrykket, humoral immunitet og prognostisk betydning av MAGE CTA i human epitelial eggstokkreft (EOC). mRNA eller protein expression frekvensene ble bestemt for MAGE-A1, -A3, -A4, -A10 og -C1 (CT7) i vevsprøver hentet fra 400 pasienter med EOC. Tilstedeværelsen av autologe antistoffer mot MAGE-antigener ble bestemt fra 285 serumprøver. Sammenhengene mellom MAGE uttrykk, humoral immunitet mot MAGE antigener, og klinisk-patologisk egenskaper ble undersøkt. De individuelle frekvensene for ekspresjon var som følger: A1: 15% (42/281), A3: 36% (131/390), A4: 47% (186/399), A10: 52% (204/395), C1- : 16% (42/267). Sterk konkordant uttrykk ble notert med MAGE-A1: -A4, MAGE-A1: -C1 og MAGE-A4: -A10 (
p
0,0005). Uttrykk for MAGE-A1 eller -A10 antigener resulterte i dårlig progresjonsfri overlevelse (PFS) (OR 1,44, CI 1.1 til 2.4,
p
= 0,044 og OR 1,3, KI 1,03 til 1,64,
p
= 0,03, henholdsvis); mens, ble MAGE-C1 uttrykk forbundet med forbedret PFS (OR 0,62, CI 0,42 til 0,92,
p
= 0,016). De forbedrede PFS observert for MAGE-C1 uttrykk, ble redusert ved samtidig uttrykk for MAGE-A1 eller -A10. Spontan humoral immunitet mot mage antigener var tilstede i 9% (27/285) av pasientene, og dette spådd dårlig total overlevelse (log-rank test
p
= 0,0137). Disse funnene tyder på at MAGE-A1, MAGE-A4, MAGE-A3, og MAGE-A10 er prioriterte attraktive mål for polyvalente immunterapi i eggstokkreft pasienter
Citation. Daudi S, Eng KH, Mhawech-Fauceglia P Morrison C, Miliotto A, A Beck, et al. (2014) uttrykk og immunrespons til MAGE antigener Tippe overlevelse i ovarialcancer. PLoS ONE 9 (8): e104099. doi: 10,1371 /journal.pone.0104099
Redaktør: Sophia N. Karagianniss, Kings College London, Storbritannia
mottatt: 22 april 2014; Godkjent: 07.07.2014; Publisert: 07.08.2014
Copyright: © 2014 Daudi et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. Den forfatterne bekrefter at alle data som underbygger funnene er fullt tilgjengelig uten restriksjoner. Alle relevante data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet delvis av Cancer Research Institute Eggstokkreft Working Group Grant, Cancer Vaccine Collaborative Grant of Cancer Research Institute og Ludwig Institute for kreftforskning, Anna-Maria Kellen Clinical Investigator Award of Cancer Research Institute (til Kunle Odunsi), National Institutes of Health 5T32 CA 108 456, National Institutes of Health R01CA158318-01A1 og Roswell Park Cancer Institute University of Pittsburg Cancer Institute Eggstokkreft Specialized Program for fremragende forskning National Institutes of Health P50CA159981-01A1. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
ovarialcancer (EOC) representerer den mest dødelige gynekologisk kreftformen hos kvinner. Til tross for betydelig innsats rettet mot tidlig oppdagelse og forbedre responsrater, de fleste kvinner tilstede med disseminert sykdom ved førstegangsdiagnose, bære en uakseptabel tilbakefall rate på ca 85% og en 5-års overlevelse på 20-30% [1], [ ,,,0],2]. Følgelig vil målrettede behandlingsstrategier, for eksempel immunterapi være nødvendig for å forbedre den kliniske resultatet av ovarialcancer pasienter.
