Abstract
Bakgrunn
Blant gynekologiske kreftformer, er eggstokkreft den nest vanligste og har den høyeste dødeligheten. Kreft er en genetisk lidelse og oppstår på grunn av opphopning av somatiske mutasjoner i kritiske gener. En forståelse av det genetiske grunnlaget for eggstokkreft har implikasjoner både for tidlig deteksjon og for terapeutisk intervensjon i denne pasientgruppen.
metodikk /hovedfunnene
Femten eggstokkreft cellelinjer, som vanligvis brukes til in vitro-forsøk, ble undersøkt for mutasjoner ved hjelp av toveis direkte sekvensering i alle kodende regioner i
BRAF
,
MEK1 Hotell og
MEK2
.
BRAF
mutasjoner ble identifisert i fire av de femten eggstokkreft cellelinjer studert. Sammen utgjør disse fire cellelinjer inneholdt fire forskjellige
BRAF
mutasjoner, hvorav to var romanen. ES-2 hadde den vanlige B-Raf p.V600E mutasjon i ekson 15 og Hey inneholdt et ekson 11 missense mutasjon, p.G464E. De to nye B-Raf mutanter identifisert ble en 5 aminosyre heterozygot delesjon p.N486-P490del i OV90, og en exon 4 missense substitusjon p.Q201H i OVCAR 10. En av cellelinjene, ES-2, inneholdt en mutasjon i MEK1, spesielt, en roman heterozygot missense substitusjon, p.D67N som resulterte fra en nt 199 G → en overgang. Ingen av cellelinjene inneholdt kodende region mutasjoner i
MEK2
. Funksjonell karakterisering av MEK1 mutant p.D67N ved transient transfeksjon med påfølgende Western blot analyse viste økt ERK-fosforylering sammenlignet med kontroller.
Konklusjon /Betydning
I denne studien rapporterer vi roman
BRAF
mutasjoner i ekson 4 og ekson 12 og også rapportere den første mutasjon i
MEK1
assosiert med kreft hos mennesker. Funksjonell data indikerer
MEK1
mutasjon kan gi endring av aktivisering gjennom MAPK veien. Betydningen av disse funnene er at
BRAF Hotell og
MEK1 /2
mutasjoner kan være mer vanlig enn forventet i eggstokkreft som kan ha viktige implikasjoner for behandling av pasienter med denne sykdommen, og antyder potensielt nytt terapeutiske muligheter
Citation:. Estep AL, Palmer C, McCormick F, Rauen KA (2007) Mutasjon Analyse av
BRAF
,
MEK1 Hotell og
MEK2
i 15 eggstokkreft cellelinjer: Konsekvenser for terapi. PLoS ONE 2 (12): e1279. doi: 10,1371 /journal.pone.0001279
Academic Redaktør: Amanda Toland, Ohio State University Medical Center, USA
mottatt: 25. juli, 2007; Godkjent: 13 november 2007; Publisert: 05.12.2007
Copyright: © 2007 Estep et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. NIH stipend HD048502 (KAR) gitt delfinansiering. Canary Foundation gitt delfinansiering. The Canary Stiftelsen ikke har en rolle i innsamling, analyse og tolkning av data
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Eggstokkreft er den nest vanligste gynekologisk kreft i USA påvirker ca 22.000 kvinner hvert år forårsaker anslagsvis 15.200 dødsfall [1]. Kreft er en genetisk forstyrrelse som følge av akkumulering av somatiske mutasjoner i gener som er involvert i kritiske cellulære veier. Disse mutasjonene vanligvis resultere i proteiner som viser deres onkogene effekt ved å endre signaliserer gjennom vitale transduksjon nettverk, eller i haploinsufficiency av kritiske tumor suppressor proteiner.
