Abstract
Emerging bevis tyder på kreftstamceller (cscs) kan initiere nye svulster i anaplastic thyroideakarsinom (ATC), en av de mest aggressive solide svulster hos mennesker. Imidlertid involvering av cscs i human tumorgenese har ikke tidligere vært studert i autentiserte ATC cellelinjer. Her viser vi en funksjonell rolle cscs i fire nye validerte human ATC cellelinjer (THJ-11T, THJ-16T, THJ-21T og THJ-29T). Vi identifiserte og beriket cscs bruke en spheroid dannende analysen. 3 til 9% av cellene fra fire ATC cellelinjer dannet thyrospheres. De thyrospheres uttrykte stamcellemarkører Nanog og Oct4 og besatt evnen til å fornye seg selv. Injeksjon av disse thyrospheres inn i thyroids av NOD /SCID
Il2rg – /-
mus resulterte i dannelsen av metastatiske svulster som rekapitulert kliniske kjennetegn menneskelig ATC. Så vidt vi vet, er dette den første
in vivo
karakterisering av skjoldbrusk cscs bruker validerte human ATC cellelinjer. Tilgjengeligheten av sykdomsspesifikke thyrospheres og våre ortotopiske tumormodeller vil gjøre det mulig belysning av sykdomsmekanismer og miljø nisje av cscs. De kan også være nyttig for prekliniske terapeutisk screening og for å overvåke effekten av biologiske terapi på ATC
Citation. Li W, Reeb AN, Sewell WA, Elhomsy G, Lin RY (2013) Fenotypisk Karakterisering av metastatisk Anaplastisk skjoldbruskkjertelkreft stamceller. PLoS ONE 8 (5): e65095. doi: 10,1371 /journal.pone.0065095
Redaktør: Alfredo Fusco, Consiglio Nazionale delle RICERCHE (CNR), Italia
mottatt: 18 oktober 2012; Godkjent: 22 april 2013; Publisert: 28. mai 2013
Copyright: © 2013 Li et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble støttet av National Institutes of Health Grant R01 DK068057 og presidentens forskningsfond av Saint Louis University (RYL). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Anaplastisk thyroideakarsinom (ATC) er en av de mest dødelige menneskelige kreftformer. Nitti prosent av pasienter med ATC dø innen seks måneder etter diagnose. Selv om det er relativt sjeldent – det utgjør bare 2% av alle thyroid krefttilfeller – ATC fører til mer enn 50% av alle skjoldbruskkjertelen kreftdødsfall hvert år. Aktuelle behandlinger for ATC er aggressive, og inkluderer kirurgi, cellegift og strålebehandling. Imidlertid er ATC motstandsdyktig mot alle typer terapi og sykdom prognose har vært uendret i mer enn 50 år [1]. Åpenbart er ATC en stor diagnostisk og terapeutisk utfordring
En undergruppe av kreft stamceller (cscs) har blitt antatt å rekonstituere og opprettholde tumorvekst i ATC [2] -. [7]. Cscs er tumor initiere celler som besitter stamcellelignende egenskaper. De er kjennetegnet ved en evne til å gjennomgå både symmetrisk og asymmetrisk fordeling, samt for å skille ut en rekke tumorcelletyper. De er stort sett stillestående, noe som tillater dem å flykte standard chemotherapies sikte på raskt dele celler. Cscs kan isoleres både fra etablerte thyroid kreft-cellelinjer og tumorprøver. Imidlertid har en alvorlig cellelinje forurensning problemet så tvil om resultatene av mange nyere studier på menneske ATC cellelinjer, inkludert to som vi og andre laboratorier beskrevet en CD133-positive CSC befolkningen i ATC cellelinje ARO som var både tumorigent og resistent overfor kjemoterapi [8], [9]. Dette ARO cellelinje er siden blitt vist å være forurenset med den humane koloncancer-cellelinje HT-29. Faktisk Schweppe
et al
funnet at opptil 42% av skjoldbrusk kreft cellelinjer som vanligvis brukes i skjoldbrusk forskning i løpet av de siste to tiårene er feilidentifisert, redundant eller cross-forurenset [10]. Denne alarmerende oppdagelsen har drevet skjoldbruskforskersamfunnet for å skape nye, godkjente skjoldbrusk kreft cellelinjer.
