Abstract
Bakgrunn
Nye bevis knytter avvikende aktivering av Hedgehog (Hh) signaliserte med patogenesen av flere cancere så som medulloblastom, basalcelle, småcellet lunge, bukspyttkjertel, prostata og ovarie. Denne undersøkelsen ble utformet for å bestemme om hemming av denne veien kan hemme serøs kreft vekst eggstokkreft.
Metodikk
Vi utnyttet en
in vivo
preklinisk modell av serøs eggstokkreft å karakterisere anti-tumor aktivitet av Hh pathway hemmere cyclopamine og en klinisk relevant derivat, IPI-926. Primær menneskelig serøs ovarian tumor vev ble brukt til å generere tumorxenotransplantater i mus som senere ble behandlet med cyclopamine eller IPI-926.
hovedfunnene
Begge forbindelser viste betydelige anti-tumor aktivitet som enkle midler . Når IPI-926 ble anvendt i kombinasjon med paklitaxel og carboplatinum (T /C) ble ingen synergistisk effekt observert, men vedvarende behandling med IPI-926 etter opphør av T /C fortsatte å undertrykke tumorvekst. Hh pathway aktivitet ble analysert ved RT-PCR for å vurdere endringer i
Gli1
transkripsjonsnivåer. En enkelt dose av IPI-926 hemmet mus stromal
Gli1
transkripsjonsnivåer på 24 timer med uendret menneske intra-tumor
Gli1
nivåer. Kronisk IPI-926 behandling i 21 dager, men hemmet Hh signalisering i både mus stromale og humane tumorceller. Expression data fra mikro dissekert stroma i humane serøs ovarietumorer bekreftet tilstedeværelsen av
Gli1
transkripsjon og en signifikant sammenheng mellom forhøyede
Gli1
transkripsjonsnivåer og dårligere overlevelse.
konklusjoner /Betydning
IPI-926 behandling hemmer serøs tumorvekst tyder på Hh signalveien bidrar til patogenesen av eggstokkreft, og kan holde løftet som en roman terapeutisk mål, spesielt i vedlikehold innstillingen.
Citation: McCann CK, Growdon WB, Kulkarni-DATAR K, Curley MD, Friel AM, Proctor JL, et al. (2011) Hemming av Hedgehog Signa fiendskap Serous Eggstokkreft Vekst i en Primær Xenotransplantat Model. PLoS ONE 6 (11): e28077. doi: 10,1371 /journal.pone.0028077
Redaktør: Sandra Orsulic, Cedars-Sinai Medical Center, USA
mottatt: 24 juni 2011; Godkjent: 31 oktober 2011; Publisert: 29.11.2011
Copyright: © 2011 McCann et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne forskningen ble finansiert med tilskudd fra Ovarian Cancer Research Fund (BRR), Advanced Medical Research Foundation (BRR), og Vincent Memorial forskningsmidler (BRR). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:. Jennifer L. Proctor, Hana Sheikh, Igor Deyneko, Jeanne A. Ferguson, og John R. MacDougall er ansatte i Infinity Pharmaceuticals. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
I USA, er eggstokkreft anslått å plage ca 22 000 kvinner og forårsake nesten 14.000 dødsfall årlig. Levetiden risiko for å utvikle kreft i eggstokkene er en i 70 og det er det femte mest dødelige kreft hos kvinner [1]. De fleste ovarian kreftpasienter stede med sent stadium sykdom som er behandlet med kirurgisk debulking og platinumbasert kjemoterapi. Selv om 70-80% av kvinnene oppnå en fullstendig klinisk respons, vil et flertall av disse pasientene utvikler tilbakevendende sykdom som er ofte kjemoresistent. Novel behandlingsmetoder benytte konvensjonelle cytotoksiske terapi i kombinasjon med molekylært målrettet terapi rettet mot spesifikke signalveier som kreves for tumorutvikling og progresjon potensielt holde løftet som strategier for varig behandling av primær og tilbakevendende eggstokkreft [2].