Forstå det genetiske grunnlaget for eggstokkreft har implikasjoner både for tidlig deteksjon, samt som for terapeutisk intervensjon i denne pasientgruppen. Gener som har blitt funnet somatisk mutert i eggstokkreft inkluderer
KRAS product: [2] – [5],
NRAS product: [2],
PIK3CA product: [5] – [9 ],
PTEN product: [5], [10], [11],
TP53 product: [5], [12], [13] og
BRAF product: [2] – [4]. B-Raf, proteinproduktet av
BRAF
, er en serin /treonin proteinkinase, og den første i mitogen-aktivert proteinkinase (MAPK) kaskade som er en av de mange nedstrøms effektor veier av Ras. Ekstracellulære stimuli fører til aktivering av Ras, som i sin tur aktiverer Raf (A-Raf, B-Raf og /eller C-Raf-1). Raf deretter fosforylerer og aktiverer MEK1 og /eller MEK2 (MAPK kinase). MEK1 og MEK2 er treonin /tyrosin-kinaser med begge isoformer ha evnen til å fosforylere og aktivere ERK1 og ERK2 (MAPK). ERK, en gang aktiveres av MEK, har tallrike cytosolisk og nukleære substrater [14]. Avvikende oppstrøms signalisering resulterer i hyperactivated ERK spiller en sentral rolle i patogenesen og progresjon på ca 30% av menneskelige kreft, inkludert kreft i eggstokkene [15]. Som et resultat av dette har denne veien vært et attraktivt mål for utvikling av lavmolekylære inhibitorer for behandling av kreft [16].
Gener som omfatter MAPK-reaksjonsveien,
BRAF
,
MEK1 Hotell og
MEK2
, ble systematisk skannet for mutasjoner i 15 eggstokkreft cellelinjer ved hjelp av toveis direkte sekvensering av alle eksoner. Tidligere rapporter har vist at B-Raf er mutert i ca 28-37% av lav grad av serøse karsinom [3], [17]. Med denne informasjonen, ble vårt søk utvidet til å omfatte
MEK1 Hotell og
MEK2
, to gener sammen med
BRAF
, som vi nylig har besluttet å være årsaks for cardio-Facio -cutaneous (CFC) syndrom (MIM 115150), en flere medfødt anomali syndrom hvor enkeltpersoner har karakteristisk craniofacial dysmorphia, hjertefeil og ectodermal anomalier [18]. Interessant, i motsetning germline mutasjoner identifisert i CFC syndrom, ingen somatiske mutasjoner noen gang har blitt identifisert i
MEK1 /2
i noen krefttype. I vår analyse roman
BRAF
mutasjoner ble identifisert i exon 4 og ekson 12 av to separate cellelinjer. I tillegg rapporterer vi den første funksjonelle mutasjon i
MEK1
assosiert med kreft hos mennesker. Betydningen av disse funnene er at
BRAF Hotell og
MEK1 /2
mutasjoner kan være mer vanlig enn tidligere er ført i eggstokkreft, noe som kan ha viktige implikasjoner for behandling av pasienter med eggstokkreft.
Resultater
BRAF og MEK1 mutasjoner
Genomisk DNA fra 15 eggstokkreft cellelinjer ble screenet for
BRAF
mutasjoner i koding eksoner 1-18. Fire mutasjoner ble identifisert i fire individuelle cellelinjer: OVCAR 10, OV90, Hey og ES-2 (figur 1). Ingen av de andre cellelinjer hadde
BRAF
mutasjoner. To av de fire
BRAF
mutasjoner identifisert var romanen. OVCAR 10 inneholdt en nt 603 G → T transversjon forårsaker en heterozygot missense substitusjon p.Q201H i ekson 4 (figur 1A). OV90 inneholdt en roman heterozygot 5 aminosyre sletting, p.N486-P490del i ekson 12 (figur 1B). I tillegg til de to nye
BRAF
mutasjoner identifisert, ble ytterligere to mutasjoner som tidligere har blitt rapportert i kreft identifisert. Hei inneholdt en nt 1391 G → En overgang som resulterer i en ekson 11 missense mutasjon, p.G464E (figur 1C). Den elektroferogrammet demonstrerte tap av heterozygositet på dette locus. ES-2 inneholdt en exon 15, T → A transversjon ved nt 1799, ved å erstatte glutaminsyre for valin i posisjon 600 (p.V600E) (figur 1D). Ingen av disse mutasjonene ble identifisert i kontrollene.