utviklingen av vellykkede immunterapi krever karakterisering av tumor-assosierte antigener (TAA) som vanligvis uttrykkes i eggstokk tumorer, med en begrenset uttrykksmønster i normale vev. Videre bør det ideelle antigenet utviser en høy frekvens av ekspresjon i kreft og bevis for immunogenisitet. Kandidat TAA er ofte identifisert hos pasienter med sterke cellulære og /eller humorale immunresponser som indikerer robust iboende immunogenisitet til disse antigenene [3] – [5]
kreft testis antigener (CTA) er en underklasse av TAA. kodet av ca 140 gener. Til tross for deres dårlig karakteriserte biologisk funksjon, blir ekspresjon av disse antigenene er kjent for å være begrenset i immun privilegerte steder som testiklene, placenta og foster eggstokk, men ikke i andre normale vev. Unormal uttrykket av disse bakterie linjer gener i kreftsvulster kan gjenspeile aktivering av en forstummet «gametogenic program», som til slutt fører til tumorprogresjon og bred immunogenisitet [6]. Immunogenisiteten av CTA har ført til omfattende utvikling av kreftvaksiner rettet mot disse antigenene i mange faste tumorer. Innenfor denne store klassen av TAA, har melanom-assosierte antigener (MAGE) fremkom som lovende kandidater for cancer immunoterapi [7] -. [9]
Mer enn 30 kreft testis (CT) gener er blitt rapportert som medlemmer multi-genet familier som er organisert i gensamlingene på kromosom X (CT-X antigener). De CT gensamlingene ligger mellom Xq24 og Xq28 og omfatter genfamilier som MAGE og NY-ESO-1 [10]. Type I MAGE gensamlingene er den mest omfattende karakterisert og inkluderer MAGE-A, MAGE-B og MAGE-C familier. De MAGE-A-proteiner blir kodet av 12 ulike MAGE-A-genet familiemedlemmer (MAGE-A1 til MAGE-A12) og er definert ved en konservert aminosyre 165-171 base, kalt MAGE homologi domene (MHD). Den MHD tilsvarer den eneste regionen i felles aminosyrer av alle de MAGE-A familiemedlemmer. MAGE-C1 /CT7 er strukturelt forskjellig fra MAGE-A familien, med et proteinprodukt av 1142 aminosyrer (vs. 400 rester for MAGE-A proteiner) som inneholder en tandem repeat sekvens som er fraværende i MAGE-A [ ,,,0],11].
i denne studien har vi analysert uttrykket og immunogenisitet av et panel på fem MAGE CTA i en stor kohort av eggstokkreft pasienter. I tillegg har vi undersøkt forholdet mellom koordinere uttrykk for MAGE gener og klinisk-patologisk utfall.
Materialer og metoder
Pasienter og Prøvene
Formalin fiksert parafin-embedded (FFPE, for immunhistokjemi) og snap-frosne vevsprøver (for revers transkriptase-PCR) ble innhentet fra 400 pasienter som gjennomgår cytoreduserende kirurgi for eggstokkreft, primær peritoneal og eggleder kreft ved Roswell Park Cancer Institute (Buffalo, New York) mellom 1992 og 2008. Vi identifiserer, og refererer til disse tre kreftformer som EOC på grunn av deres felles opprinnelse i Mullerian epitel. Alle vevsprøver ble samlet under en godkjent protokoll fra Institutional Review Board (IRB) fra Roswell Park Cancer Institute. Pasienter inngått en IRB godkjent skriftlig informert samtykke, og disse ble innlevert i IRB kontoret. Alle patologi prøvene ble anmeldt i vår institusjon, og histopatologiske subtype av svulstene ble klassifisert i henhold til retningslinjene fra Verdens helseorganisasjon (WHO) [12], [13]. Scenen og karakteren av svulstene ble vurdert i henhold til den internasjonale føderasjonen for gynekologi og fødselshjelp (FIGO) [14], [15]. I en undergruppe av pasienter, ble serumprøver samlet opp ved diagnose. De medisinske poster av disse pasientene ble retrospektivt vurdert under en godkjent Institutional Review Board protokollen. Gjennomgangen inkluderte poliklinisk og døgnbehandling. Utfall av studiene omfattet total overlevelse (OS) og progresjonsfri overlevelse (PFS). Begge overlevelseskriterier ble målt fra tidspunktet for diagnosen. Tilbakefall ble definert via objektive kriterier som alle terapi ble gitt i adjuvant behandling. Varigheten av overlevelse var intervallet mellom diagnose og død. PFS representert intervallet mellom diagnose sykdomsutviklingen, tilbakefall eller død. Observasjonstiden var intervallet mellom diagnose og siste kontakt (død eller siste oppfølging). Data ble sensurert i siste oppfølging for pasienter uten tegn til tilbakefall, progresjon eller død.