The Hedgehog (Hh) signaltransduksjonsbane omfatter en familie av høyt konserverte proteiner som først og fremst opptrer i løpet av embryogenesen for å regulere stamcelle skjebne og organogenese, og fremmer proliferasjon, differensiering og regenerering av somatiske vev i den voksne [3]. Lappet 1 (Ptch1), en membran reseptor hemmer normalt membranprotein glattes (Smo) fra aktivere Gli1. Bindingen av Hh-ligand (Sonic, Indian eller Desert) for å Ptch1 opphever dets undertrykkende virkning på SMO tillater translokasjon av Gli1 til kjernen hvor den induserer ekspresjon av målgener [4], [5]. Avvikende aktivering av Hh reaksjonsveien i voksen alder har blitt assosiert med utvikling av malign transformasjon i en rekke humane cancere [4], [6], [7], [8], [9], [10], [11] , [12]. I tillegg har tumor initiering av cellene i noen kreftformer blitt vist å være avhengig av vedvarende Hh indusert signalering og påfølgende aktivering av Gli1 som følge av ligand over-ekspresjon eller mutasjoner aktivering av Hh veien [6], [13]. Behandlingsregimer med Hh pathway antagonister i kombinasjon med konvensjonelle molekylære og cytotoksiske behandlinger har vist
in vitro Hotell og
in vivo
aktivitet mot spredning i medulloblastoma, basal cell, bryst, småcellet, prostata og kreft i bukspyttkjertelen modeller [10], [11], [12], [14], [15], [16], [17]. Disse antagonister er for tiden i fase I og fase II kliniske studier.
Aktivering av Hh veien har blitt dokumentert i eggstokkreft som en mulig mekanisme involvert i neoplasi. Altered gen og protein uttrykk for HH pathway medlemmer Gli1, SMO, Ptch1, Desert pinnsvin (DHH) og Sonic pinnsvin (Shh) i eggstokkreft har blitt rapportert, men den eksakte forekomsten og mønster gjenstår å avklares [18], [19 ], [20], [21]. Mens mange studier tyder på at 50-60% av invasive ovarietumorer åpenbar Hh bane aktivering, har andre forskere hevdet at menings aktivering via endret ekspresjon av multiple spredningsveier proteiner forekommer i løpet av mindre enn 20% av kliniske prøver testet [19], [20]. Selv om en direkte sammenheng mellom ekspresjonen av DHH og klinisk stadium, histologisk subtype eller overlevelse er blitt rapportert, er det for tiden uklart hvorvidt ekspresjon av det DHH liganden er forbundet med redusert overlevelse [20]. Andre analyser av ovarialcancer prøvene har antydet at forhøyede Gli1 protein uttrykk er en selvstendig faktor assosiert med redusert overlevelse ved justering for alder, stadium, klasse og histologisk type [18].
In vitro
og begrenset
in vivo
studier gir holdepunkter for at Hh signalveien spiller en viktig rolle i eggstokkreft celleproliferasjon. Shh ble påvist i en rekke ovarie cancer cellelinjer og tilsetning av et monoklonalt antistoff mot shh resulterte i en doseavhengig reduksjon i celleformering [21]. Tilsvarende behandling av dyrkede eggstokkreft celler med den Smo inhibitor cyclopamine har blitt funnet å indusere cellesyklusarrest i G1 og fremme apoptose [20]. Videre ektopisk uttrykk for Gli1 i eggstokkreft celler resulterte i økt celleproliferasjon, mobilitet og invasive egenskaper [18]. Ovarie carcinoma cellelinje avledet xenotransplantater er også utsatt for Hh pathway hemming som deres vekst blir alvorlig forringet etter behandling med cyclopamine [21]. Flertallet av tilgjengelige data antyder at en aktivert Hh signalkaskade kan være en potensiell føreren av neoplasia i en signifikant andel av epitelial ovariekreft noe som gjør det til et attraktivt mål for terapeutisk inhibering.