I denne studien har vi evaluert fire godkjente menneske ATC cellelinjer (THJ-11T, THJ-16T, THJ-21T og THJ-29T) for eksistensen av cscs som kan initiere neoplastisk vekst. Som beskrevet i en rapport fra Marlow
et al
, alle fire menneske ATC cellelinjer ble etablert fra svulster fjernet fra ATC pasienter og ble undersøkt for forekomst av kjente thyroid tumorigenesis endringer, herunder mutasjoner i
BRAF, KRAS, NRAS
, og
HRAS
; mutasjoner i
RET /PTC1, RET /PTC2
, og /eller
RET /PTC3
fusion-onkogener; og noen av de kjente varianter av
PAX8 /PPARy
fusion-onkogen [11]. Unike genetiske mutasjoner og 12 korte tandem DNA gjenta (STR) sekvenser ble brukt til å knytte cellelinjene til sine respektive svulster -. Gjør dem det første settet med skjoldbruskkjertelen kreftcellelinjer som kan incontrovertibly spores tilbake til sin vev av opprinnelse [11]
for å undersøke om en CSC befolkningen eksisterer i disse cellelinjer, må vi først etablert en pålitelig spheroid dannende analyse for å identifisere og berike skjoldbrusk cscs. Deretter testet vi effekten av kjemoterapi middel cisplatin på disse cellelinjene. Vi så vurdert muligheten av disse cellene til å initiere nye svulster under serie
in vivo
aging ved begrensende fortynninger i immunodeficient NOD /SCID
Il2rg – /-
mus. Til slutt, utforsket vi det metastatiske potensiale til ATC thyrospheres i to xenotransplantasjon modeller: ortotopisk thyroid transplantasjon for å bestemme hvorvidt de thyrospheres er tumorigen, og i stand til å invadere lokale vev, og en halevene-injeksjon modell for eksperimentelt indusert lungemetastaser for å teste muligheten av celler til metastaserer til fjerne steder.
Resultater
ATC celler opprett klonogene kapasitet
in vitro
Vi først studert spredning av fire menneske ATC cellelinjer : THJ-11T (p67), THJ-16T (P88), THJ-21T (P56) og THJ-29T (p89). De fasekontrastbilder av disse cellelinjene dyrket i RPMI-medium som monolag og celleproliferasjon bue over en 96-timers periode, er vist i fig. 1A og 1B. Real-time kvantitativ revers transkriptase-PCR (QRT-PCR) analyser viste at alle cellelinjer uttrykte paret boksen genet 8 (
Pax8
), en skjoldbrusk-spesifikke transkripsjonsfaktor. En av de cellelinjer, THJ-21T, også uttrykt thyroid transkripsjonsfaktor 1 (
TTF1
). I kontrast, ingen av cellelinjer uttrykte skjoldbrusk differensieringsmarkører som tyreoglobulin (
Tg
), natrium /jodid symporter (
NIS
), thyroid peroksidase (
TPO
) eller reseptoren for thyroid stimulerende hormon (
TSHR
.) – bekrefter dedifferensieres tilstand av disse ATC cellelinjer (fig. 1C)
(A) fasekontrastmikroskop bilder av fire ATC cellelinjer dyrket som monolag i RPMI medium. (B) Vekst proliferasjon kurve i løpet av 96 timer viser den proliferative potensial av disse ATC cellelinjer. (C) QRT-PCT analyse av skjoldbrusk transkripsjonsfaktorer
Pax8 Hotell og
TTF1 Hotell og skjoldbruskdifferensieringsmarkører
TSHR
,
TG
,
NIS
, og
TPO
. Menneskelig GAPDH ble brukt som husholdningsgenet i løpet av de presiseringer.
For å karakter cscs i disse cellelinjene, vurdert vi deres evne til å danne kolonier og thyrospheres
in vitro
. Fig. 2A viser at alle cellelinjer dannet kolonier i metylcellulose-baserte medier etter syv dager i kultur. De dannet også frittflytende thyrospheres når seedet i stamcelle-dyrkningsforholdene på ultra-lave festeplater. Begrensende fortynning analysen viste at den gjennomsnittlige andelen thyrospheres dannet var 9,4 ± 0,8% i THJ-11T celler, 4,5 ± 0,9% i THJ-16T celler, 3,1 ± 0,6% i THJ-21T celler og 8,8 ± 1,0% i THJ-29T -celler (fig. 2B). Diameteren av primære thyrospheres varierte 100-150 um. Disse thyrospheres kan utvides etter flere passasjer. Gjennomsnittlig andel av sekundære thyrospheres ble redusert i alle cellelinjer: 5,5 ± 0,4% i THJ-11T celler, 3,3 ± 0,5% i THJ-16T celler, 1,2 ± 0,5% i THJ-21T celler, og 4,9 ± 0,2% i THJ -29T celler (fig. 2B). Denne reduksjonen kan være et resultat av en innledende fase av symmetrisk ekspansjon av seeded thyroid stamceller, etterfulgt av den asymmetriske fordeling som gir opphav til differensierte avkom som utgjør hoveddelen av de thyrosphere cellene. Vi neste vurdert av indirekte immunfluorescens uttrykket av pluripotency markører Nanog og OCT4 i thyrospheres generert fra alle fire ATC cellelinjer. Representative konfokalmikroskopi bilder av THJ-21T thyrospheres indikerte uttrykk for Nanog og Oct4 (Fig. 2C). Representative fase kontrast av THJ-21T foreldre monolagcellene indikerte at uttrykket av disse stamcellemarkører er unik for thyrospheres, og som nevnt ovenfor, ikke er sett i foreldre monolagcellene. Disse observasjonene tyder på at alle ATC cellelinjer har evnen til å fornye seg selv
in vitro
. Videre er det et klart bevis på uttrykk for stamcelle-assosierte gener i thyrospheres.