Total Tissue RNA Isolation
Totalt vev RNA ble isolert fra frosne tumorvev ved bruk av TRI Reagens (Molecular Research Center Inc, Cincinnati, Ohio, USA) i henhold til produsentens protokoll. Potensielt kontaminerende DNA ble fjernet ved behandling med RNase-fri DNase I (Boehringer-Mannheim, Mannheim, Tyskland), etterfulgt av fenol /chroloform ekstraksjon. RNA ble oppløst i RNase-fritt H
2o. Det resulterende RNA-konsentrasjonen ble målt spektrofotometrisk (DU500 spektrofotometer, Beckman Coulter, Fulleron, CA, USA), og kvaliteten på RNA ble undersøkt ved elektroforese på 1,5% agarosegel.
revers transkriptase-PCR-analyse av MAGE -A1, MAGE-A3, MAGE-A4, MAGE-A10 og MAGE-C1 Expression
To mikrogram hver RNA prøve ble brukt til å generere cDNA med Ready-To-Go revers transkriptase-PCR (RT PCR) perler (GE Healthcare, Buckinghamshire, UK). RNA fra normal testikkelvevet (Clontech, Mountain View, CA) ble brukt som en positiv kontroll. PCR ble deretter utført for å studere uttrykket av MAGE-A1, -A3, -A4, -A10 og -C1 i 305 pasienter med EOC. Glyseraldehyd-3-phosphodehydrogenase (GAPDH) primere ble anvendt som en prøve for RNA integritet. Tabell S1 viser primer sekvenser for hvert gen og dets respektive fragment lengde. Forsterker forhold for alle genprodukter var 5 minutter ved 95 ° C, etterfulgt av 35 sykluser som besto av 1 min ved 95 ° C, 1 minutt ved 60 ° C, og 1 min ved 72 ° C. Disse syklusene ble etterfulgt av en 6-min forlengelse trinn ved 72 ° C (BioRad iCycler, BioRad Laboratories, Hercules, CA, USA). PCR-produktene ble separert over en 1,5% agarosegel og visualisert med etidiumbromid på en ultrafiolett transilluminator (IS-4400 ChemiImager, Alpha Innotech, San Leandro, CA). Intensitetene av PCR-produktene var heterogene, og noen prøver ga bare svak fragment band. Disse ble scoret positiv bare hvis resultatet kan reproduseres av en gjentatt RNA ekstraksjon og spesifikke RT-PCR fra samme tumor prøven. Tilfeller med svært lave transkripsjonsnivåer som ikke var reproduserbart positiv ble ikke ansett som positivt. PCR-produktbånd ble skåret ut fra agarosegelen og den tilknyttede DNA ble isolert med QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen, Valencia, CA, USA). DNA-prøver ble sendt inn for sekvensering for å verifisere PCR produktet.
Immunhistokjemisk Analyse av MAGE-A3, MAGE-A4 og MAGE-A10 Expression
Immunhistokjemisk (IHC) analyse ble utført ved hjelp av FFPE- vev fra 304 pasienter på microarray (TMA). TMA ble konstruert ved hjelp av 0,6 mm FFPE- vev kjerner stansede fra hver donor blokk. For å overvinne tumor heterogenitet, ble tre representative kjerner valgt fra hver tumor. De 4 um tykke vev Kjernene ble deparaffinized og forbehandlet med et spesifikt antigen henting løsning (Dakocytomation, Carpenteria, CA) over 20 minutter. Objektglass ble avkjølt i 20 minutter og deretter behandlet i 3% H
2o
2 for å slukke endogen peroksidaseaktivitet. Den TMA Glassene ble deretter inkubert med et serumfritt protein blokken (Dakocytomation, Carpenteria, CA) i 30 minutter. Tabell S2 viser antistoffer og IHC forhold. MAGE-A3 kanin anti-humane polyklonale antistoff (LS-B4662, Levetid Biosciences, Inc.) ble kommersielt kjøpt. Anti-MAGE-A4 mAb (klone: 57b) og anti-MAGE-A10 (klone: A3) hybridomsupernatanter ble produsert ved Universitetssykehuset Basel (Basel, Sveits) [16], [17]. Kanin IgG eller mus lgG1 (Sigma, St. Louis, MO) ble anvendt som den negative isotype matchet kontroll. Streptavidin biotin (LSAB +) reagenser (Dakocytomation, Carpenteria, CA) ble brukt i henhold til produsentens instruksjoner, etterfulgt av en 3,3′-diaminobenzidin (DAB) + (Dakocytomation, Carpenteria, CA) inkubasjon. Seksjoner ble kontra med hematoksylin. En grenseverdi av 5% positive tumorceller ble anvendt for å definere positivt uttrykk.