Fire
BRAF
mutasjoner ble identifisert i fire individuelle cellelinjer. A) OVCAR 10 inneholdt en nt 603 G → T transversjon forårsaker en heterozygot missense substitusjon p.Q201H i ekson 4. B) OV90 inneholdt en roman heterozygot sletting starter på nt 1457 (pil) som resulterer i en 5 aminosyre sletting, p.N486 -P490del, i ekson 12. C) Hey inneholdt en nt 1391 G → en overgang som resulterer i tap av heterozygositet. D) ES-2 inneholdt en exon 15, T → A transversjon ved nt 1799, ved å erstatte glutaminsyre for valin i posisjon 600 (p.V600E). E) En nt 199 G → En overgang i
MEK1,
exon 2 resulterte i en missense substitusjon heterozygot, p.D67N.
Alle elleve koding eksoner av
MEK1
og
MEK2
ble også sekvensert i de samme cellelinjer og kontroller. En mutasjon i
MEK1
ble identifisert i ES-2 består av en roman heterozygot missense substitusjon, p.D67N, noe som resulterte fra en nt 199 G → En overgang (figur 1E). Ingen andre nonsynonymous erstatninger i MEK1 ble identifisert. Alle elleve koding eksoner av
MEK2
ble sekvensert og ingen nonsynonymous erstatninger ble identifisert.
nukleotidvariasjon
I tillegg til disse mutasjonene, totalt fire forskjellige synonymt enkeltnukleotidpolymorfi (SNPs) ble identifisert i
BRAF plakater (tabell 1),
MEK1 plakater (tabell 2), og
MEK2 product: (Tabell 3). Tre av disse fire SNPs ble funnet i fem eller flere av de femten cellelinjer og har tidligere blitt rapportert (www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP/). I rekkefølgen av frekvens, de tre synonyme database SNPs omfatter: i) MEK2 p.I220I (rs10250) til stede i 11 av de 15 cellelinjer (73%), ii) BRAF p.G634G (rs9648696) funnet i seks av de 15 mobil linjer (40%) og, iii) MEK2 p.D151D (rs17851657) identifisert i fem av de 15 cellelinjer (33%). Det var en entydig identifisert MEK1 SNP i OVCAR 10 som følge av en nt 348 heterozygot G → En overgang i ekson 3, p.Q113Q (tabell 2). Alle synonymt SNPs ble preget av SIFT (sortering Intolerant Fra Tolerant) og fast bestemt på å bli tolerert.
Funksjonell karakterisering av Mutants
SIFT ble brukt for å karakterisere funksjonelle betydningen av de nonsynonymous aminosyresubstitusjonene identifiseres i B-Raf og MEK1. B-Raf p.G464E, ble p.N486-P490del, p.V600E og MEK1 p.D67N spådd å være skadelige erstatninger forårsaker en endring av protein funksjon, mens B-Raf p.Q201H ble spådd å bli tolerert.
for å underbygge den funksjonelle endring av den nye MEK1 p.D67N mutanten er identifisert i ES-2, transient transfeksjon av HEK 293T-celler med påfølgende Western blot-analyse viste øket kinase-aktivitet som målt ved hjelp av ERK-fosforylering (figur 2). Den MEK1 p.D67N mutant hadde økt ERK-fosforylering sammenlignet med villtype MEK1. Nivået av ERK-fosforylering var lavere enn CFC-MEK1 p.Y130C mutant som er kjent for å ha et høyt aktivitetsnivå (positiv kontroll).