(A) Representant fasekontrastmikroskop analyse av kolonier (til venstre) og thyrospheres (til høyre) etter syv dager med kultur. Scale bar, 100 mikrometer. (B) Prosent av primære og sekundære thyrospheres i alle fire ATC cellelinjer. (C) Representative konfokal mikroskopi bilder av THJ-21T thyrospheres indikerte uttrykk for Nanog (rød), Oct4 (grønn) og DAPI (blå). Scale bar, 10 mikrometer (øvre panel). Representative fase kontrast av THJ-21T foreldre monolagcellene indikert uttrykk for Nanog og Oct4 er unik for thyrospheres og er ikke sett i foreldre monolagcellene (nedre panel).
Effekten av kjemoterapeutiske agenten cisplatin på ATC celler
Vi undersøkte effekten av kjemoterapeutiske middel cisplatin, som for tiden blir testet i en fase i /II klinisk studie med pasienter med ATC, på våre ATC cellelinjer. Fig. 3A viser representative fasekontrastmikroskopi bilder av THJ-11T celler eksponert for den indikerte dose av cisplatin i 48 timer. Våre resultater viser en dose-responsive inhibering av cisplatin av cellevekst og etablert en IC
50 for hver cellelinje (Fig. 3B). Vi videre fastslått om thyrospheres vise cisplatin chemoresistance ved å sammenligne følsomheten thyrospheres avledet fra THJ-11T og THJ-16T celler med at av foreldre monolagcellene (Fig. 3C). Etter 24 timer i nærvær av 10 mikrometer av cisplatin, overlevelsen av THJ-11T thyrospheres var ~1.7 ganger høyere enn for THJ-11T monolagcellene (52,5 ± 3,5
vs.
30,0 ± 1,4,
P
0,05). I kontrast, overlevelsen av THJ-16T thyrospheres under like forhold var lik som THJ-16T monolagcellene ((49,7 ± 2,7
vs.
48,6 ± 1,5,
P
= 0,73 ) (fig. 3C). Disse resultatene tyder på at en subpopulasjon av sfæroide-dannende celler i THJ-11T-celler, men ikke i THJ-16 celler, er resistente overfor cisplatin behandling.
(A) Representative fasekontrast mikroskopi bilder av THJ-11T parenmonolags-avledede celler som er utsatt for den indikerte dose av cisplatin i 48 timer. (B) dose~~POS=TRUNC avhengig~~POS=HEADCOMP inhibering av vekst i alle ATC cellelinjer. IC
50 verdier er som vist for hver cellelinje . (C) Sammenligning av
in vitro
resistens mot cisplatin av foreldre monolagcellene og sfæroide dannende celler. Den THJ-11T og THJ-16T foreldremonolags-deriverte celler og thyrosphere-avledet celler ble behandlet med 10 uM av cisplatin og fraksjonen av prolifererende celler gjenværende ble deretter beregnet ut fra det Alamar blå celleproliferasjonsanalyse. Alle forsøk ble utført in triplo. ****,
P
0,0001; ***,
P
0,001; **
P
. 0,05
ATC celler initiere svulster i serie transplantert immunsvikt mus
For å teste vår hypotese om at bare en liten bestand av cscs er ansvarlig for tumordannelse, transplantert vi hver av de fire ATC cellelinjer i grupper av NOD /SCID
Il2rg – /-
mus – en sterkt redusert immunforsvar stamme som mangler T-celler, B-celler og NK-celler [12] . Tabell 1 viser at subkutan injeksjon av noen av cellelinjene som skyldes dannelse av tumorer i mus. Imidlertid er lengden av tiden fra injeksjon til tumordannelse, eller latensen av cellelinjene, variert: 28 dager for THJ-11T, 28 og 70 dager for THJ-16T, 56 til 77 dager for THJ-21T, og 56 til 91 dager for THJ-29T. Disse observasjonene tyder på at THJ-11T celler initiere tumorvekst mer effektivt enn de andre ATC cellelinjer
neste serielt transplantert disse primære transplantater i andre NOD /SCID
Il2rg -. /-
mus for å bestemme langtids karsinogent potensial av disse cellene. Begrensende fortynning transplantasjons eksperimenter viste at frekvensen av tumorvekst økte med serie xenografting. For eksempel, det ventetid av sekundære xenotransplantater av 5 x 10