Måling av serum-antistoff ved hjelp av ELISA
Serologisk analyse av humorale immunresponser ble utført som tidligere beskrevet [18]. 285 serumprøver fra en undergruppe av pasienter ble analysert ved ELISA for seroreactivity på bakterielt produsert full-lengde rekombinante proteiner MAGE-A1, -A3, -A4, -A10 eller -C1. Som en negativ kontroll antigen, ble rekombinant dihydrofolatreduktase-protein fremstilt og anvendt i hver analyse. Serum ble fortynnet i serie fra 1:100 – 1:100,000 og tilsatt til lav-volum 96-brønners plater (Corning) belagt over natten ved 4 ° C med 1 ug /ml antigen i 25 ul og blokkert i to timer ved romtemperatur med PBS inneholdende 5% fettfri melk. Etter inkubering over natten ble platene vasket grundig med PBS inneholdende 0,2% Tween 20 og skyllet med PBS (BioTek ELx405 automatisk vaskemaskin). Serum IgG bundet til antigener ble detektert med geite anti-humane IgG antistoffer konjugert til alkalisk fosfatase (Southern Biotech). Etter tilsetning av ATTOPHOS substrat (Fisher Scientific), ble fluorescenssignalet målt ved hjelp av en Cytofluor Series 4000 fluorescens-leser (PerSeptive Biosystems). En gjensidig titer ble beregnet for hver plasmaprøve som den maksimale fortynning fortsatt er vesentlig å reagere på et spesifikt antigen. Spesifisitet ble bestemt ved å sammenligne seroreactivity blant de forskjellige antigener som ble testet. I hver analyse ble sera fra pasienter med kjent reaktivitet anvendt som kontroller. Et positivt resultat ble definert som gjensidige titers . 100
Statistical Analysis
Alle statistiske analyser ble generert ved hjelp av SAS programvare (SAS System Copyright 2002 SAS Institute Inc. v.9.2) og R 2.15.3 statistisk databehandling språk. En nominell signifikansnivå på 0,05 ble anvendt i alle tester. Ved hjelp av en 2 x 2 beredskaps tabell, ble graden av overensstemmelse mellom de ulike MAGE genekspresjonsprofiler bestemt. Fordelinger av MAGE-A1, -A3, -A4, -A10 og -C1 uttrykk og klinisk utfall ble analysert ved Wilcoxon Rank Sum Test eller Pearson Chi Square test. Multivariat analyse for uavhengige prediktorer for overlevelse ble testet ved hjelp av Cox proporsjonal risikomodell [19]. Estimerte fordelinger overlevelse ble beregnet ved metoden ifølge Kaplan og Meier [20], og tester av betydning med hensyn til overlevelses fordelinger var basert på log-rank test. Relativ prognose ble oppsummert ved hjelp av estimater og 95% konfidensintervall for hasardratio (HR). Ingen justering ble gjort for multiple sammenligninger. En fylogenetisk tre er konstruert av en Manhattan avstand, koding uttrykk som null (fraværende) og en (nåværende), og standard nabo begynte algoritme.
Resultater
Studiepopulasjon
til sammen 400 vev fra pasienter med eggstokkreft, primær peritoneal og eggleder kreft ble undersøkt ved hjelp av RT-PCR og IHC. Karakteristikken av pasientene i denne studien er presentert i tabell 1. Median alder for pasientprøven var 63 (område: 21-93), med en median varighet av oppfølging av 35 måneder (range: 1-176 måneder) . Som forventet, de fleste av pasientene med avansert stadium sykdom (82%), dårlig differensierte tumorer (74%) og med serøs histologi (64%). Platina sensitiv sykdom ble demonstrert i 182 av de 400 pasienter (46%), med 116 pasienter med platinamotstands (29%), og 16 pasienter med en platina ildfast respons (4%). Median OS for alle pasienter var 40 måneder (variasjon: 0-173), mens median PFS var 12 måneder (variasjon: 0-160).
