Abstract
steroide anti-inflammatorisk narkotika-aktivert gen-en (NAG-1) er indusert av steroide anti-inflammatoriske medisiner og besitter proapoptotiske og antitumorigenic aktiviteter. Selv tolfenamsyre (TA) induserer apoptose i hode og nakke kreft celler, har forholdet mellom NAG-en og TA ikke fastslått. Denne studien undersøkte induksjon av apoptose i hode- og halskreft celler behandlet med TA og rollen NAG-1 uttrykk i denne induksjon. TA redusert hode og nakke kreft celle levedyktighet på en doseavhengig måte og indusert apoptose. Den induserte apoptose var sammenfallende med ekspresjon av NAG-1. Overekspresjon av NAG-en forbedret apoptotiske effekten av TA, mens undertrykkelse av NAG-1 uttrykk av små interfererende RNA svekkede TA-indusert apoptose. TA inhiberte signifikant tumordannelse, som bedømt ved xenograft-modeller, og dette resultatet i følge induksjonen av apoptotiske celler og NAG-1-ekspresjon i tumor vevsprøver. Samlet utgjør disse resultatene viser at TA induserer apoptose via NAG-1 uttrykk i hode og hals plateepitelkarsinom, noe som gir en ekstra mekanistisk forklaring på apoptotiske aktiviteten til TA
Citation. Kang SU, Shin YS, Hwang HS, Baek SJ, Lee SH, Kim CH (2012) tolfenamsyre induserer apoptose og vekst Hemming i hode- og halskreft: Involvering av NAG-1 Expression. PLoS ONE 7 (4): e34988. doi: 10,1371 /journal.pone.0034988
Redaktør: Subhash Gautam, Henry Ford Health System, USA
mottatt: 9. januar 2012; Godkjent: 08.03.2012; Publisert: 19 april 2012
Copyright: © 2012 Kang et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble støttet av Korea Research Foundation Grant (KRF-013-2009-1-E00015) og CCRB gjennom «GRRC» Project of Gyeonggi provinsmyndighetene, Korea (GRRC Ajou-2011-A03). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Med over 500 000 tilfeller på verdensbasis og en høy dødelighet, hode og nakke plateepitelkarsinom (HNSCC) er den sjette vanligste kreftformen hos menn. Selv med forbedrede behandlinger, har den totale overlevelsen vært under 50% de siste 30 årene [1]. Selv om noen pasienter oppnå langsiktig overlevelse, spesielt de diagnostisert med tidlig stadium sykdommen, de fleste pasienter med denne typen kreft har avansert sykdom på diagnosetidspunktet. Disse pasientene løpe en risiko for tilbakevendende sykdom, fjernmetastaser eller andre primære svulster, og har en median overlevelse på bare 6-8 måneder [2]
5-års overlevelse for pasienter med avansert HNSCC er rundt 30%, noe som er i det vesentlige uendret i forhold til frekvensen innspilt to tiår siden til tross for forskjellige behandlingsforsøk. Derfor forebyggende strategier er ønskelige, og mye forskning er nå viet til chemoprevention som tar sikte på å forebygge progresjon HNSCC på et tidlig stadium. Men som chemopreventive agenter er den sikreste og mest effektive mot HNSCC fortsatt uklart. Det er av klinisk betydning for å undersøke effekten av ikke-steroide antiinflammatoriske midler (NSAIDs) som chemopreventive agenter.
chemopreventive agenter spille en viktig rolle i å avbryte kreftfremkallende prosessen og hemme gjentakelse av forstadier til kreft. I dag er den farmasøytiske legemidler som har vært mest etterforsket som chemopreventive agenter er NSAIDs. NSAIDs er blitt klinisk anvendt som kjemopreventive midler for familiær adenomatøs polypose, med den virkningsmekanisme som hemming av cyklooksygenase-2 (COX-2) [3], [4]. Imidlertid kjemopreventive og antitumorigenic aktiviteter NSAIDs er også blitt observert i COX-2-manglende celler, noe som indikerer at NSAID også utøve deres anticancer virkning ved en annen mekanisme enn COX-2-undertrykkelse. En slik mekanisme involverer induksjon av NSAID-aktivert gen-1 (NAG-1) [5].
