Abstract
Mål
Rollen quercetin i eggstokkreft behandling er fortsatt kontroversielt, og mekanismen er ukjent. Målet med denne studien var å undersøke den terapeutiske effekten av quercetin i kombinasjon med cisplatin og andre antineoplastiske legemidler i eggstokkreft celler både
in vitro Hotell og
in vivo
, sammen med den molekylære virkningsmekanisme.
Metoder
quercetin behandling ved ulike konsentrasjoner ble undersøkt i kombinasjon med cisplatin, taxol, pirarubicin og 5-Fu i human epitelial eggstokkreft C13 * og SKOV3 celler. CCK8 assay og Annexin V-assay var for cellenes levedyktighet og apoptose analyse, immunofluorescens-analysen, DCFDA farging og realtime PCR ble anvendt for reaktive oksygenarter (ROS) -indusert skade deteksjon og endogene antioksidantenzymer uttrykk. Atymisk BALB /c-nu nakne mus ble injisert med C13 * celler for å oppnå en xenograft modell for
in vivo
studier. Immunhistokjemisk analyse ble utført for å evaluere ROS-indusert skade og SOD1 aktivitet av xenograft tumorer.
Resultatene
I motsetning til pro-apoptotiske virkning av høy konsentrasjon (40 pM-100 uM) av quercetin, lave konsentrasjoner (5 pM-30 uM) av quercetin resulterte i varierende grad av dempning av cytotoksisiteten av Cisplatin behandling i kombinasjon med Cisplatin. Lignende anti-apoptotiske effekter ble observert når quercetin ble kombinert med andre anti-neoplastiske midler: Taxol, pirarubicin og 5-fluorouracil (5-FU). Lave konsentrasjoner av quercetin ble observert å undertrykke ROS-indusert skade, redusere intracellulære ROS nivå og øke ekspresjonen av endogene antioksidantenzymer, noe som tyder på en ROS-mediert mekanisme for demping av anti-neoplastiske medikamenter. I xenogene modell, quercetin ført til en betydelig reduksjon av terapeutisk effekt av cisplatin sammen med styrke endogene antioksidant enzymet uttrykk og redusere ROS-indusert skade i xenograft tumor vev.
Konklusjon
Til sammen disse data tyder på at quercetin ved lav konsentrasjon dempe den terapeutiske effekten av Cisplatin og andre anti-neoplastiske legemidler i eggstokkreft celler ved å redusere ROS skade. Quercetin tilskudd under eggstokkreft behandling kan ugunstig påvirke terapeutisk respons
Citation. Li N, Sun C, Zhou B, Xing H, Ma D, Chen G, et al. (2014) Lav konsentrasjon av quercetin motvirker cytotoksiske effektene av antineoplastiske legemidler i eggstokkreft. PLoS ONE 9 (7): e100314. doi: 10,1371 /journal.pone.0100314
Redaktør: Ruby John Anto, Rajiv Gandhi Senter for Bioteknologi, India
mottatt: 11. desember 2013, Godkjent: 26 mai 2014; Publisert: 07.07.2014
Copyright: © 2014 Li et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av National Basic Research Program of China (973 Program, 2009CB521808); National Nature og Foundation of China Science (81230038, 81272859, 81025011, 81090414, 81000979, 81101962); Natur og Foundation i Hubei-provinsen Science (2011CBD542); Grunnforskning Midler til sentrale universiteter (Hust: 2012TS058). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Eggstokkreft er den mest hyppige invasiv kreft av det kvinnelige kjønnsorgan i USA, med anslagsvis 22,240 tilfeller diagnostisert årlig. Omtrent 14 030 kvinner dør hvert år av kreft i eggstokkene, som representerer den vanligste dødsårsaken blant kvinner med gynekologiske kreftformer [1]. Platinum narkotika, for eksempel cisplatin og karboplatin, er første linje kjemoterapeutiske midler for behandling av eggstokkreft. Selv om de fleste pasientene vise kjemosensitivitet når starten terapi, har kjøpt legemiddelresistens blitt et stort hinder i kreftbehandling. De faktorene som kan forbedre eller hemmer kreft effekt av antineoplastiske legemidler ser ut til å være viktig i behandlingen av kreft i eggstokkene.