Uttrykk for MAGE-A1, MAGE-A3 , MAGE-A4, MAGE-A10 og MAGE-C1 i Eggstokkreft
uttrykk for MAGE antigener ble evaluert av både RT-PCR og IHC for flertallet av pasientene som aktuelle prøvene var tilgjengelige. Uttrykket av MAGE-A4 og MAGE-A10 ble oppdaget concordantly av begge metoder (r = 0,31, OR = 3,88, p 0,001; r = 0,14, OR = 2,00, p 0,001 henholdsvis), men MAGE-A3 Resultatene var ikke reproduserbart konkordant (r = -0,06, OR = 0,86, p = 0,9198) på grunn av en lav sats for påvisning (tabell S3). Med mindre annet er oppgitt, vi gikk videre ved å klassifisere vev som antigen positive hvis de ble identifisert ved RT-PCR eller IHC (tabell 2). Derfor, når de vurderer alle 400 vev prøver analysert ved RT-PCR eller IHC i denne studien, frekvensene for MAGE-A3, -A4 og -A10 uttrykk ved begge metodene var 36% (131/390), 47% (186/399 ) og 52% (204/395) av vev, henholdsvis (tabell 2). MAGE-A1 og -C1 demonstrerte den laveste frekvensen for ekspresjon ved 15% (42/281) 16% (42/267), respektivt. Tabell S3 er en oppsummering av hyppigheten av MAGE mRNA og protein uttrykk i vevsprøver fra EOC pasientene.
MAGE-A3, -A4 og -A10 viste ingen farging i normalt vev (Figs.1A C), men intens farging i testikkel (Figs.1D-F). Det fargemønster var cytoplasmisk og atom for MAGE-A3 og A-4, og diffuse cytoplasmatisk farge for MAGE-A10 (Figs.1G-I).
Prøvene ble farget med polyklonalt antistoff for MAGE-A3 (X20 ), kloner 57b og A3 hybridomsupernatanter for MAGE-A4 og MAGE-A10, henholdsvis (x15). Prøver fra den normale eggstokk og testis ble anvendt som negative og positive kontroller, henholdsvis. A-C: Farging av den normale eggstokk viser ingen reaktivitet. D-F: Farging av testis viser sædkanaler med sterk intratubular flekker, og fraværende uspesifikke reaktivitet. G-I. Farging av ovarial tumor demonstrere sterk cytoplasma og /eller kjernefysiske fargemønstre
Co-uttrykk for MAGE-A og MAGE-C1 i Eggstokkreft
Hyppigheten av ko-ekspresjon av mAGE-antigener er vist i tabell 2. Den høyeste frekvensen av ko-ekspresjon ble observert for -A4: -A10 (29%). Mens de er begge relativt sjeldne, MAGE-C familien antigen (-C1) tendens til å være co-uttrykkes med MAGE-A1 [OR 4,4, p = 0,00015, CI 3.6 til 5.2] og å bli uttrykt selvstendig med den andre MAGE- En familie antigener (figur 2a). MAGE-En familie antigener -A1: -A4 [OR 3,7, p = 0,0003, 3,0 til 4,4] og -A1: -A3 [OR 2,8 p = 0,0022, CI 2.2 til 3.5] har den sterkeste co-uttrykk; nesten hvert par er forbundet med unntak for -A1: -A10 (OR = 1.2, p = 0,7 KI 0,6 til 1,8) som antyder at de er uttrykt uavhengig. For å karakterisere multivariate mønster av MAGE uttrykk, ble det fylogenetiske treet i figur 2b opprettet, der hvert blad som ender i et kakediagram symboliserer en person eller et sett av mennesker. Det er to forskjellige mønstre av uttrykk som blir observert. Den MAGE-A4 genet styrer en stor mønster av uttrykket (nederst til høyre clades), og senere utvikler seg til MAGE-A3 og -A10 uttrykk i denne pasientgruppen. Den andre unike uttrykk mønster består av et selvstendig uttrykk for MAGE-A3 og -A10, som deretter utvikler seg til -A4 (øverst i høyre clades). I sterk kontrast, synes MAGE-C1 uttrykk sjelden alene, og fremstår sporadisk i hele fylogenetisk tre. Likeledes synes MAGE-A1 sjelden og sjelden i MAGE-A10 clade. Disse observasjonene sette til sterke kliniske implikasjoner i denne store studien kohort.