NAG-1 ble identifisert fra indometacin (en COX-inhibitor) -indusert genbibliotek [5]. NAG-1 er et medlem av den transformerende vekstfaktor-beta (TGF-β) superfamilien, og er også kjent som makrofag inhiberende cytokin-1 (MIC-1), vekstdifferensieringsfaktor 15 (GDF15), og prostata avledet faktor (PDF) [6], [7], [8]. Renset rekombinant NAG-en er i stand til å inhibere lipopolysakkarid-fremkalt tumor nekrose faktor-alfa (TNF-α) produksjon i makrofager, noe som tyder på at NAG-1 virker som en autokrin regulatorisk molekyl [9].
In vitro Hotell og
in vivo
, NAG-en har anti-tumorigen og pro-apoptotiske aktiviteter uavhengig av COX-hemming [5], [10]. NSAIDs og flere antitumorigenic forbindelser med chemopreventive aktiviteter, inkludert resveratrol, genistein, katekiner, og peroksisomproliferatoraktiverende aktivert reseptor
γ
ligander, regulere NAG-1 uttrykk i en prostaglandin-uavhengig måte [11], [12] [13], [14], [15].
Men inntil nå, forholdet, hvis noen, mellom NAG-en og TA i HNSCC er ikke undersøkt. Pro-apoptotiske aktivitet av NAG-1 kan tilveiebringe en molekylær basis for å forklare Kjemopreventivt middel, TA-mediert antitumorigenesis.
I denne studien undersøkte vi regulering av NAG-1-ekspresjonen i løpet av TA-indusert apoptose i celler HNSCC . NAG-en liten interfering RNA (siRNA) -mediert hemming av NAG-1 uttrykk svekket TA-indusert apoptose. Videre ble
in vivo
antitumorigenic aktiviteten til TA i mus undersøkt for å vurdere bruken av TA som en chemopreventive agent i HNSCC. Dataene tyder på at induksjon av NAG-en kan gi en ny mekanisme for å forstå nedstrøms effektbokser for TA-indusert apoptose i HNSCC.
Materialer og metoder
Cellelinjer og reagenser
Fire etablerte menneske hode og nakke kreft cellelinjer – KB (en muntlig kreft cellelinje), SCCQLL1 (en muntlig kreft cellelinje), HN3 (en strupekreft cellelinje), og Fadu (en hypopharyngeal kreftcellelinje) – ble oppnådd fra American Type Culture Collection (Manassas, Virginia) og koreansk cellelinje Bank (Seoul, Korea). Cellene ble dyrket i Dulbeccos modifiserte Eagles medium med 10% føtalt bovint serum og penicillin-streptomycin ved 100 U /ml (Gibco, Carlsbad, CA) ved 37 ° C i en fuktet atmosfære med 5% CO
2 og 95% luft. TA, diclofenac, sulindac sulfid, indometacin, piroxicam og (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) ble oppløst i Autoclaved vann som stamoppløsning for
in vitro
studier. For å undersøke effekten av TA på normale celler, vi brukte HaCaT celler (normale keratinocytter) som ble innhentet fra koreanske cellelinje Bank (Seoul, Korea).
Celleproliferering analysen
Celleviabilitet var testet ved anvendelse av en analyse basert på omdannelsen av 3- (4,5-dimetyltiazol-2-yl) -2,5-difenyl-tetrazolium-bromid (MTT; Sigma Aldrich). MTT-løsning ble tilsatt til 40 ul av cellesuspensjonen i 4 timer. Etter tre vaskinger med fosfat-bufret saltvann (PBS, pH 7,4), ble det uoppløselige formazanprodukt oppløst i 100 ul dimetylsulfoksid. Optisk tetthet (OD) ble målt for hver kultur brønn med en mikroplateleser (Bio-Tek, Winooski, VT) ved 540 nm. OD av kontrollceller ble tatt som 100% levedyktighet.