Vi har utforsket denne muligheten ved hjelp av Hh pathway inhibitor IPI-926, et derivat av cyclopamine med økt oral biotilgjengelighet og en lengre halveringstid [22]. IPI-926 motvirker den Hh veien ved å hemme Smo. IPI-926 induserer en doseavhengig reduksjon i
Gli1
mRNA uttrykk og holdbar svulst remisjon i en murine medulloblastoma modell [22]. Selv om IPI-926 hadde ingen virkning som et enkelt middel i en musemodell av småcellet lungekreft før kjemoterapi, dyr behandlet med IPI-926 etter kjemoterapi utviste en dramatisk inhibering i tumorgjenveksten [22]. Gitt disse pre-kliniske data, søkte vi å bestemme hvorvidt inhibering av Hh veien ved cyclopamine eller IPI-926 hadde en effekt på veksten av humane papillære serøse eggstokkreft xenotransplantater avledet fra primære humane vev erholdt ved tidspunktet for innledende kirurgi. Vi vurderte deretter anti-tumor aktivitet av IPI-926 i vår xenograft modell i kombinasjon med paclitaxel og carboplatinum og som monoterapi vedlikeholdsbehandling. Til slutt, ble effekten av en enkelt dose, og forlenget IPI-926-behandling på Hh sti aktivitet bestemmes både i stromale og tumorcellepopulasjoner. Våre resultater støtter hypotesen om at Hh signalveien bidrar til patogenesen av serøs eggstokkreft og hemming av denne veien kan ha terapeutisk effekt.
Materialer og metoder
Immunhistokjemisk analyse
En eggstokkreft vev microarray (T8235725, Biochain, Hayward, CA) bestående av 64 godartede og ondartede eggstokkene humane tumorer ble brukt til immunhistokjemisk analyse av Hysj protein uttrykk. Antigen gjenfinning ble utført i citrat-buffer target gjenfinning ved hjelp av en trykkoker i 40 minutter, og delene ble behandlet med 3% hydrogenperoksyd og inkubert i bakgrunn Sniper (Biocare, Concord, CA) for å blokkere en hvilken som helst ikke-spesifikk binding. Inkubasjon av delene med anti-Shh monoklonalt antistoff ab53281 (Abcam, Cambridge, MA) fortynnet 1:2000 i DaVinci Grønn fortynningsmiddel (Biocare Medical, Concord, CA) ble utført ved romtemperatur i 90 minutter. Snittene ble deretter inkubert med kanin på gnager polymersystem (Biocare Medical, Concord, CA) i 45 minutter ved romtemperatur. Glassene ble deretter behandlet med 3, 3′-diaminobenzidin chromagen (DAB) i 5 minutter for visualisering. Seksjonene ble deretter kontra med hematoxylin, dehydrert og montert. Total kanin IgG erstatte de primære antistoffer fungert som en negativ kontroll.
Tumor innsamling og spredning
in vivo
Overflødig humane tumor eller ascites Prøver ble innhentet gjennom en IRB godkjent sentralisert bank infrastruktur ved Massachusetts General Hospital (MGH). Skriftlig informert samtykke er mottatt fra alle deltakerne. Det var ingen prøver fra mindreårige i denne studien. MGH Gyn vev depot-protokollen (07-049) ble gjennomgått og godkjent av Dana-Farber Harvard Cancer Center (DFHCC). I tillegg benyttet vi arkiverte prøver fra MGH patologi under en institusjonell godkjent protokoll (2008P001695).
Enkeltcellesuspensjoner fra enten enzymatisk behandlet solid tumor vev eller ascites ble deretter tømt for hematologiske komponenter som beskrevet [23]. Et bestemt antall celler ble suspendert i PBS:Matrigel® (01:01) og injisert subkutant (subkutant) i 6-8 uker gammel kvinne NOD /SCID mus (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME). Dyrene ble overvåket regelmessig for å bestemme tumordannelse og avlives når de ble døende eller hadde overdreven tumorbyrde. Alle dyreforsøk ble utført i henhold til anbefalingene i Guide for omsorg og bruk av forsøksdyr av National Institutes of Health. Protokollen ble godkjent av Massachusetts General Hospital Underkomité for forskning og Animal Care (protokoll nummer 2005N000273). Hver innsats ble gjort for å minimere lidelse.
For fortsatt forplantning i mus, ble xenografttumorer skåret ut og enzymatisk behandlet til en enkelt celle suspensjon. Suspensjonen ble utarmet på mus H-2K
d + celler ved anvendelse av MACS kuler (Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Tyskland) og de gjenværende tumor-avledede celler ble injisert subkutant inn i et nytt mottaker NOD /SCID-mus. Alle de viktigste menneskelige papillær serøs ovarietumorer benyttet i denne studien hadde gjennomgått 4-5 passasjer
in vivo
og serøs histologi av hver ble opprettholdt over serie transplantasjon prosessen. Dyrene ble plassert og vedlikeholdes i samsvar med institusjonelle retningslinjer.