(A) MAGE-A1 er co-uttrykkes med -A3 eller -A4 eller -C1. MAGE-A3 er co-uttrykkes med -A10. MAGE-A4 er co-uttrykkes med MAGE-A10. Jo mørkere farge intensitet representerer en sterkere betydning. De sterkeste assosiasjonene er mellom MAGE-A1 til -A4, MAGE-A1 til -C1 og MAGE-A1 til -A3. Odds ratio (OR) større enn 1 innebærer antigener tendens til å dukke opp sammen. (B) fylogenetisk tre for MAGE uttrykk. Hvert blad ender i et kakediagram symboliserer en person.
Korrelasjonen av MAGE Antigen Expression med klinisk utfall
Forholdet mellom MAGE uttrykk og klinikk-patologisk parametre ble undersøkt. Vi fant ut at MAGE-A3 og A4 ikke har individuelle prognostiske effekter. Derfor fokuserte vi videre analyse på MAGE-A1, MAGE-A10, MAGE-C1 og andre kjente klinisk-patologisk prognostiske faktorer i eggstokkreft.
Alene, MAGE-A10 uttrykk (204/395, 52%) var assosiert med dårligere klinisk utfall (median PFS 8,8 [07.02 til 12.03] vs. 15.5 [13.6-18.4] måneder,
p
= 0,009; OS 37.8 [28,2 til 45,0] vs. 45,0 [39,8 til 52,2] måneder, p = 0,0781). Ko-ekspresjon med MAGE-C1 (25/204, 12%) reversert denne trenden for PFS men ikke OS: A10 (+) /C1 (-) pasienter som hadde median PFS på 7,9 måneder (7.0-12.1) versus A10 (+) /C1 (+) 13,1 måneder (CI9.5-29.9). Stratifisert i fire grupper basert på A10 /C1 uttrykk mønster, har dette mønsteret (log-rank test p = 0,0133) og antyder at A10 (-) /C1 (+) uttrykk kan være beskyttende (median PFS 20 [15,7-NA] måneder ) (fig. 3).
Totalt overlevelseskurver for pasientgrupper basert på MAGE-A10 og -C1 uttrykk. MAGE-C1 uttrykk spår en bedre progresjonsfri overlevelse og en trend mot økt total overlevelse. Uttrykk for MAGE-A10 demper overlevelse utfall til graden av pasienter med negativ MAGE uttrykk.
Expression mønstre ble ikke sammen assosiert med alder (p = 0,900), scene (p = 0,1373), Karakter ( status p = 0,4532), histologi (p = 0,737), primære stedet (p = 0744) eller debulking (p = 0,112) (tabell 3). MAGE-C1 uttrykk var assosiert med platina sensitiv sykdom (28/38, 74% vs. 70/142, 49%; p = 0,009) og klinisk respons (30/38, 79% vs. 92/164, 56%, p = 0,015).
Selv om vi fokusert på MAGE-A10, jo mindre utbredt MAGE-A1 (42/281, 15%) ble også mildt assosiert med dårligere overlevelse utfall (median PFS 10.3 [6.2- 15.0] vs 12.8 [10.5-15.7] måneder
p
= 0,043, OS 38.7 [20,3 til 78,4] vs. 41.3 [36.5-46.6] måneder p = 0,607). For PFS, MAGE-A1 co-uttrykk med A10 er overflødig (stratifisert log-rank test p = 0,57) men A1 (+) /A10 (-) pasienter har litt dårligere prognose (median PFS 12,7 [5,3 til 36,6] vs. 16,3 [14.1-19.4] måneder, p = 0,0187). For å modellere alle tre antigener i fellesskap, anbefaler vi vurderer uttrykk for enten A1 eller A10 antigen sammen med uttrykk for MAGE-C1; effekten er ikke signifikant forskjellig fra lagdelpresentert i Tabell 3.