Terminal deoksynukleotidyltransferase-mediert dUTP-biotin nick ende merking (tunel) assay
DNA-fragmentering ble analysert med
in situ
celledød deteksjon kit (Roche Molecular Biochemicals, Basel, Sveits), i henhold til produsentens instruksjoner. De fargede celler ble analysert under et fluorescens mikroskop (Carl Zeiss, Oberkochen, Tyskland).
Strømningscytometri påvisning av apoptose
Apoptose ble påvist ved hjelp av Annexin V-fluorescein isotiocyanat (FITC) apoptose deteksjon kit (BD Biosciences, Bedford, MA). I korthet ble cellene sådd ut i 6-brønners kulturskåler og inkubert med 0, 10, 20, og 40 uM TA i 24 timer. Cellene ble høstet, vasket med PBS, og farget med Annexin V-FITC og propidiumjodid (PI). Tidlig og sent apoptose ble kvantifisert i henhold til produsentens instruksjoner. Apoptose ble påvist ved hjelp av en FACS Canto system (BD Biosciences, Bedford, MA), med eksitasjon og utslipps innstillingene for 488 og 530 nm, henholdsvis.
mitokondriemembranen potensial (MMP) assay
MMP av intakte celler ble målt ved flowcytometri med den lipofile kationiske sonde 5,5 V, 6,6 V-tetraklor-1,1 V 3,3 V-tetra ethylbenzimidazolcarbocyanine jodid (JC-1; Molecular Probes, Eugene, OR). Dyrkningsmediet ble raskt fjernet fra adherente KB-cellene, og cellene ble skylt med PBS. Cellemonolagene ble inkubert med DMEM og 5 ug /ml JC-1 ved 33 ° C i 20 min. Cellene ble deretter vasket to ganger med kald PBS og trypsinisert. Cellepelletene ble deretter resuspendert i 500 ul PBS. Endringen i MMP ble målt ved flowcytometri (BD Biosciences) og fluorescens mikroskopi på 72 timer etter bestråling.
Transfectiom av NAG-en cDNA og RNA interferens (RNAi)
Alle transfeksjon eksperimenter var utført ved anvendelse av Lipofectamine 2000 reagens (Invitrogen, Carlsbad, CA) ifølge produsentens instruksjoner, slik som beskrevet tidligere [5]. Etter inkubering i 24 timer ble mediet fjernet og cellene ble vasket med PBS og behandlet med enten TA eller vehikkel i 24 timer. NAG-1 cDNA ble tidligere beskrevet [5]. siRNA for kontroll og NAG-en (sans CUCAGUUGUCCUGCCCUGUdTdT og antisense ACAGGGCAGGACAACUGAGdTdT) ble kjøpt fra Invitrogen.
Western blot analyse
Celler ble vasket med kald PBS og suspendert i RIPA buffer (Sigma-Aldrich) supplert med PhosSTOP og komplett mini EDTA-fri (Roche Molecular Biochemicals, Basel, Sveits). Proteinene fra KB-celler ble elektrooverført til Immobilon-P-membran (Millipore, Bedford, MA). Påvisning av spesifikke proteiner ble gjennomført med en forbedret chemiluminescence Western blotting kit i henhold til produsentens instruksjoner.
Animal studie
KB-celler (1 x 10
6) re-suspendert i PBS ble administrert subkutant i den nederste høyre flanke av hver BALB /c nu /nu mus. Etter en uke, når tumorene nådde ca 100 mm i diameter, ble musene tilfeldig delt inn i to grupper (n = 10 per gruppe), og behandling ble igangsatt. Behandlingen ble startet dagen etter implantasjon cellen enten med intraperitoneal injeksjon av TA (25 mg /kg) daglig (behandlingsgrupper) eller saltløsning alene (kontrollgruppe). Tumorer ble målt med en glidende passeren en gang i 2 dager, og volumene (mm
3) ble beregnet i henhold til formelen V = A x B
2 x 0,52, hvor A er den største overfladisk diameter og B er den minste overfladisk diameter [16]. Dyrene ble avlivet og tumorene ble samlet opp og veiet 17 dager etter implantasjon. Halvparten av vevet ble hurtigfrosset i flytende nitrogen og anvendt for proteinekstraksjon. Den andre halvparten ble fiksert over natten i nøytral bufret formalin og bearbeidet ved rutinemetoder. Western blotting av NAG-en ble utført på kreftprøver og normale prøver bløtvev. Denne studien ble godkjent av komiteen for etikk i dyreforsøk av Ajou University School of Medicine.