Menneskelige embryoniske nyre 293T-celler ble transient transfektert med tom vektor, vill skriver MEK1, MEK1 p.Y130C (positiv kontroll mutant som har kjent høyt aktivitetsnivå [18]) og MEK1 p.D67N mutant. ERK (P44 ERK1 og ERK2 p42) fosforylering ble analysert ved Western blotting ved anvendelse fosfo-spesifikke antistoffer. Den p.D67N MEK1 mutant hadde øket ERK-fosforylering sammenlignet med nivået indusert av tom vektor og villtype-MEK1. Nivået av ERK-fosforylering indusert av p.D67N MEK1 er litt mindre enn den CFC MEK1 p.Y130C mutant som er kjent for å ha øket aktivitet [18]. Myc-merket MEK1 er vist for transfeksjon effektivitet og total ERK er vist som en lasting kontroll.
Diskusjoner
Altered signaliserer gjennom MAPK veien i kreft ofte resultater fra mutasjoner i oppstrøms komponenter av ERK, inkludert K-Ras, N-Ras, H-Ras, C-Raf-1 og B-Raf [15]. Molekylære studier av eggstokkreft cellelinjer og vevsprøver har identifisert genetiske mutasjoner i noen av disse genene,
KRAS
,
NRAS Hotell og
BRAF
, noe som resulterer i endring av signaliserer gjennom denne kritiske veien [2], [19] -. [23]
Somatiske mutasjoner i
BRAF
har blitt rapportert med høy frekvens i en rekke kreftformer, inkludert melanom, skjoldbruskkjertelen, kolorektal og eggstokkene. Omtrent 70 missense mutasjoner som påvirker 34 kodon er rapportert (www.sanger.ac.uk/genetics/CGP/cosmic). I kreft, de fleste somatiske
BRAF mutasjoner
resultere i missense substitusjoner som finnes i, men ikke begrenset til, ekson 11 (glycin-rike loop) og exon 15 (aktiveringen segment) i protein kinase domene [ ,,,0],24]. En missense mutasjon i ekson 15 resulterer i et bytte missense, B-Raf p.V600E, står for over 90% av
BRAF
mutasjoner identifisert i human kreft. Krystallstrukturen av B-Raf viser at aktiveringen segmentet blir holdt i en inaktiv konformasjon ved assosiasjon med den G-sløyfe. Mutasjoner i disse to regioner, glycin-rike løkke og aktiveringen segmentet, antas å forstyrre denne interaksjonen, omdannelse av B-Raf til sin aktive konformasjon [25].
I tillegg til somatiske mutasjoner, kimlinje-mutasjoner i
BRAF
har nylig blitt identifisert som forårsaker CFC syndrom, en multippel medfødt anomali lidelse der enkeltpersoner har karakteristiske kraniofaciale dysmorphisms, hjertefeil, ectodermal avvik og forsinket utvikling [18], [26]. De fleste av de mutasjonene i CFC-syndrom faller utenfor exon 11 og ekson 15 protein kinase domene. Den vanligste utløsende CFC mutasjon, p.Q257R, ligger i exon 6 av det cysteinrike domene. Som de fleste kreftfremkallende mutasjoner i
BRAF
, biokjemiske studier har fastslått at de fleste nye CFC B-Raf mutant proteiner har øket kinase-aktivitet i forhold til den kinase-aktivitet av villtype B-Raf [18], [26 ]. Disse studiene avbryte det faktum at
BRAF
mutasjoner oppstår ikke bare somatisk men også i germline, og at mutasjoner som økte kinase aktivitet er ikke begrenset til de som typisk assosiert med kreft.