Behandling av mus med Hh pathway hemmere
Cyclopamine.
Mus som bærer matchet store svulster (300-600 mm
3) fra den humane serøs eggstokkreft prøven SOC11 ble randomisert i to grupper på seks mus. Hver gruppe fikk enten 25 mg /kg cyclopamine eller kjøretøy (30% (vekt /volum) 2-hydroksypropyl-β-cyklodekstrin (HPBCD) i 0,1 M natrium-citrat-fosfatbuffer, pH 3,0) ved daglig oral gavage. Behandlingsperioden strakk 13 dager. Tumor-målinger og dyrevekter ble bestemt etter 4 dager. Svulster ble målt ukentlig med calipers og tumor volum (mm
3) ble bestemt ved å bruke formelen [lengde (mm) × bredde (mm) × bredde (mm)] /2. Musevekter ble undersøkt hver 4-7 dager for å overvåke potensiell toksisitet forbundet med hver behandling. Ved slutten av behandlingsperioden ble dyrene avlivet og tumorene ble høstet for videre analyse
IPI-926.
Tjuefire mus med SOC12, SOC13 eller SOC14 xenograft tumorer ble randomisert inn i fire kohorter med matchet tumorvolum (300-600 mm
3). Den paclitaxel /carboplatinum (T /C) alene kohort mottok ukentlig intraperitoneal (ip) injeksjon av 15 mg /kg paclitaxel og 50 mg /kg carboplatinum og den IPI-926 kjøretøy 5% (w /v) (HPBCD) administrert annenhver dag ved oral sonde. Den IPI-926 alene kohorten fikk 40 mg /kg IPI-926 annenhver dag ved oral sonde og Cremophor:ethanol (01:01, paclitaxel kjøretøy) og saltvann (carboplatinum kjøretøy) med ukentlig i.p. injeksjon. Mus i T /C + IPI-926 kohort mottatt ukentlig paclitaxel (15 mg /kg, i.p.) og carboplatinum (50 mg /kg, i.p.) og 40 mg /kg IPI-926 (annenhver dag, oralt inntak). Kontrollgruppen fikk paclitaxel, carboplatinum og IPI-926 kjøretøyer på doseringsplan som passer for hver enkelt. Tumorvolumer og muse vekter ble vurdert hver 4-7 dager som beskrevet ovenfor.
Den siste dose i T /C-kullet ble administrert på dag 14. Etter 21 dager, mus i kontroll og IPI-926 alene kohorter ble avlivet og deres tumorer ble høstet. Deler av hver tumor ble hurtig frosset for RNA-analyse og dyppet i parafin for histologisk analyse.
Etter gjennomføringen av T /C-behandling, mus på T /C alene og T /C + IPI-926 kohorter fort til å få enten IPI-926 kjøretøy (T /C alene gruppen) eller 40 mg /kg IPI-926 (T /C + IPI-926-gruppen) annenhver dag ved oral sonde. Dette vedlikeholdsbehandling ble utført for 18-30 dager. På slutten av vedlikeholdsperioden ble dyrene avlivet og svulster ble høstet og bearbeidet for RNA og histologiske analyser som beskrevet ovenfor.
Akutt IPI-926 behandling
Mus husing xenografter (300-600 m
3) avledet fra SOC12, SOC13 eller SOC14 ble behandlet med enten 40 mg /kg IPI-926 eller IPI-926 kjøretøy ved oralt inntak. Etter 24 timer ble dyrene avlivet. Deres svulster ble høstet og deler av hver ble hurtig frosset for RNA-analyse og dyppet i parafin.