Statistiske analyser
Hvor data ble hentet fra tre uavhengige eksperimenter, parametrene ble uttrykt som gjennomsnitt ± SD. Sammenligning av gjennomsnittet for forskjellige grupper ble gjort ved hjelp av en enveis variansanalyse. Student-Newman-Keuls test ble brukt for parvise sammenligninger av resultater funnet å være av betydning ved gjentatte målinger av ANOVA. Statistisk signifikans ble utledes på
p
. 0,05
Resultater
Induksjon av NAG-en og apoptose i HNSCC cellene ved ulike NSAIDs
For å undersøke virkningen av NSAID på veksten av HNSCC-celler, ble de fire valgte HNSCC-cellelinjer ble inkubert med varierende konsentrasjoner (0, 5, 10, 30, 50, 70, 100, 150 og 200 uM) av TA i 16 timer og celle Levedyktigheten ble målt ved MTT-analyse. Som vist på fig. 1, ulike NSAID’er redusert cellelevedyktighet på en doseavhengig måte (fig. 1A) og TA betydelig redusert levedyktighet av HNSCC cellelinjer (Fig. 1B). Spesielt, TA var de mest potent induser både apoptose og NAG-1-ekspresjon (fig. 1 og 2), og ble valgt for videre forskning. Neste, for å undersøke de toksiske effektene av TA på normale celler, utførte vi celleproliferasjonsanalyse i HaCaT celler (normale keratinocytter). HaCaT-celler ble behandlet med TA i 16 timer ved de angitte konsentrasjoner (0, 5, 10, 30, 50, 70, 100, 150, 200 um). Den relative levedyktighet av HaCaT-celler ble undersøkt ved anvendelse av MTT-analysen (fig. 1C). TA var minimalt cytotoksisk på HaCaT opptil 100 mikrometer, men TA var signifikant cytotoksisk på cellene ved høye konsentrasjoner.
Resultatene av spredning analysen. Celler ble sådd ut i 96-brønners vevkulturplater ved 1000 celler /brønn i et sluttvolum på 100 ul medium og fikk feste seg i 2 dager. Cellene ble deretter behandlet en gang med varierende doser av TA i 24 timer. Celle proliferasjon ble bedømt ved MTT-assay. Verdier representerer gjennomsnitt ± S.D. fra fem uavhengige forsøk. *
p
0,05; **
p
0,01, sammenlignet med kontrollgruppen. (A) KB hode- og halskreft cellelinje ble behandlet med NSAIDs. (B) Cytotoksisitet av TA på ulike HNSCC celler. (C) Cytotoksisitet av TA på normale keratinocytt celler (HaCaT)
(A) NAG-1 uttrykk ble indusert av NSAIDs i følgende rekkefølge:. TA, indometacin, sulindak sulfid, diklofenak og piroksikam . Ekspresjon av NAG-1 ble målt ved Western blot-analyse og normalisert til nivået av a-tubulin uttrykk. (B) Induksjon av NAG-1 uttrykk i ulike hode- og nakkekreft cellelinjer ved TA. (C og D) TA dose- og tidsavhengig øker NAG-1-proteinnivåer i KB-celler. KB-celler ble behandlet med 0, 10, 30, og 40 uM TA i 24 timer. Ekspresjon av NAG-1 ble målt ved Western blot-analyse og α-tubulin ble anvendt som kontroll lasting. Det samme membran ble strippet og re-undersøkt med kløyvde PARP og kløyvet caspase-3-antistoff.