Toveis sekvense av alle de kodende eksoner av
BRAF
i 15 godt karakterisert og sterkt utnyttet eggstokkkreft cellelinjer identifisert fire cellelinjer med
BRAF
mutasjoner. Bare en cellelinje hadde felles ekson 15
BRAF
mutasjon. ES-2 som er avledet fra eggstokk-klar karsinom [27] hadde den felles heterozygot p.V600E missense mutasjon. Tidligere rapporter har vist at B-Raf er mutert oftest i lav grad av eggstokk serøse karsinomer med en frekvens på ca 28-37%, og at alle mutasjoner er den vanlige B-Raf p.V600E variant [3], [17]. Interessant, de to serøs-avledede cellelinjer undersøkt i denne studien (Hei og OV90) har ikke den vanlige B-Raf p.V600E mutasjon; men begge gjorde inneholde
BRAF
mutasjoner. Hei, stammer fra en papillær serøs carcinoma [28], inneholdt et ekson 11 missense mutasjon, p.G464E. Denne missense mutasjon er blitt beskrevet tidligere (www.sanger.ac.uk/genetics/CGP/cosmic) og er også et kodon som er mutert i CFC-syndrom ([29]; Rauen, upubliserte data). OV90 som er avledet fra en serøs adenokarsinom [30] inneholdt en ny mutasjon i exon 12 som resulterer i en heterozygot fem aminosyre-delesjon, p.N486-P490del. Selv om svært sjelden, somatisk ekson 15 B-Raf i-ramme sletting-innsettinger er rapportert i kreft [31], [32]. I tillegg identifiserte vi to KFK personer med små i-frame slettinger i ekson 11 (Rauen, upubliserte data). Til slutt, OVCAR 10, som er avledet fra en human ovarian epitelial cancer, hadde en unik heterozygot missense substitusjon p.Q201H i exon 4. Denne nonsynonymous SNP er ikke blitt identifisert i kreft eller CFC-syndrom, og ble bestemt til å bli tolerert ved å sile så kanskje B-Raf p.Q210H representerer en sjelden polymorfisme.
Bare to av eggstokkreft cellelinjer hadde mutasjoner i typisk påvirket ekson 11/15 regioner i B-Raf protein kinase domene. Dette funnet øker muligheten for at kreft-assosiert
BRAF
mutasjoner utenfor ekson 11/15 kan være mer vanlig enn forventet. Siden de aller fleste av
BRAF
mutasjon undersøkelsen studier publisert er begrenset til eksoner 11 og 15, andre mulige mutasjoner utenfor disse områdene kan bli oversett.
For å utforske den funksjonelle betydningen av disse romanen B- Raf mutanter, ble alle de som er identifisert i denne studien analyseres av SIFT (https://blocks.fhcrc.org/sift/SIFT.html), en online mutasjon analyse program som spår funksjonell konsekvens av nonsynonymous aminosyresubstitusjoner [33], [34]. Alle
BRAF
identifiserte mutasjoner ble spådd å ha endret protein funksjon bortsett p.Q201H. Den funksjonelle betydningen av
BRAF
koding mutasjoner i andre valutaer enn 11 og 15 eksoner støttes av biokjemiske studier av nye germline mutasjoner identifisert i CFC. Som somatiske mutasjoner, de fleste CFC germline mutasjoner gi en økt kinase aktivitet, mens noen er kinase svekket. Men alle CFC mutasjoner som har vært biokjemisk preget alter protein funksjon til en viss grad ([18], [26]; Rauen, upubliserte data).
B-Raf har bare to kjente nedstrøms effektorer, MEK1 og MEK2 . I et forsøk på å karakterisere mutasjon spekteret av MAPK veien i eggstokkreft, vi også sekvensert
MEK1 /2
og identifisert en roman MEK1 heterozygot missense substitusjon, p.D67N i ES-2 som resulterte fra en nt 199 G → En overgang. Dette er den første identifiserte funksjonelle MEK mutasjon assosiert med kreft, og representerer ikke en sjelden polymorfisme i at denne mutasjonen ble ikke identifisert i 40 normale kontroller (80 alleler) eller i 52 KFK individer (104 alleler) vi har sekvensert oppdatert ([18 ]; Rauen, upubliserte data). Interessant, selv om vi ikke hadde identifisert denne MEK1 p.D67N mutant i vår CFC kohort, denne samme MEK1 mutasjon har nylig blitt rapportert som en germline mutasjon i CFC syndrom [29]. I tillegg til et