quercetin (3,3 «, 4», 5,7-Pentahydroxyflavone, Quer) tilhører en klasse av flavonoid forbindelser, og er i ulike grønnsaker, frukt, frø, nøtter, te og rødvin [2]. Det er den viktigste flavonoid i menneskets kosthold, med en estimert daglig inntak av 25 mg i USA [3]. Som en bevist antioksidant, er quercetin anbefales å ta muntlig for kreft forebygging og helsevesenet [4]. I de senere år har flere studier bemerkes at quercetin kan virke som en potensiell anticancer medikament ved å øke toksisiteten av Cisplatin behandling i hepatoma HA22T /VGH og eggstokk-kreft A2780-celler [5] – [7]. Likevel, det finnes studier rapporterte at i motsetning til høye konsentrasjoner av flavonoider redusert celleoverlevelse og levedyktighet, lave konsentrasjoner økt total antioksidant kapasitet på kreftceller og hindre celledød på grunn av cytotoksiske stoffer som cisplatin og 5-Fu i lungekreft A549 og kolorektal kreft HCT116-celler [8], [9]. Rollen til quercetin i ovarian cancer behandling er kontroversielt, og virkningsmekanismen er ukjent.
Cisplatin og andre anti-neoplastiske midler fører til en økning i intracellulære reaktive oksygenarter (ROS) som kan bidra til deres terapeutiske virkning . Antioksidant som vitamin C-tilskudd kan dempe antineoplastiske aktivitet av legemidler som øker ROS [10]. Quercetin er kjent for å redusere intracellulære ROS-nivåer i forskjellige celletyper ved å fremme den intracellulære ROS-fjernende system, som omfatter modulering av avgiftende enzymer, slik som superoksyd-dismutase 1 (SOD1) og katalase (CAT). Det fikk oss til å stille spørsmål ved at om quercetin kan også motvirke den cytotoksiske effekten av anti-neoplastiske medikamenter som økte ROS. Målet med denne studien var å undersøke effekten av quercetin i kombinasjon med cisplatin og andre antineoplastiske legemidler i eggstokkreft celler både
in vitro Hotell og
in vivo
, sammen med den molekylære mekanismen av handlingen.
Materialer og metoder
Etikk erklæringen
Denne studien ble utført i henhold til anbefalingene i guide for omsorg og bruk av forsøksdyr i National Institutes of Health. Protokollen ble godkjent av komité for etikk av dyreforsøk av Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology (Permit Number: S292). Alle forsøk ble gjennomført for å redusere lidelsene til dyrene
Kjemikalier og reagenser
quercetin ( 99% ren)., Cis-Diammineplatinum (II) klorid (Cisplatin), Taxol (paclitaxel) var innkjøpt fra Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO), oppløst i DMSO, delt i porsjoner og lagret ved -20 ° C. Pirarubicin (Zhejiang Hisun Pharmaceutical Co., Ltd., Kina) og 5-fluorouracil (5-FU) (Shanghai Xudong Haipu Pharmaceutical Co Ltd, Kina) ble oppløst i vanlig saltvann.
Cell kultur
human ovarialcancer cellelinje C13 * [11] er det Cisplatin-resistente klon av ov2008 cellelinje som var avledet fra et humant ovarie karsinom. Denne C13 * cellelinjen var en gave fra Prof. Rakesh ved Ottawa Regional Cancer Center, Ottawa, Canada [3]. SKOV3 ovarian cancer-cellelinjen ble oppnådd fra American Type Culture Collection (ATCC). Eggstokkreft celler ble dyrket i RPMI 1640 medium med 10% føtalt bovint serum (FBS) ved 37 ° C med 5% CO
2.
Celleviabilitet
Cellelevedyktigheten ble målt ved hjelp CCK8 analysen (celletelling kit-8, Dojindo Molecular Technologies, Tokyo, Japan). Celler ble fremstilt i 96-brønners cellekulturplater ved en celletetthet på 5 x 10
3 celler /brønn og ble behandlet med quercetin /antineoplastiske midler (cisplatin, taksol, pirarubicin og 5-Fu) eller bærer (DMSO med den samme fortynning hastighet som de stoffer) ved 37 ° C i 48 timer. Den cellemonolaget ble vasket tre ganger med fosfat-bufret saltvann (PBS) inneholdende 1,2 mM CaCl
2 og 0,7 mM MgCl
2, da en 1:10 fortynnet CCK8 løsning i RPMI 1640 ble tilsatt til cellene og inkubert i 2 timer ved 37 ° C. Resultatene ble målt med en mikroplateleser ved 450 nm og uttrykt som prosentandeler av kontrollverdier (oppnådd for celler behandlet med bærer).