RT-PCR-analyse
RNA ble isolert fra frosset svulstvev bruker GenElute ™ pattedyr RNA ekstraksjon kit (Sigma Aldrich, St. Louis, MO) etter produsentens anvisninger. To mikrogram av isolerte RNA ble brukt til å syntetisere cDNA ved anvendelse av Invitrogen Superscript ™ VILO settet (Invitrogen, Carlsbad, CA). Primere og prober for musen
Gli1
ble kjøpt fra Applied Biosystems Inc. (Carlsbad, CA, katalognummer Mm00494645_m1). Primere og prober for human
Gli1
ble utformet i bedriften: fremover: 5′-CTTTCATCAACTCGCGATGC-3 «; omvendt: 5»-GCTCATGGTGCCAATGGAG-3 «; probe: 5’FAM-CATCTCCAGGAGGCTCCTACGGTCA TC-TAMRA-3 «. Primere ble utformet for å strekke seg over exon-ekson kryss for å forhindre deteksjon av genomisk DNA. Uttrykket nivåer av menneske og mus
Gli1
gener ble normalisert til GAPDH og kvantifisert som beskrevet av Applied Biosystems Inc.
I tillegg til
Gli1
mRNA, vi analysert
SHH
,
SMO
,
og Ptch1
mRNA-nivåer i de 4 pasientprøver som brukes til å generere tumor eksplantater for å teste inhibering av Hhog pathway. Primere og prober for human
SHH plakater (katalognummer Hs00179843_m1),
SMO plakater (katalognummer Hs00170665_m1), og
Ptch1 plakater (katalognummer Hs00970980_m1) ble kjøpt fra Applied Biosystems Inc . (Carlsbad, California).
uttrykk nivåer av menneske
SHH
,
SMO
,
og Ptch1
gener ble normalisert til GAPDH og kvantifisert som beskrevet av Applied Biosystems Inc.
Analyse av
Gli1
uttrykk i menneskelig eggstokkreft tumor stroma
Høy grad sent stadium serøs primære ovarietumorer prøver ble innhentet før kjemoterapi fra 19 eggstokkreft pasienter innlagt ved Brigham and Women Hospital mellom 1990 og 2000. Klassifisering ble bestemt i henhold til International Federation of gynekologi og fødselshjelp standarder. Alle prøver og deres tilsvarende kliniske opplysninger ble oppnådd under IRB-godkjente protokoller. Mikrodisseksjon og RNA isolasjon ble utført som tidligere beskrevet [24]. I korthet, ble fibroblaster fra 7 um frosne snitt microdissected ved hjelp av et MD LMD laser microdissecting mikroskop (Leica, Wetzlar, Tyskland) og lysert i lyseringsbuffer RLT (Qiagen, Valencia, CA). RNA ble ekstrahert og renset ved anvendelse av RNeasy Micro kit (Qiagen, Valencia, CA). Totale RNA-prøvene ble kvantifisert og undersøkt for kvalitet med et Bioanalyzer 2100-system (Agilent, Palo Alto, CA) og så forsterket som tidligere beskrevet [24]. Kvantitativ real-time PCR (QRT-PCR) ble utført på 50 ng av dobbel-forsterket produkt fra de 19 prøvene som bruker primer setter spesifikke for
Gli1 plakater (forover ACCCCCTGGACTCTCTTGAT, revers GACACTCATGTTGCCCACAG). En iCycler iQ Real-time PCR Detection System (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) ble brukt i forbindelse med Superscript III Platinum SYBR Grønn One-Step QRT-PCR kit (Invitrogen, Carlsbad, California) i henhold til produsentens instruksjoner.
Statistical Analysis
ikke-para Wilcoxan rank sum tester for uparede prøver ble brukt til å sammenligne kreft størrelser i cyclopamine og IPI-926 behandlingsforsøk. Students t-tester ble benyttet for å bestemme den statistiske signifikans av resultatene oppnådd i IPI-926 akutt og langvarig behandling eksperiment. Signifikans ble satt til p≤0.05. Stata (College Station, TX) v10 programmet ble brukt. Overlevelsen Analysen ble utført ved hjelp GraphPad Prism versjon 5.00 for Windows (GraphPad Software, San Diego California USA).