MEK1
mutasjon, ES-2 hadde også en p.V600E missense substitusjon B-Raf. Disse to mutasjoner kan ha blitt samarbeider tumorigene hendelser. Hva gjør dette funnet spesielt interessant er det faktum at tidligere sekvense studier av MEK1 /2 protein kinase domene ikke klarte å identifisere eventuelle mutasjoner i hjernesvulst, testiklene bakterie celle svulster, brystkreft og lungekreft [35] – [38]. Spesielt, p.D67N i ES-2 faller utenfor protein kinase domene som spenner fra AA 68-271 (www.ensembl.org/Homo_sapiens). Mange CFC kimlinje-mutasjoner befinner seg 5 «av protein kinase domene ([18], [29], [39]; Rauen, upubliserte data). Funksjonelle studier av disse nye KFK-mutanter har vist økt aktivitet
in vitro
enn villtype-MEK i å stimulere ERK-fosforylering, men disse CFC mutanter ikke er så aktiv som en kunstig generert konstitutivt aktiv MEK-mutant ([18]; Rauen, upubliserte data). Andre studier har vist at forandring av den N-terminale ende av MEK øker den basale kinaseaktiviteten impliserer en viktig regulatorisk rolle sammen med substratet gjenkjennelse [40] -. [42]
For å vurdere den funksjonelle konsekvens av MEK1 s. D67N dette aminosyresubstitusjon ble analysert ved SIFT og funnet å være funksjonelt påvirket. For å bekrefte denne informasjonen, ble MEK1 p.D67N transient transfektert inn i HEK 293T celler, og ERK-fosforylering ble målt ved Western blot analyse. Den MEK1 p.D67N mutant aktiverer som demonstrert ved økt ERK-fosforylering, sammenlignet med tom vektor og villtype-MEK1, to kontroller som ikke aktiverer ERK. Men nivået av ERK-fosforylering for p.D67N er mindre enn den positive kontrollen CFC MEK1 p.Y130C mutant [18].
I tillegg til
BRAF Hotell og
MEK1
mutasjoner, ble flere synonymt database SNP også identifisert. B-Raf p.G634G (rs9648696) ble påvist i 40% av de 15 cellelinjer, MEK2 p.I220I (rs10250) var til stede i 73% og MEK2 p.D151D (rs17851657) ble påvist i 33% av cellelinjene. Disse synonyme database SNP’er var til stede ved en frekvens som er sammenlignbar med den som tidligere er rapportert (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP/snp; [43]). Det var en entydig identifisert
MEK1
SNP i OVCAR 10 som følge av en nt 348 heterozygot G → En overgang i ekson 3, p.Q113Q. Alle synonymt SNPs ble preget av SIFT og fast bestemt på å bli tolerert.
Våre funn understreker at mutasjoner som endrer funksjon av MAPK pathway spiller en viktig rolle i eggstokkreft [15]. I tillegg vil identifikasjonen av mutasjoner i nøkkel MAPK pathway komponenter være viktig for å bestemme responsen av kreft terapeutiske midler til, den aggressive og metastatiske adferd av tumoren og prognosen for pasienten. Fire av 15 (26%) cellelinjer i denne studien hadde
BRAF
mutasjoner og 1 av 15 (7%) hadde en MEK mutasjon. Det er kjent at
BRAF
mutasjoner har blitt identifisert i visse typer eggstokkreft; Men mutasjoner i nedstrøms effektorer av B-Raf inkludert
MEK1 Hotell og
MEK2
kan også være viktige bidragsytere på eggstokkreft tumorigenesis. Definere pathogenetics av eggstokkreft kan muliggjøre bruk av målrettede terapeutiske, for eksempel små molekyl hemmere av MAPK sti, som nylig har begynt å vise store løftet [16]. I tillegg viser en rapport som celler med aktiverte B-Raf har forbedret, selektiv følsomhet for MEK-hemmere [44]. Våre resultater understreker viktigheten av at ytterligere karakterisering av sensitiviteten av ulike BRAF og MEK mutanter til lite molekyl hemming er en viktig vei å forfølge mot utvikling av effektive behandlinger for eggstokkreft.