Annexin V /PI farging
Cellene ble trypsinisert og vasket med serumholdig medium. Prøvene (5 x 10
5 celler) ble sentrifugert i 5 minutter ved 400 x g og supernatanten ble kastet. Cellene ble deretter farget ved hjelp av en Annexin V-FICT /PI apoptose kit (keygen Biotech, Nanjing) i henhold til produsentens instruksjoner. Antallet apoptotiske celler ble funnet og analysert ved hjelp av flowcytometri.
Måling av ROS
ROS ble oppdaget ved hjelp av reaktive oksygenforbindelser Assay Kit (Beyotime, Kina) i henhold til produsentens instruksjoner. Etter at den molekylære proben 5- (og 6-) -chloromethyl-2 «, 7»-dichlorodihydrofluorescein diacetat (DCFH-DA) diffunderer inn i cellene og blir sekvestrert intracellulært ved de-forestring, den etterfølgende reaksjon med peroksyder genererer fluorescerende 5-chloromethyl- 2 «, 7»-dichlorofluorescein (DCF). I korthet, etter behandling, ble cellene samlet opp ved sentrifugering, resuspendert i PBS inneholdende 10 umol /L DCFH-DA, inkubert i 20 minutter ved 37 ° C, vasket med PBS for å fjerne overskudd av fargestoff, og deretter inkubert med RPMI-medium ved 37 ° C i 10 minutter, ble Fluorescens resultater oppnådd ved bruk av en FL-kanal fra et Becton Dickinson FACSCalibur, og analysert ved hjelp av Cellquest-programvare. Prosentandelen av celler som viser øket farveopptaks ble brukt for å gjenspeile en økning i ROS-nivåer.
Immunofluorescens-analyse
I korthet, ble C13 * celler sådd ut i 24-brønners cellekulturplater inneholdende en steril glass lysbilde på celletetthet på 2 × 10
4 celler /brønn. Etter behandling med forskjellige medikamenter i 48 timer ble cellene vasket tre ganger med iskald PBS og fiksert med 4% paraformaldehyd i PBS i 20 minutter ved romtemperatur. Etter blokkering med 1% fettfri melk i 2 timer, ble geite-anti-8-OHdG og mus anti-γH2AX antistoffer (Millipore) tilsatt til skinnene henholdsvis. Etter 4 timers inkubering ble platene vasket 3 ganger med 0,5% PBS-Tween 20 (PBST) og fluorescein-Cy3-konjugert sekundært muse-anti-geit-antistoff og FITC-konjugert geite-anti-muse-sekundært antistoff (Sigma-Aldrich) ble tilsatt ved en fortynning av 1:100. Cellene ble inkubert i 45 minutter ved 37 ° C. Til slutt, ble cellene vasket som beskrevet ovenfor og undersøkt med fluorescensmikroskopi (Olympus, Tokyo, Japan). Fem tilfeldige høy effekt felt bilder ble tatt av hver gruppe, ble Bilde J programvare som brukes til å beregne antall høyt positive fargede celler.