For å utforske forholdet mellom NSAID-indusert apoptose og NAG-1 uttrykk, HNSCC celler ble behandlet med ulike konsentrasjoner av NSAID og proteinnivåer av NAG-1 ble målt ved Western blot-analyse. Som vist på fig. 2, forskjellige NSAID-indusert ekspresjon av NAG-1-proteinet i KB-celler (Fig. 2A) og TA induserte ekspresjon av NAG-1 i forskjellige HNSCC-celler (Fig. 2B). TA også indusert ekspresjon av NAG-1 protein i dose og tidsavhengige manerer (fig. 2C og 2D). Når cellene ble behandlet med 40 pM av TA i forskjellige tidsrom, ble induksjon av NAG-1-proteinet som ses etter 3 timer i KB-celler (Fig. 2D). Den samme membran ble strippet og re-probet for spaltede poly (ADP-ribose) polymerase (PARP) og spaltet caspase-3, som også ble indusert av TA (fig. 2C og 2D). Samlet disse resultatene tyder på at TA-indusert apoptotisk celledød og cellevekstarrest i HNSCC-cellelinjer blir sannsynligvis formidlet av ekspresjon av de pro-apoptotiske protein NAG-1. For å avgjøre om TA-indusert celledød var ved apoptose, vi utførte fluorescens-aktivert celle sortering (FACS) med Annexin-V /PI farging og TUNEL analysen. Som vist på fig. 3, Annexin V-FITC-positive celler ble også øket ved TA behandling i KB-celler (fig. 3A) og TUNEL-positive celler ved TA økte på en doseavhengig måte (0, 10, 20, og 40 uM) i KB -celler (fig. 3B). MMP kan anvendes som en indeks av mitokondriell poreåpning, som er en indikator av mitokondriell dysfunksjon. Kvantitativ analyse av røde og grønne fluorescerende signaler fra intracellulære JC-1 dye gjenspeiler graden av mitokondrieskade. Derfor, undersøkte vi effekten av TA på MMP i KB-cellene for å fastslå om tap av MMP kan spille en rolle i TA-indusert apoptose. Som vist på fig. 3C, en høy MMP ble opprettholdt i kontrollceller, som indikert av den overveiende røde fluorescensen av JC-1 fargestoff. Imidlertid TA behandlingen økte den grønne celle fluorescens indikerer et tap av MMP og mitokondriell skade (fig. 3C).
(A) For strømningscytometrisk påvisning av apoptotiske celler, ble cellene sådd ut i 6-brønners kulturskåler og inkubert med 0, 10, 20, 30 og 40 uM TA i 24 timer. Cellene ble høstet og vasket med PBS og så farget med Annexin V-FITC og propidiumjodid (PI). Tidlig og sent apoptose ble kvantifisert. Data er gjennomsnittsverdier innhentet fra tre uavhengige eksperimenter og stolper representerer standardavvik. (B) Resultater av TUNEL analyse. Apoptose i KB-celler ble bestemt ved TUNEL-metoden ved bruk av en in situ-celle deteksjon kit. Celler ble behandlet med indikerte konsentrasjoner av TA i 24 timer. TUNEL farging ble økt i apoptotisk celledød. Venstre, 4 «, 6-diamidino-2-fenylindol (DAPI); midten TUNEL; rett, flette. Målestokk betegner 50 mikrometer. (C) Virkningen av TA på mitokondrie apoptotiske reaksjonsvei. Etter påføring av 10, 20, 30, og 40 uM TA i 24 timer, JC-1 fluorescens forskjøvet fra rødt-orange til grønn, noe som indikerer depolarisering av mitokondriemembranpotensialet (MMP). MMP endringen ble objektivt målt ved hjelp av flowcytometri. Dataene representerer gjennomsnittet ± SD fra tre uavhengige eksperimenter. *,
P
0,05; **
P
0,01; ***,
P
0.001 sammenlignet med kontrollgruppen
Overuttrykte og undertrykkelse av NAG-en fremmer og demper TA-indusert apoptose, henholdsvis