Metoder
celle~~POS=TRUNC linjer~~POS=HEADCOMP og isolering av genomisk DNA
Femten eggstokkreft cellelinjer, som vanligvis brukes for
in vitro
eksperimenter, ble screenet for mutasjoner: ovčar 3, SKOV 3, TOV-112d, A2780, OV90 , ES-2, TOV-21g, Caov-3, A1847, IGROV 1, OVCAR 5, 2008, OVCAR 10, PEO1 og hei. Cellepellets fra hver av disse cellelinjer ble vennligst tilveiebrakt av Drs. Charles Drescher og Beatrice Knudsen. Genomisk DNA ble isolert fra celle pellets bruker QIAamp DNA Tissue kit (Qiagen, Valencia, CA), i henhold til produsentens instruksjoner. Førti friske humane kontroller ble inkludert i denne studien. Genomisk DNA ble isolert fra perifert blod lymfocytter ved hjelp av QIAamp DNA Blood Midi kit (Qiagen, Valencia, CA), i henhold til produsentens instruksjoner. Kontrollprøver ble tatt under en godkjent institusjon vurdering styret fra University of California San Francisco.
PCR og Toveis Sekvense
PCR primere ble designet for å forsterke alle koding eksoner og intronic flankerende områder av
BRAF product: (NM_004333.2),
MEK1 plakater (NM_002755.2) og
MEK2 plakater (NM_030662.2) (tabell 4 og tabell 5). For sekvensering ble PCR-primere modifisert på 5′-enden for å inkludere M13 forover (GTAAAACGACGGCCAGT) og bakover (CAGGAAACAGCTATGACC) sekvenser. PCR og sekvensering ble utført ved Agencourt Bioscience Corporation (Beverly, MA). Toveis sekvensering ble utført med ABI BigDye v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA) i henhold til produsentens retningslinjer og kjøre på en ABI3730xl kapillær sekvense instrument (Applied Biosystems, Foster City, California).
Analyse
Sekvense data ble analysert ved hjelp av to sekvensanalyseprogrammer, PolyPhred Software v5.02 (University of Washington, Seattle, Washington) og SeqScape® programvare (Applied Biosystems, Foster City, CA) . I tillegg ble manuell gjennomgang utført med Mutation Surveyor 3,00 (SoftGenetics LLC, State College, PA). Videre evaluering av oppdagede nucleotide mutasjoner besto av Sortering Intolerant Fra Tolerant (sile; blocks.fhcrc.org/sift/SIFT.html) og screening mot kjente databaser: NCBI, kosmiske, UniProtKB /Swiss-Prot og JSNP (www.ncbi.nlm .nih.gov /SNP, www.sanger.ac.uk/genetics/CGP/cosmic/, ca.expasy.org/sprot/, snp.ims.u-tokyo.ac.jp/).
Plasmider
Menneske
MEK1
cDNA (Origene, Rockville, MD) ble klonet inn en pcDNA3 vektor med en Myc-tag ved N-terminalen.
MEK1
nt 199 G → En overgang ble innført ved hjelp av Quick-Change seterettet mutagenese (Stratagene, La Jolla, CA) og verifisert ved direkte sekvensering.
Transient transfections og Western Blot analyse
human embryonisk nyre (HEK) 293T-celler ble sådd dagen før i seks-brønners skåler og transfektert, i duplikat, med 2 ug totalt plasmid-DNA og 5 pl av Lipofectamine 2000 (Life Technologies, Carlsbad, CA) i henhold til produsentens anvisninger. Celler ble serum-sultet (0,5% føtalt bovint serum), og 24 timer senere lysert i buffer inneholdende protease og fosfatase inhibitor cocktail (Sigma, St. Louis, MO). Expression nivåer av myc-MEK, ble total ERK og fosforylert ERK analysert av Western blot. Myc (A-14) og p-ERK (E-4) ble kjøpt fra Santa Cruz Bioteknologi (Santa Cruz, California), og P44 /42 MAP kinase antistoff ble kjøpt fra Cell Signaling Technology (Danvers, MA).
bekreftelser
forfatterne takke Canary Foundation (www.canaryfoundation.org) for økonomisk og vitenskapelig støtte og legene. Ingrid Revet og William Tidyman for tenkte kommentarer og teknisk assistanse.