Sanntids Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction (RT-PCR)
C13 * celler ble sådd i 6-brønns cellekulturplater ved en tetthet på 5 x 10
5-celler /brønn, og behandlet med quercetin og cisplatin i 48 timer. Total RNA ble ekstrahert ved bruk av Trizol (Invitrogen, Kina). Komplementært DNA ble syntetisert i henhold til produsentens protokoll (Toyobo, Japan). Real-time PCR forsterkning ble utført på en ABI PRISM 7500 cycler med SYBR reagens (Toyobo, Japan). De termiske sykkelforholdene ble satt som gis i bruksanvisningen som fulgte med cycler, med en glødetemperatur på 60 ° C. Oligonukleotider som benyttes for forsterkning av Superoxide dismutase 1 (SOD1), endonuklease G (ENDOG), cytokrom c (cytomegalovirus-c), glutation peroksidase (GPX), ble katalase (CAT) og frakobling protein 2 (UCP2) (tabell S1) utformet ved hjelp primer 5.0 og syntetisert av Invitrogen. Kvantitativ normalisering av cDNA ble utført ved anvendelse av husholdningsgenet glyceraldehyd-3-fosfat dehydrogenase (GAPDH) som en intern kontroll for å bestemme jevnheten av templat RNA for alle prøver. For hver prøve ble ekspresjonen av det aktuelle genet avledet fra forholdet av sitt uttrykk til GAPDH-ekspresjon ved hjelp av følgende formel:. Relativ ekspresjon = 2- (ΔCt sample-ΔCt kontroll), ΔCt = Ct-gen-Ct GAPDH
in vivo
xenograft studier
in vivo
evaluering av quercetin ble utført ved hjelp av en xenograft modell av menneskelige C13 * celler. Atymiske BALB /c-nu nakne mus (4-6 uker gamle, hentet fra Beijing HFK biovitenskap selskapet, Beijing, Kina) ble plassert i en bestemt patogen fritt rom innenfor dyre fasilitetene på Forsøksdyr Center of University of Tongji Medical College . Dyrene fikk akklimatisere seg til sin nye miljø i en uke før bruk. C13 * celler (2 x 10
6) ble resuspendert i PBS medium med Matrigel basalmembran matrise (BD Biosciences, Bedford, MA) ved en 01:01 forhold (totalt volum 100 ul), og deretter ble subkutant injisert i flankene på nakne mus (dag 0). Fra den 10. dag av injeksjon ble musene randomisert til 4 behandlingsgrupper (n = 8 for hver gruppe) og injisert intraperitonealt (ip) med normal saltløsning (NS), quercetin (20 mg /kg kroppsvekt, daglig), cisplatin ( 4 mg /kg kroppsvekt, hver fjerde dag), og kombinerte quercetin og Cisplatin behandling (ved hjelp av de ovenfor angitte doser) i 21 påfølgende dager. Kroppsvekt og tumormassen ble målt hvert 5 dager. Tumorvolumet ble bestemt ved hjelp av en skyvelære, og beregnet i henhold til formelen (bredde
2 x lengde) /2. Mus ble avlivet ved cervikal dislokasjon under bedøvelse etter tre ukers behandling (dag 30).
Immunhistokjemisk analyse
Immunhistokjemiske studier ble utført på de xenograft tumorer etter at de var fjernet fra nakne mus. Tumorene ble løst i 40 mg /ml para-formaldehyd, parafin-innleiret og kuttet i 4 um seriesnitt. Deretter ble endogene peroksydaser bråkjølt og delene ble vasket grundig med fosfatbufret saltvann (PBS) tre ganger. Seksjonene ble blokkert med 2% geiteserum og kaninserum henholdsvis i PBS ved 37 ° C temperatur i 45 minutter og deretter inkubert med mus-anti-SOD1 antistoff (1:500 fortynning, Abcam) og geite-anti-8-OHdG antistoff (1 :800 fortynning, Millipore) over natten ved 4 ° C. Deretter ble seksjonene inkubert med geit-anti- mus og mus anti-geit pepperrot-peroksidase-konjugerte sekundære antistoffer separat og avidin-biotin-komplekset etterfulgt av diaminobenzidin (Vector ABC, Burlingame, CA, USA). Nedsenket i 2% ammoniakk vann, haematoxylin ble brukt for kontra. Seksjoner ble inkubert med kanin-IgG og geite-serum henholdsvis som negative kontroller.
Positiv 8-OHdG farging var hovedsakelig i kjernen, mens positivt uttrykk for SOD1 var først og fremst et cytoplasma mønster både i tumorceller heller enn i stromaceller . På grunn av intensiteten av 8-OHdG og SOD1 beising innen hver seksjon var hovedsakelig homogent, immunreaktiviteten i prøvene ble semikvantitativt bedømt ved hjelp av følgende kriterier: sterkt positiv (mottok som 3), sterk fargeintensitet (mer enn 90% av kreftceller); moderat positive (scoret som 2), moderat fargeintensitet ( 50-89% av positive celler); svak positiv (scoret som en), svak fargeintensitet ( 10-49% av positive celler); fraværende (scoret som 0), ingen fargeintensitet og ingen positiv eller bare noen få positive celler [12], [13]. Fargeintensitet, og andelen av hver seksjon flekker ble beregnet ved hjelp av fem tilfeldige høy effekt feltbilder av hver gruppe av to uavhengige forskere.