korrelasjon mellom antistoffrespons til MAGE Antigen med klinisk utfall
ELISA for serum MAGE antigen-spesifikke antistoffer ble utført på serumprøver oppnås ved diagnose av 285 av de 400 EOC pasienter (tabell 2). Spontant induserte humoral respons til minst en MAGE-A-antigen ble observert i 9% (27/285) av pasientene, hvorav 85% (23/27) også uttrykt et MAGE-A-antigen. Den serologisk respons på noen MAGE antigen ble likt fordelt mellom alle klinisk-patologisk parametre (Tabell 4). Tilstedeværelsen av humoral immunrespons overfor noen av MAGE-antigener spådd en dårligere total overlevelse (median 12,3 PFS [6,4 til 19,7] 13,5 vs. [10.9-16.5], p = 0,231; median OS 27,8 [17,3 til 52,2] 45,4 vs. [40.2-51.9] måneder, p = 0,002) (figur 4).
Totalt overlevelseskurver for pasientgrupper basert på tilstedeværelse av anti-MAGE autoantistoff. Humoral respons til noen MAGE antigen spår dårlig total overlevelse, og ingen signifikant sammenheng med progresjonsfri overlevelse.
Diskusjoner
Immunterapi er en lovende metode for å bedre overlevelse og klinisk utfall i ovarian kreftpasienter [21] – [23]. Blant de mulige tumor antigen mål, blir CTA betraktes som de mest lovende kandidater for utvikling av antikreftvaksiner. For å vurdere nytten av MAGE familien CTA som mål for spesifikk immunterapi i EOC, ble den fore omfattende analyse foretatt på et stort panel av ovarietumorer. Våre resultater tyder på avvikende ekspresjon av MAGE-A1, MAGE-A3, MAGE-A4, MAGE-A10 og MAGE-C1 i 15%, 36%, 47%, 52% og 16% av EOC prøver, henholdsvis. I tillegg har vi funnet at med tanke på noen av disse MAGE-antigener, ca. 78% viste ekspresjon av minst en av disse fem CT antigener. Videre ble MAGE-A1 og MAGE-A10 uttrykk assosiert med dårlig klinisk utfall, mens MAGE-C1 /CT7 ble assosiert med bedret overlevelse.
Hyppigheten av MAGE uttrykk i EOC at vi rapporterer er generelt i samsvar med det rapportert for de fleste andre tumorer, med unntak av melanom og ikke-småcellet lungekreft [16], [24]. Ekspresjon av MAGE-A3-mRNA ble funnet i 10-40% av flere tumortyper, inkludert blære [25], bryst [26] og multippel myelom [27]. Med hensyn til EOC, er frekvensen av MAGE-A1 og -A3 uttrykk som vi rapporterer lik den som er rapportert i tidligere studier, med unntak av Zhang
et al
som fant en 54% og 37% ekspresjon i ovarian cancer vev, henholdsvis [28] – [30]. Dette kan gjenspeile forskjeller i studiepopulasjoner, så det var langt flere tidlig stadium svulster enn vår studie gruppe. I en tidligere studie, uttrykk for MAGE-A4 negativt korrelert med overlevelse eller indirekte til etablerte prognostiske faktorer i eggstokkreft [31]. I samsvar med disse studiene våre funn viser en klar assosiasjon til MAGE uttrykk og prognose. I denne forbindelse, mens MAGE-A1 og MAGE-A10 ekspresjon var assosiert med dårlig klinisk resultat, ble MAGE-C1 forbundet med forbedret overlevelse. Disse motstridende overlevelses funnene blant de ulike MAGE antigen familier heve mange viktige spørsmål om rollen som trollmannen gener i tumordannelse, invasjon og metastasering i EOC.