Deretter forsøkte vi å avklare betydningen av NAG-en oppregulering i TA-indusert apoptose. Human NAG-1 cDNA ble transfektert inn i KB-celler. NAG-en overekspresjon forårsaket økt caspase-3 cleavage og spaltet PARP, og behandling av KB /NAG-en med 40 mikrometer TA ytterligere forbedret både kløyvde caspase-3 og spaltet PARP, sammenlignet med TA-behandlede kontrollceller (fig. 4A). Parallelt med økt caspase-3, KB /NAG-1-celler markert øket typiske morfologiske egenskaper av apoptose, inkludert Annexin V-positive og TUNEL-positiv celle flekker, sammenlignet med kontrollceller. Denne effekten ble ytterligere øket ved behandling TA (fig. 4B og 4C). Vi undersøkte om undertrykkelse av NAG-1 uttrykk kan modulere TA-indusert apoptose. KB-celler transfektert med enten NAG-1 siRNA eller kontroll siRNA ble behandlet med eller uten 30 mM TA i 24 timer. Immunoblot-analyse viste at transfeksjon av siRNA mot NAG-1 undertrykket ekspresjon av NAG-1, spaltet PARP og spaltet caspase-3, i nærvær av TA, sammenlignet med kontroll transfekterte celler (Fig. 5A). Under disse betingelser, TA-mediert Annexin V-positive og TUNEL-positive celler ble betydelig svekket i celler transfektert med NAG-1 siRNA (fig. 5B og 5C). Tatt sammen tyder disse resultater på at NAG-1 spiller en rolle i apoptose og at inhibering av NAG-1 i KB-celler påvirke TA-indusert apoptose. Disse resultatene tyder på at TA-indusert NAG-1 oppregulering kan være en av de underliggende mekanismer som bidrar til TA-indusert apoptose.
KB /NAG-1 og KB /vektor-celler ble behandlet med 30 uM TA i 24 timer, og apoptose ble analysert ved hjelp av en TUNEL-analyse og ved hjelp av FACS med annexin V-FITC /PI. (A) Western Blot. Like mengder cellelysater (30 ug) ble løst ved natriumdodecylsulfat-polyakrylamid-gel-elektroforese (SDS-PAGE), overført til nitrocellulosemembran og probet med anti-NAG-1, PARP, spaltet caspase-3, eller α-tubulin antistoff. (B og C) apoptose i KB-celler ble bestemt ved TUNEL-metoden og FACS med AnnexinV-FITC /PI, som beskrevet i fig. 3. Data er gjennomsnittsverdier innhentet fra tre uavhengige eksperimenter og stolper representerer standardavvik. Målestokken betegner 50 um.
KB-celler transfektert med enten den indikerte NAG-1 siRNA eller negative kontroll siRNA ble behandlet med eller uten 30 mM TA i 24 timer. Apoptose ble analysert ved TUNEL-analysen og ved hjelp av FACS med AnnexinV-FITC /PI. (A) Western Blot. Like mengder cellelysater (30 ug) ble oppløst ved SDS-PAGE, overført til nitrocellulosemembran og probet med anti-NAG-1, PARP, spaltet caspase-3, orαα-tubulin. (B og C) apoptose i KB-celler ble bestemt ved TUNEL-metoden og FACS med AnnexinV-FITC /PI, som beskrevet i fig. 3. Data er gjennomsnittsverdier innhentet fra tre uavhengige eksperimenter og stolper representerer standardavvik. Målestokk betegner 50 mikrometer.
Effekt av TA på tumorigenicity og apoptose i BALB /c nu /nu mus
For å avgjøre om de nevnte resultatene var tydelig
in vivo
brukte vi BALB /c nu /nu mus og tilfeldig delt likt dem inn i kontrollgruppen og behandling (25 mg /kg TA) gruppe etter tumordannelse (ca. 100 mm i diameter). Alle mus overlevde hele forsøksperioden. Administrasjon av TA påvirket tumordannelse og utvikling signifikant (
p
0,05; Fig. 6A og 6B). Det var imidlertid ingen signifikant forskjell mellom de to grupper i kroppsvekt. TUNEL-farging viste at TA betydelig økt antall av TUNEL-positive celler (Fig. 6C). For å undersøke nivået av NAG-1 i tumorene, Western blotting av NAG-1-ekspresjon på tumorprøvestykker av BALB /c nu /nu-mus ble utført. Sterk induksjon av
in vivo
NAG-1 uttrykk i proteiner som ble hentet fra svulster i TA-behandlede mus var tydelig, sammenlignet med kontroll mus. (Fig. 6D) Dataene viser at TA øker ekspresjonen av NAG-1 i tumorer og at den induserte NAG-en undertrykker av størrelsen av svulster.