Statistical Analysis
Alle forsøk ble utført in triplo. Data er presentert som gjennomsnitt ± standardavvik. Statistiske analyser ble utført ved hjelp av SPSS19.0. Forskjeller mellom to grupper ble sammenlignet med Student
t
test. De statistiske forskjellene mellom mer enn to grupper ble bestemt ved enveis ANOVA analyse etterfulgt av post hoc parvise sammenligninger.
P
. 0,05 ble ansett som statistisk signifikant
Resultater
quercetin ved lave konsentrasjoner fremmer overlevelse av eggstokkreft C13 * celler behandlet med cisplatin
platinabasert kjemoterapi er det viktigste ved behandling av eggstokkreft. For å bestemme den potensielle rolle quercetin kan spille i Cisplatin motstand i eggstokk-kreft, ble C13 * celler eksponert for forskjellige konsentrasjoner av quercetin, Cisplatin, eller en kombinasjon av de to. IC50 av Cisplatin-behandlede C13 * cellene var omtrent 80 mikrometer (IC50 = 78,8 mikrometer, 95% KI: 72,9 til 85,1 mm) (figur S1 A). Når C13 * celler ble behandlet med 80 pM Cisplatin i kombinasjon med økende doser av quercetin, har vi funnet at cytotoksisiteten av Cisplatin ble redusert ved kombinasjon med lave konsentrasjoner av quercetin (5 uM til 30 uM), mens relativ høy konsentrasjon av quercetin (100 pM) økte Cisplatin cytotoksisitet (fig. 1A). For å bestemme antagonistisk effekt eller overfølsomhet i narkotika kombinasjon, beregnet vi kombinasjonen indeks (CI) for legemidler basert på Chou og Talalay teorem [14]. Resultatene viste at lave konsentrasjoner av quercetin antagoniseres de cytotoksiske virkninger av cisplatin i C13 * celler, mens høye konsentrasjoner av quercetin har en additiv effekt med cisplatin (tabell S2). Vi har også utført eksperimenter med kombinasjon med en serie forskjellige konsentrasjoner cisplatin pluss faste konsentrasjoner av quercetin (20 pM), som viste at lave konsentrasjoner av quercetin øket C13 * cellen resistens overfor cisplatin i varierende grad (figur S2). Fase-kontrast av C13 * celler behandlet med vehikkel-kontroll, cisplatin, eller kombinasjoner av quercetin (20 uM, 80 uM) med cisplatin (80 pM) er vist i fig. 1B.
(A), Cellenes levedyktighet av grupper eksponert for forskjellige konsentrasjoner av quercetin alene, eller i kombinasjon med 80 uM Cisplatin i 48 timer ble målt med CCK8 analyse og uttrykt som prosent av kontrollverdiene. *
P
= 0,039, #
P
= 0,009,
P
= 0,027,%
P
= 0,010, ANOVA test etterfulgt av post hoc parvise sammenligninger. (B), fase-kontrast av C13 * celler behandlet med bærerkontroll (DMSO med den samme fortynning hastighet som medikamenter), cisplatin, eller kombinasjoner av quercetin (20 uM, 80 uM) med cisplatin (80 pM). (C, D), Cell apoptose av forskjellige behandlingsgrupper ble påvist og analysert ved hjelp av strømningscytometri. Forsøk ble utført i tre paralleller (n = 3 per forsøk). Gruppe av Cisplatin kombinert med quercetin behandling VS. gruppe Cisplatin behandling, **
P
= 0,033, ***
P
= 0,043, ANOVA test etterfulgt av post hoc parvise sammenligninger.
For ytterligere kvantifisere apoptotiske virkninger av quercetin og cisplatin behandling, ble C13 * celler farget med Annexin V-FITC og PI, og deretter analysert ved hjelp av strømningscytometri for celle apoptose. Åpen nedgang i antall apoptotiske celler ble oppdaget for celler behandlet med cisplatin og 20 mikrometer quercetin enn ved cisplatin alene (Fig. 1C, 1D). Andeler av Annexin V-fargede celler var høyere i Cisplatin-behandlede celler enn dem fra celler behandlet med ytterligere 20 uM quercetin.