Resultater
Shh og Gli1 uttrykk i menneskelige ovarietumorer
Siste studier har fremhevet rollen som Hh signalveien i utvikling og progresjon av solide svulster [25]. Vi vurderte den relative uttrykk for HH pathway medlemmer Shh og Gli1 i en undergruppe av ovarietumorer. Som vist i figur 1A, immuohistochemical analyse av Shh uttrykk på en vev microarray bestående godartede og ondartede svulster bestemt at 47% av de evaluerte maligne epiteliale ovarietumorer hadde påvisbare nivåer av Shh uttrykk. Til sammenligning ble Shh ekspresjon detektert i bare en av fem ikke-epiteliale ovarietumorer. Som dokumentert av eksemplene som er vist i figur 1A, både nivå og fordeling av Shh uttrykk store variasjoner i de analyserte svulster. Vi deretter undersøkt uttrykk for
Gli1
mRNA i de enkelte primære humane papillær serøs ovarietumorer SOC1-SOC10 (se tabell S1 for pasientopplysninger) ved RT-PCR. Vi har observert en lang rekke
Gli1
mRNA-ekspresjon på tvers av de analyserte tumorer (figur 1B). I tillegg har vi analysert
SHH
,
SMO
,
Ptch1
,
og Gli1
mRNA nivåer i 4 individuelle pasientprøver vi brukt til å generere svulst xenografter for å analysere effekten av Hh veien hemning på ovarial tumorvekst
in vivo plakater (figur 2). I hver av svulstene,
Gli1 Hotell og
SMO
ble mer rikelig uttrykt i forhold til
Ptch1
. Det var liten eller ingen
SHH
mRNA uttrykkes i disse prøvene. Tatt sammen, analyserer disse uttrykk tyder på at Hh signalveien er aktivert i en undergruppe av menneskelige ovarietumorer som tidligere rapportert.
A. Immunhistokjemisk analyse av Shh ekspresjon ble utført på en microarray vev som bærer for 64 individuelle primære ovarietumorer for å vurdere både hyppigheten og graden av Shh ekspresjon i human ovarian cancer. Den Shh flekker i et dårlig differensiert serøs cystadenocarcinoma (øverst til venstre panel), en dårlig differensiert mucinous cystadenocarcinoma (panel øverst til høyre), et godt differensiert cystadenocarcinoma (nederst til venstre panel), og en dårlig differensiert adenokarsinom (høyre panel nederst) vises. Tabellen oppsummerer frekvensen av Shh flekker i godartede svulster og ikke-epitelceller og epiteliale maligniteter stede i eggstokkene tumor microarray. B. Real-time Q-PCR ble utført for analyse av
Gli1
mRNA nivåer i 10 primære humane papillær serøs eggstokkreft svulster. Primere spesifikke for human
Gli1
og
GAPDH
ble brukt. For hver prøve, nivået av
Gli1
mRNA i forhold til nivået på
GAPDH
mRNA vises.
uttrykk for
Gli1
Ptch1
,
SHH Hotell og
SMO
ble analysert ved RT-qPCR i 4 primære humane serøs ovarietumorer (SOC11-SOC14) etablert som xenotransplantater i NOD /SCID-mus . Primere spesifikke for hvert menneske gen og menneske
GADPH
ble brukt. For hver svulst, nivåene av hvert gen i forhold til
GADPH
mRNA blir vist.
Hemming av Hh signale blokkerer veksten av menneskelige serøse eggstokkreft tumorxenotransplantater
for å undersøke den funksjonelle betydning av Hh reaksjonsveien i utviklingen av kreft i eggstokkene, behandlet vi mus som bærer humane serøse eggstokk tumorxenografter generert fra platina sensitiv tumor SOC11 med enten Hh-reaksjonsveiinhibitor cyclopamine eller kjøretøy og regelmessig vurdert effekten av hver behandling videre tumorvolumet. I cyclopamine-behandlede mus, ble tumorvekst utelukket over tretten-dagers behandlingsperiode resulterer i en signifikant (p 0,004) redusert tumorvolumet på dag 13 i forhold til det som ble observert i bilens behandlede dyr (figur 3). Minimal toksisitet ble observert i cyclopamine behandlede dyr uten observert statistisk forskjellige endringer i mus vekt (figur S1).
mus med menneske papillær serøs eggstokkene tumorxenotransplantater fra prøve SOC11 ble randomisert i 2 kohorter med matchet tumorvolum og behandlet med enten bil eller cyclopamine. Tumorvolumer ble vurdert regelmessig. Endringen i tumorvolum er vist i forhold til tumorvolumet ved begynnelsen av forsøket. Feilstolper representerer standardfeil av middelverdien (S.E.M). Signifikansen ble bestemt ved anvendelse av en Wilcoxon rank sum test.