(A) BALB /c nu /nu-mus ble tilfeldig delt i to like grupper (kontroll og 25 mg /kg) etter injeksjon av KB-celler. Etter tumordannelse (omkring 100 mm i diameter), behandling ble startet med intraperitoneal injeksjon av enten TA (25 mg /kg) daglig (behandlingsgrupper) eller et like stort volum av saltløsning alene (kontrollgruppe). Dyrene ble avlivet og tumorene ble samlet opp og veiet 17 dager etter implantasjon. (B) Diagram av volumet og vekten av tumorer. (C) TUNEL-farging i kontroll- og behandlingsgrupper. Målestokk betegner 50 mikrometer. (D) NAG-1 uttrykk i implantert KB svulster. Induksjon av NAG-en med TA er i forhold til hver kontroll.
Diskusjoner
NSAIDs hemmer COX-avhengige syntesen av prostaglandiner som formidler inflammatoriske responser i flere vev [3], [ ,,,0],4], [5]. NSAIDs også indusere celleveksthemming, apoptose, og antiangiogenesis; aktivering av de som er involvert i disse effektene reaksjonsveier er kritisk for de rapporterte anticarcinogenic aktivitetene av NSAID og beslektede COX-2-hemmere, for eksempel celecoxib [17], [18], [19], [20], [21]. Omfattende epidemiologiske studier av den rolle NSAIDs i forebygging og behandling av kreft i tykktarmen har gitt bevis for at anvendelsen av NSAIDer, slik som aspirin og noen COX-2-hemmere, er assosiert med en reduksjon i forekomsten og /eller dødelighet av tykktarmskreft [22], [23], [24].
Nylig ble det rapportert at NSAID har andre mål i tillegg til COX-2. Han et al [25]. rapportert at peroxysome spredning aktiverende reseptor delta (PPARδ) er også en adenomatøs polypose coli (APC) -regulated mål av NSAIDs. I tillegg kan NSAID metabolitter undertrykke nukleær faktor-kB (NF-kB) overlevelse signal via I kB-kinase α (IκKα) hemming [26]. Dette foreslår at NSAID hemme tumorvekst via COX-avhengige og-Uavhengig trasé.
TA er et potent, godt tolerert NSAID med en lav mage bivirkning og høy terapeutisk indeks, sammenlignet med andre NSAID [27] . Det har febernedsettende og smertestillende aktiviteter som gjenspeiles i flere dyremodeller, og har vist lovende resultater i langtidsbehandling av artrose, reumatoid artritt og migrene [27]. TA påvirker også apoptose i kolorektal kreft celler, samt metastaser og tumordannelse i bukspyttkjertelkreft modeller [28] [29], [30].
spesifisitet protein 1 (SP1) nedbrytning av TA hemmer flere kreftcellelinjer inkludert kreft i bukspyttkjertelen celler [28], [29]. Således kan Sp1 være en annen mulig molekylære mål for TA-indusert apoptose. TA reduserte også flere Sp-avhengige gener og proteiner så som vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF), VEGFR1, Survivin, cyklin D1, og bcl-2, og disse reaksjoner bidrar til deres antikreft-aktivitet [31]. Nylig, Kim et al. viste at COX-1 og COX-2-proteiner ikke ble endret av TA og TA som induserte hemming av cellevekst skjedde i en COX-uavhengig måte i KB HNSCC-celler [32].
Til tross for disse fremskritt i kjenner til, er molekylære mekanismen av TA på antitumorigenesis i HNSCC er ikke klart. Det er sannsynlig at flere mekanismer er operative. Effektene av TA på veksten av KB-humane kreftceller og mekanismen bak disse effektene ble for tiden undersøkt.