For å generalisere vår konklusjon, har vi utført CCK8 analyser i SKOV3, en vanlig brukt ovarian cancer cellelinje. Resultatene viste at lave konsentrasjoner av quercetin redusert den cytotoksiske effekten av cisplatin i SKOV3 celler (Figur S3).
quercetin dempes terapi effekter av ulike antineoplastiske legemidler i eggstokkreft celler
Å undersøke hvorvidt quercetin demper de anti-kreft-effekter av andre anti-neoplastiske midler, vi behandlet C13 * celler med tre andre anti-neoplastiske legemidler som vanligvis brukes i eggstokk-kreft-behandling, 5-Fu, Taxol, og pirarubicin. C13 * celler ble behandlet med en serie av økende doser av quercetin og fast 5-Fu (5 uM), Taxol (3 uM) og pirarubicin (3 nM) ved omtrentlige konsentrasjoner av henholdsvis IC50 (figur S1). I likhet med resultatene oppnådd med Cisplatin, behandling ved bruk av disse stoffene i kombinasjon med quercetin resulterte i mer celle motstand enn behandling med anti-neoplastiske medikamenter alene (Fig. 2.) ved en konsentrasjon på 20 uM, viste quercetin åpenbare anti-apoptotiske virkninger overfor disse tre stoffene. Quercetin viste en lav-konsentrasjons-spesifikke beskyttende effekt til eggstokkreft celler behandlet med 5-Fu (fig. 2A), i likhet med resultatene oppnådd med Cisplatin. I kombinasjon med taxol eller pirarubicin, men opprettholdt quercetin effekten av fremmende cellene survial mot anticancer legemidler selv ved relativt høye konsentrasjoner (80 uM, 100 uM) (Fig. 2B, 2C).
(A~C ), Cellenes levedyktighet av quercetin i kombinasjon med 5-Fu, taxol og pirarubicin ble målt med CCK8 analyse og uttrykt som prosent av kontrollverdiene. N = 3 per forsøk. Gruppe av Cisplatin kombinert med quercetin 20 mikrometer behandling VS. Gruppe av Cisplatin behandling, *
P
= 0,048, **
P
= 0,040, ***
P
= 0,032, Student t-test.
quercetin redusert oksidativ skade av eggstokkreft celler forårsaket av Cisplatin
Vi undersøkte den mekanismen som quercetin svekket den cytotoksiske effekten av cisplatin. Som tidligere rapportert [15], mange antineoplastiske legemidler inkludert Cisplatin, føre til økt intracellulær ROS som bidrar til deres terapeutiske effekt. Vi spurte om quercetin kan endre ROS-assosiert skade forårsaket av disse legemidlene. Ekspresjonen av 8-hydroxydeoxyguanosine (8-OHdG), en markør for oksidativt stress og DNA den mest hyppig oppdaget og undersøkt DNA lesjon [16], ble estimert ved immunefluorescence assay. Vi målte også nivået av total celleskade ved påvisning av γH2AX, en felles markør for DNA-skade. Resultatene viste at fluorescensstyrkene til både γH2AX og 8-OHdG var mye lavere i gruppen behandlet med 80 pM Cisplatin i kombinasjon med lav konsentrasjon quercetin (20 uM) enn gruppen av 80 pM Cisplatin alene. I motsetning til dette, 80 pM Cisplatin med høy konsentrasjon (60 uM, 100 uM) av quercetin øket intensiteten av fluorescens (Fig. 3A, 3B). Telling av positive celler ved hjelp av Image J programvare viste at kombinasjonsbehandling med quercetin (20 uM) var en mer åpenbar reduksjon av 8-OHdG enn for γH2AX, sammenlignet med Cisplatin behandling alene (36,40% og 19,33%, respektivt) (fig. 3B) . Det indikerte at lave konsentrasjoner av quercetin redusert den oksidative skader av eggstokkreft celler forårsaket av Cisplatin.
(A), 8-OHdG og H2AX uttrykk i C13 * celler behandlet med quercetin i kombinasjon med cisplatin ble oppdaget av immunfluorescens analyse. (B), ble nummer av svært positive fargede celler i fem tilfeldige høy effekt felt telles av Image J og uttrykt som prosentandel av Cisplatin konsernets verdier. Gruppe av Cisplatin kombinert med quercetin 20 mikrometer behandling VS. Gruppe av Cisplatin behandling, N = 3. *
P
= 0,004, #
P
= 0,001, Student t-test.