Vår analyse av cyclopamine effekt på tumorvekst xenograft foreslått at inhibering av Hh-signalering kan være en effektiv metode for å kontrollere ovarial tumor progresjon. Vi neste gjennomført lignende eksperimenter ved hjelp av mer kjemisk potent og klinisk relevant Hh pathway inhibitor IPI-926 for tiden i fase I /II kliniske studier i ikke-ovarian solide tumorer. IPI-926 er avledet fra cyclopamine og har forbedrede farmasøytiske egenskaper inkludert høyere potens, en lengre halveringstid og økt biotilgjengelighet. Vi var spesielt interessert i å undersøke den potensielle nytten av IPI-926 i kombinasjon med standard første linje kjemoterapi. Vi har utført tre separate eksperimenter som anvender uavhengige primære, humane ovarie serøse xenograft tumorer (SOC12, SOC13, og SOC14) for å analysere den anti-tumoraktiviteten til IPI-926 alene eller i kombinasjon med paklitaxel og carboplatinum (T /C). De tumorxenografter ble avledet fra 2 pasienter med platina resistente sykdom (SOC12, SOC13) og en pasient med platina sensitiv sykdom (SOC14), og resultatene av disse analyser er vist i figur 4. Mus som bærer primære, humane ovarie serøse tumorxenografter ble randomisert inn i fire behandlingsgruppene som mottok enten bærerkontroll, IPI-926 alene, T /C alene eller IPI-926 og T /C. Over den første behandlingsperioden (dag 0-21), tumorvolum hos mus behandlet med bærerkontrollen økt dramatisk (Figurene 4A, 4B, 4C). Behandling av SOC12, SOC13 og SOC14 xenotransplantater med T /C alene resulterte i en signifikant reduksjon i tumorvolum (p 0,05; p 0,007; p 0,001 henholdsvis) i forhold til kontrollbehandling. Som cyclopamine, IPI-926 som monoterapi hadde en statistisk signifikant hemmende effekt på tumorvekst i forhold til kjøretøykontroll for både SOC13 (figur 4B, p 0,007) og SOC14 (figur 4C, p 0,01). Kombinasjonen av IPI-926 og T /C viste ingen større anti-tumoraktivitet enn T /C alene for alle testede tumorer. I disse analysene, observerte vi ingen betydelig vekttap hos dyr behandlet med IPI-926 som monoterapi i forhold til kjøretøy behandlet dyr (figur S2).
mus med svulster som stammer fra pasienter diagnostisert med serøs eggstokkreft ble randomisert inn i 4 gruppene (n = 4-6 dyr pr behandling kohorten) med matchet tumorvolum og utsatt for de angitte behandlingsregimer. Tre uavhengige papillær serøs eggstokkreft prøver, SOC12 (A), SOC13 (B) og SOC14 (C) ble brukt som biologiske replikater. Kohorter ble først behandlet med bilen alene (Control), paclitaxel og carboplatinum (T /C) alene, IPI-926 alene eller T /C + IPI-926 som angitt. Den siste T /C dose ble levert på dag 14 (antydet med den stiplede linjen). Prosent forandring i tumorvolum representerer endring i tumorvolum i forhold til tumorvolumet ved begynnelsen av forsøket. Feilstolper representerer standardfeil av middelverdien (S.E.M). Betydning ble bestemt ved hjelp av en Wilcoxon rank sum test.