I denne studien demonstrerte vi at NSAID induserer NAG-1-ekspresjon og apoptose i HNSCC-celler, og at TA er den mest potente NSAID av dem som ble testet. Selv om induksjon av apoptose av NSAIDs er blitt observert i en rekke kreftceller [10], [11], [33], [34], [35], den spesielle NSAID som forårsaker maksimal induksjon av NAG-1-ekspresjon er avhengig av typen av kreftcelle. For eksempel er sulindak sulfid den mest potente NAG-en induktor i kolorektal kreft og indometacin er den mest potente i sinonasal kreft [5], [10], [36] Disse forskjellene er trolig knyttet til den komplekse regulering av NAG-1 uttrykk , som innebærer både transkripsjonen og posttranskripsjonelt mekanismer. Videre synes sitt uttrykk til å involvere cis- og trans-virkende promotorelementer, forskjellige transkripsjonsfaktorer, og flere antitumorigenic stoffer [37]. NAG-1 er også en nedstrøms mål for de ulike p53, ERG-1 og AKT /GSK-3 tumor undertrykke trasé [12], [13], [14], [38], [39], [40], [ ,,,0],41]. Således er mekanismen av NAG-en regulering er avhengig av celletype og modusen for induksjon. Videre studier på induksjon av NAG-en med TA i HNSCC cellene er nødvendig.
Den nåværende data viser at NAG-en er en av de viktigste regulatorer for TA-indusert apoptose. TA hemmet veksten av KB-celler (Fig. 1). En høyere konsentrasjon av TA (100 mm) resulterte i mer enn 70% celledød, med celler løsner og rundet opp innen 24 timer etter behandling.
I tillegg TA indusert apoptose som gjenspeiles av den økte sub -G1 befolkning, nukleosomale fragmentering (data ikke vist), og spaltet PARP (fig. 2), noe som tyder på at apoptose bidrar til de inhiberende virkninger av TA på levedyktigheten av KB-celler. Disse resultatene er enig med tidligere rapporter om at TA induserer PARP spalting i kolorektal kreft celler [30] og kreft i bukspyttkjertelen celler [28].
mitokondriell skade manifesterer som en innledende hyperpolarization, etterfulgt av et tap av mitokondrie membran potensial og utgivelsen av proteiner fra mitokondrie intermembrane plass, for eksempel cytokrom c. Direkte og indirekte endringen av mitokondriene kan aktivere apoptotiske sti. TA vesentlig indusert tap av MMP (fig. 3), noe som tyder på at mitokondriell skade er involvert i TA-indusert apoptose.
NAG-en ble indusert ved TA i en dose- og tidsavhengig måte (fig. 2), og overekspresjon av NAG-en forsterket apoptotisk virkning av TA (fig. 4). Videre siRNA-mediert knockdown av NAG-en, svekkede TA-indusert apoptose (Fig. 5), noe som tyder på at NAG-1 uttrykk er nært forbundet med apoptose.
in vivo
anticarcinogenic aktivitet av TA ble undersøkt i atymiske nakne mus med KB-celler som xenotransplantater. Ved en dose på 25 mg /kg /dag, TA i betydelig grad hemmet tumorvekst og vekt og økt TUNEL positiv farging celler (apoptose) i tumorsnitt fra behandlede versus kontrolldyrene. Dette ble ledsaget av øket NAG-en farging i tumorer fra behandlede mus (Fig. 6). Kliniske studier med TA for kronisk behandling av reumatoid artritt har brukt doser på TA så høyt som 10 mg /kg /dag, som er bare 2,5 ganger lavere enn dosen som er nødvendig for inhibering av HNSCC tumorvekst i en xenograft musemodell. Disse resultatene viser at TA er et meget effektivt anticancermiddel i både
in vitro
og
in vivo-modeller av
HNSCC, og utfyller tidligere resultater [29], [31], [32]. Virkningsmekanismen av TA som en tumorvekst inhibitor skyldes delvis til induksjon av NAG-en og NAG-en-relaterte gener.
Koblingen mellom NAG-en induksjon og TA avdekket i denne studien gir en ny molekylær mekanisme som kan bidra til anti-tumorigen aktiviteter TA i HNSCC.