quercetin redusert ROS nivå eggstokkreft celler som gjennomgår Cisplatin behandling
for å avgjøre om quercetin redusert ROS skade ved å redusere intracellulær ROS, reaktive oksygenforbindelser analysesett ble brukt til å påvise intracellulære ROS-nivåer av C13 * celler i ulike behandlingsgruppene. Sammenlignet med celler behandlet med vehikkel-kontroll eller cisplatin alene, behandling med ytterligere 20 uM quercetin føre til en reduksjon i intracellulære nivåer av ROS (fig. 4A, 4C). Kvantitativ analyse viste at quercetin (20 uM) behandling ga en tydelig reduksjon i ROS-nivå (middelverdi 70,4) sammenlignet med kontrollgruppen (middelverdi 99,05) (
P
0,001) (Fig. 4B, 4D ). I samsvar med tidligere resultater, eksponering for Cisplatin forårsaket eggstokkreft C13 * celler til å akkumulere den intracellulære ROS, med en gjennomsnittlig ROS nivå på 123,5. I behandlingsgruppen av cisplatin kombinert med quercetin, ble denne verdien redusert til 83,38 (Fig 4D.), Enda lavere enn bilen kontrollgruppen (99,05) (
P
0,001). (Fig. 4B)
Intracellulær ROS-nivåer av C13 * celler av forskjellige behandlingsgrupper ble påvist ved reaktive oksygenforbindelser analyse ved hjelp av flowcytometri. (A, B) ROS-nivåene av C13 * celler behandlet med bærerkontroll eller 20 uM quercetin i 24 timer. (C, D) ROS-nivåene av C13 * celler behandlet med 80 uM cisplatin, med eller uten 20 mM quercetin i 24 timer. N = 3. *
P
0,001, #
P
. 0,001, Student t-test
quercetin økt uttrykk av endogene antioksidantenzymer i eggstokkreft celler
resultatene ovenfor indikerte at quercetin kan redusere intracellulær ROS av eggstokkreft celle, så vi søkt å bestemme en virkningsmekanisme. De viktigste antioksidant komponenter av celler mot ROS er de endogene antioksidantenzymer, inkludert Superoxide dismutase 1 (SOD1), endonuklease G (ENDOG), cytokrom c (cytomegalovirus-c), glutation peroksidase (GPX), katalase (CAT), og frakopling protein 2 (UCP2). Vi målte ekspresjonen av endogene antioksidantenzymer ved realtime PCR. Sammenlignet med celler behandlet med kjøretøykontroll eller Cisplatin alene, behandling kombinere Cisplatin med 20 mikrometer quercetin føre til ulike grader av økningen i uttrykket av SOD1, ENDOG, CYTO-c, gpx, CAT og UCP2 (Fig. 5A~F).
(A~F), Expression av antioksidant enzymer av C13 * celler ble oppdaget av real-time PCR. N = 3.
quercetin forfremmet kreft vekst eggstokkreft med Cisplatin behandling
in vivo
Vi brukte C13 * cellene til å generere xenografttumorer i atymiske nakne BALB /c -nu mus for å avgjøre om quercetin kunne dempe virkningene av kjemoterapi
in vivo
. Som forventet, behandling med cisplatin alene reduserte tumorvekst sammenlignet med kjøretøy behandlet mus. Behandling med quercetin alene litt undertrykket tumorvekst sammenlignet med vanlig saltvann kontroll (tumor mengder 111.75 mm
3 og 120.51 mm
3 henholdsvis) (P = 0,015). Svulster fra mus behandlet med cisplatin i kombinasjon med quercetin var omtrent 1,8 ganger større i dag 30 enn de som ble behandlet med cisplatin alene (
P
0,001 Fig. 6A, 6B). Sammenligning av gjennomsnittsvekter på svulster fjernet fra mus, fant vi at svulster behandlet med kombinasjon av quercetin og Cisplatin (72.53 ± 7.33 mg) var betydelig tyngre enn det behandlet med cisplatin alene (41.47 ± 6,72 mg),
P
0,001 (fig. 4D). Videre viste kombinasjonen av Cisplatin og quercetin behandling kreftfremmende effekt sammenlignet med kontrollgruppen, målt både i tumorstørrelse og i tumorvekt (Fig. 6C).