Generelt MAGE antigener er oftere uttrykt hos pasienter med avansert sykdom og dårlig resultat, noe som indikerer at deres uttrykk kan bidra til tumorigenesis [26], [32] – [37]. Flere studier har vist at MAGE proteiner er kritisk for celleoverlevelse, og øker tumorigene egenskaper av celler og derfor kan aktivt bidra til utvikling av maligniteter [38] – [40]. Dessuten, siden CT antigen ekspresjon har blitt forbundet med tumorigen transformasjon av kreft stamceller [41], er det mulig at MAGE-A1 og MAGE-A10 uttrykk eggstokkreft celler representerer en populasjon med selvfornyende stamcelleegenskaper, og derfor mer motstandsdyktig til immun eliminering eller kjemoterapi.
i motsetning til MAGE-A1 og MAGE-A10, den mulige mekanismen (e) der uttrykk for MAGE-C1 /CT7 ensidige overlevelsesgevinst er mindre klar. Ved sammenligning av proteinstrukturen av MAGE familien, mens de første og andre domener er sterkt konservert blant de MAGE-A og -C-familiemedlemmer, bærer MAGE-C1-proteinet en unik funksjon. I tillegg til et 275-aminosyre-MAGE-homologe segment på sin C-terminale ende, har MAGE-C1 /CT-7 et 867-aminosyre-regionen består av tre typer av tandem repetisjoner i sin N-terminale ende [11]. Denne regionen kan være av vesentlig betydning som den repeterende protein sekvensen kan forme epitoper som presenteres for immun anerkjennelse av MAGEC1 /CT-7 og potensielt dermed avgjøre kvaliteten på de resulterende immunresponser.
I tillegg viser våre resultater at pasienter med anti-MAGE humoral immunitet hadde dårligere prognose. Disse funnene har ikke nødvendigvis at anti-MAGE immunresponser direkte påvirke behandlingsresultatene i eggstokkreft pasienter. Siden antigen tetthet presentert av antigenpresenterende celler
in vivo
differensielt påvirker genereringen av anti-tumor humoral og T-celleresponser [42], foreslår at pasienter som utviklet spontane immunresponser er de med høy tetthet antigen fordi av avansert sykdomsbyrde, og dermed med dårligere prognose. Disse pasientene er likevel sannsynlig å dra nytte av MAGE-rettet immunterapi fordi deres pågå anti-MAGE-A immunresponser er ikke effektive. I en tidligere studie av spontane humorale immunresponser mot NY-ESO-en CT antigen, virkningen av humoral immunitet var nøytral på pasientens prognose [43].
Fordi uttrykk for MAGE antigener er regulert av epigenetiske mekanismer slik som metylering og histon acetylering, begrunnet vi at MAGE-antigen ekspresjon i tumorer kan være et resultat av aktivering av en koordinert gen-ekspresjon program, i stedet for en serie av uavhengige hendelser [6]. Ved hjelp av analytiske metoder, denne studien identifisert betydelig co-uttrykk blant mage antigener. Disse resultatene støtter forestillingen om at eggstokkreft får en gametogenic transkripsjon profil, hvor typisk forstummet gener er nå aktivert fører til tumorprogresjon. Våre resultater tyder på at MAGE-A4 er den sentrale genet som styrer mønsteret av ekspresjon av andre gener, med MAGE-C1 bare dukker sporadisk i fylogenetisk tre. Til sammen våre resultater tyder på at MAGE-A1, -A10 og -C1 er mulige prognostiske faktorer i eggstokkreft, med MAGE-A1 og A-10 assosiert med dårlig prognose; og MAGE-C1 /CT7 assosiert med bedre prognose. Vi foreslår MAGE-A1 og MAGE-A10 som prioriterte mål for immunterapi i eggstokkreft. Siden MAGE-A4 viser en relativt høy frekvens av uttrykk, og ser ut til å lede en større mønster av co-uttrykk for andre MAGE antigener (fig. 2b), vi også foreslå MAGE-A4 som et prioritert mål for eggstokkreft immunterapi.
Hjelpemiddel Informasjon
Tabell S1.
Primere for MAGE gener for RT-PCR
doi:. 10,1371 /journal.pone.0104099.s001 plakater (docx)
Tabell S2.
MAGE antistoffer og betingelser for IHC
doi:. 10,1371 /journal.pone.0104099.s002 plakater (docx)
tabell S3.
MAGE antigen status på eggstokkreft
doi:. 10,1371 /journal.pone.0104099.s003 plakater (docx)
Takk
Forfatterne ønsker å takke Erika Ritter og Christina Sedrak, fra LICR NY gren, for deres utmerkede teknisk assistanse.