Vi undersøkte neste anti-tumor aktivitet av IPI-926 etter avsluttet T /C-behandling. For disse analysene de musene som fikk enten T /C alene eller i kombinasjon med IPI-926 ble administrert sin tredje og siste ukentlige dosen av T /C på dag 14 av behandlingsregimet (stiplet linje, Figur 4). Dyrene ble så holdt på hver bærer (T /C alene behandles kullet) eller IPI-926 (T /C + IPI-926 behandlede kohort) og tumorvolum ble undersøkt med jevne mellomrom. Som vist i figurene 4A, 4B og 4C, fortsatt administrering av IPI-926 etter fullføring av T /C-behandling opprettholdes tumorregresjon, og i ett tilfelle (SOC13, figur 4B), resulterte i en ytterligere reduksjon i tumorvolum til et nivå som var nesten umulig å oppdage. I kontrast, observerte vi stadig økende tumorvekst hos mus behandlet med bilen etter opphør av T /C administrasjon. Dermed fortsatte IPI-926 behandling resulterte i en signifikant (p 0,02). Forskjellen i tumorvolumet i forhold til det som ble observert i kjøretøy behandlede mus for alle de tre individuelle primære svulster
IPI-926 hemmer Hh pathway aktivitet både stroma og tumor
Nyere data har antydet at Hh signalering i stroma er nødvendig for tumorutvikling i mus xenograft-modeller i bukspyttkjertelen og tarmkreft (25). For å vurdere stedet for handling av IPI-926 i systemet vårt, vi analysert
Gli1
mRNA uttrykk i både mus stroma og humane tumorceller etter enten akutt eller langvarig behandling med IPI-926. For den akutte studier ble mus som bærer xenografter generert fra SOC12, SOC13 og SOC14 ble behandlet med enten bærer eller IPI-926 i 24 timer. Etter innhøsting tumor, den relative ekspresjon av muse og humant
Gli1
ble bestemt ved RT-PCR ved anvendelse av artsspesifikke primere. Den akutte IPI-926 behandling førte til en rask betydelig reduksjon i mus
Gli1
uten hemming av menneskelig
Gli1
uttrykk (Figur 5, øvre panel). Vi har også analysert stromal og tumorspesifikke
Gli1
uttrykk i SOC12, SOC13 og SOC14 xenotransplantater høstet fra mus behandlet med enten bærer eller IPI-926 i 21 dager i studiene vist i figur 4. Som i den akutte setting, langvarig IPI-926 behandling førte til en betydelig hemming av
Gli1
mRNA uttrykk i stromal (p 0,05) rommet (Figur 5, nedre panel). I motsetning til hva som ble også observert i den akutte innstillingen, moderat hemming av
Gli1
mRNA ekspresjon ble observert i tumor (p 0,03). Etter langvarig behandling
Gli1
mRNA ekspresjonsnivåer i xenograft tumorer avledet fra SOC12, SOC13, og SOC14 ble analysert ved hjelp av sanntids kvantitativ PCR etter behandling av mus med IPI-926 i 24 timer (øvre panel) eller 21 dager (lavere panel). De relative nivåer av menneskelig (venstre panel) og mus (høyre panel)
Gli1
mRNA uttrykk ble analysert ved hjelp av artsspesifikke primere. Feilstolper representerer standardfeil av middelverdien (S.E.M). Betydningen (# p≤0.03, * p = 0,05, ** p≤0.001) ble bestemt ved hjelp av Student t-test.
Høy
Gli1
uttrykk i stroma av menneskelig papillær serøs ovarietumorer korrelerer med dårlig overlevelse
for å validere at
Gli1
mRNA uttrykkes i stroma av menneskelige serøse ovarietumorer, undersøkte vi den relative uttrykk for
Gli1
i stroma microdissected fra en annen kohort av 19 humane primære eggstokkene serøs tumorer (Tabell S2). Mikro-dissekert stroma av disse svulstene viste et bredt spekter av
Gli1
mRNA uttrykk (data ikke vist). Univariat overlevelse analyse viste at høyt
Gli1
mRNA uttrykk i stroma korrelert med en betydelig forverret overlevelse (figur 6).
Overlevelsesanalysedata innhentet for
Gli1
mRNA uttrykk på microdissected stroma prøver av 19 pasienter som bruker QRT-PCR validering. Høyere
Gli1
mRNA uttrykk korrelert med redusert overlevelse (Log-rank test, p 0,015) med en median overlevelse på 26.50 måneder for pasienter med lav
Gli1
mRNA uttrykk versus 16 måneder for pasientene som hadde svulster med høyere
Gli1
mRNA uttrykk i stroma.
Diskusjoner
Mange etterforskere har dokumentert rollen til Hh signalveien i utvikling og vedlikehold av faste tumorer [4], [6], [7], [8], [9], [10], [11], [12]. Nylige bevis antyder at aktivering av denne reaksjonsvei er involvert i patogenesen av kreft i eggstokkene (18, 20, 21). I vår studie, terapeutisk målretting av denne veien førte til hemming av menneskelig papillær serøs tumorvekst.