Mus ble injisert med NS, 20 kg /quercetin, 4 mg /kg Cisplatin, eller quercetin pluss cisplatin, ip. C13 * celletransplantater (2 × 10
6) ble inokulert i høyre flanke av kvinnelige atymiske nakne nu /nu mus. Tumorvolumer ble bestemt ved en skyvelære, og beregnet i henhold til formelen (bredde2 x lengde) /2. (A), Tumor-dannelse i mus av Cisplatin behandlingsgruppe og kombinert med quercetin gruppe. (B), gjennomsnittlig relativ tumorvekst som analysert ved hjelp av økningen i tumorvolumer for 8 mus pr forsøksgruppe ** Cisplatin pluss quercetin VS. Cisplatin,
P
0,001; * Quercetin VS. Control,
P
= 0,015, ANOVA test etterfulgt av post hoc parvise sammenligninger; (C) Gjennomsnittlig tumorvekt for hver gruppe. #Cisplatin Kombinert med quercetin VS. Cisplatin,
P
0,001, ANOVA test etterfulgt av post hoc parvise sammenligninger; (D), Immunhistokjemisk analyse av 8-OHdG og SOD1 i xenograft tumorer fjernet fra nakne mus. (E), The kvantifisering data for forskjeller i uttrykket SOD-1 og 8-OHdG, *: P 0,001, **. P 0,001, ANOVA test etterfulgt av post hoc parvise sammenligninger
quercetin forbedret uttrykk for endogene antioksidant enzymet SOD1 av eggstokkreft celler
in vivo
, og forhindret ROS-indusert skade
for å bekrefte den beskyttende effekt mot oksidativ skade ved quercetin in vivo , immunhistokjemiske analyser ble utført på tumorer fjernet fra nakne mus xenograft modell. 8-OHdG, en markør for oksidativt DNA-stress, var plassert hovedsakelig i kreftcellekjernen. I svulster behandlet med vehical eller quercetin alene, 8-OHdG farging viste svak intensitet med resultatet på 0,4 og 0,6 henholdsvis. I gruppen behandlet med cisplatin alene, nesten alle kreftceller vises ekstremt sterk 8-OHdG farging med resultatet 2,8. Som forventet, mus gruppen behandlet med cisplatin i kombinasjon med quercetin hadde et mye lavere nivå av 8-OHdG farging (skår 1,6) i tumorer enn den som ble behandlet med cisplatin alene (fig. 6D-E).
DNA reparasjonsenzymer hindre opphopning av skadet DNA og antioksidanter beskytter cellene mot frie radikaler. Vi oppdaget SOD1 uttrykk, som er et kritisk endogene antioksidantenzym for å tåle den oksidative stress, for å finne ut om quercetin påvirket av aktiviteten til endogene antioksidantenzym. Positiv uttrykk for SOD1 var først og fremst en cytoplasma mønster i eggstokkreft celler i stedet for stromale celler. Antioksidant enzymet SOD1 var sterkt overuttrykt i tumorer behandlet med quercetin eller Cisplatin pluss quercetin (skår 2,0 og 2,6) sammenlignet med tumorer som ble behandlet med bærer eller cisplatin alene (ballen 1,2 og 0,6 henholdsvis) (fig. 6D-E). Resultatene indikerte at quercetin forbedret den endogene antioksidant enzymet SOD1 uttrykk for eggstokkreft celler
in vivo
, og forhindret ROS-indusert skade.
Diskusjoner
Som en klassisk flavonoid sammensatte , quercetin er vanligvis anbefales å ta muntlig hver dag for generell helse og kreft forebygging. Staedler
et al.
Funnet at quercetin ved konsentrasjoner på 5 uM og 10 uM kunne øke effektiviteten av 100 uM doksorubicin i brystcancerceller in vitro [17], [18], mens andre forskere kom til forskjellige konklusjoner [8], [9]. Samuel
et al.
[8] rapportert at i kolorektal og prostata kreft celler, den terapeutiske effekten av narkotika i kombinasjon med quercetin ble påvirket av de effektive doser og p53 status av cellene (kombinasjonen av 5- Fu med opp til 6 mikrometer quercetin fremmet cologenic overlevelse i p53-null-celler, mens 50 M quercetin handlet motsatt rolle i p53 villtype celler). I denne studien, quercetin ved høye konsentrasjoner, enten alene eller i kombinasjon med Cisplatin vist antineoplastiske effekter i eggstokkreft C13 * celler, mens lav konsentrasjon (5 pM-30 uM) av quercetin ut til å antagonisere den cytotoksiske effekten av anti-neoplastiske midler inkludert Cisplatin, 5-Fu, Taxol, og pirarubicin. Vi har også undersøkt den mekanisme av anti-apoptotiske virkning av quercetin i kombinasjon med Cisplatin.