5 ATC celler (uavhengig av cellelinje) var 14 til 28 dager, mens den for et tilsvarende antall celler i tertiære xenotransplantater var 7 til 14 dager (tabell 1) . Vi har også observert at størrelsen av de subkutane svulstene reflekterer antall celler injisert (Fig3. 4 A og B). Svulster avledet fra sekundære og tertiære xenografter av THJ-11T celler konsekvent gjengitt de primære svulster på histologisk nivå, og Western blotting og immunhistokjemisk analyse bekreftet uttrykk for tumor markører ALDH, CD44 og CXCR4 i xenografter (Fig. 4 C-E). Merk at muse xenografter uttrykker ikke CD133, i tråd med en tidligere funn i primærkulturer genereres fra kirurgiske prøver av human ATC [5]. Sammen disse resultatene tyder på at alle disse fire ATC cellelinjer har langsiktige karsinogent potensial og at våre xenograft modeller kvantitativt og kvalitativt rekapitulere tumorigenesis
in vivo
. Oppdagelsen av at hver cellelinje kan spres i tre passasjer demonstrerer sin selvfornyelse potensialet
in vivo
. Spesielt, var 42 til 77 dager som kreves for tumordannelse etter subkutan injeksjon av 10.000 THJ-11T thyrosphere-avledede celler (tabell 1). Denne økningen i ventetid tyder på at det subkutane plass ikke kan gi den aktuelle mikromiljøet for thyrosphere-deriverte celler.
(A) Tumor vekstkurve generert ved subkutan injeksjon av THJ-11T foreldremonolags-deriverte celler. Antallet celler injisert er indikert. (B) En representativ subkutan tumor fjernet fra en mus xenograft. (C) Western blot-analyse som viser ekspresjonen av ALDH, CD44, og CXCR4 i celler avledet fra primære, sekundære og tertiære xenotransplantater. (D) H .
P
= 0,25) (figur 5C). Histologisk analyse av de ortotopiske tumorer som oppstår fra både thyrosphere og monolags-celler viste extrathyroidal forlengelse rundt luftrøret, og tracheal invasjon inn i glattmuskel og spiserøret (Fig. 5B). Selv om immunhistokjemisk analyse bekrefter ekspresjonen av ALDH, CD44 og CXCR4 i tumorer avledet fra hver celletype (figur 5D) – et resultat i samsvar med resultatene fra den subkutane modellen (figur 4E.) – En signifikant større andel av cellene i thyrosphere-avledede tumorer uttrykte disse markørene (fig. 5D). Sammen utgjør disse observasjonene validere den lokale metastatisk potensial for thyrosphere-deriverte celler til skjoldbruskkjertelen og andre nærliggende vev.
(A) En representant eksperiment som viser plasseringen av skjoldbruskkjertelen og luftrøret. (B) ortotopiske svulster generert med 500.000 foreldremonolags-deriverte celler og 10.000 thyrosphere-deriverte celler. H E farging viste invasjonen av anaplastiske tumorer i skjoldbruskkjertelen, luftrøret, glatt muskulatur og spiserøret. F, normal skjoldbrusk follikler; S, glatt muskulatur; Asterisk, skjoldbruskkjertelen svulster; E, spiserør. (C) ortotopiske svulster som oppstår fra thyrosphere-deriverte celler hadde en større svulst volum enn gjorde dem som skyldes foreldremonolags-deriverte celler (60 ± 30 mm
3
versus
40 ± 20 mm
3 ;
P
= 0,25). (D) Immunhistokjemisk farging av ALDH, CD44, CXCR4 og CD133 i ortotopiske svulster generert fra monolayer- og thyrosphere-avledet celler. Legg merke til den intense immunoreaktivitets av ALDH, CD44 og CXCR4 i thyrosphere-deriverte svulster fire uker etter injeksjon. (E) Skjematisk fremstilling av lunge kolonisering analysen av halen vene injeksjon modell. Representative histologi bilder av mus med lungemetastase indusert av THJ-11T monolagcellene. Merk at mus injisert med thyrosphere-deriverte celler ikke utvikler lungemetastaser. Scale bar, 100 mikrometer.
ATC thyrosphere-deriverte celler ikke induserer lungemetastase
Som orthotopic transplantasjon modellen ikke alltid kan produsere fjernmetastaser i lungen (en viktig dødsårsak i ATC), vi injisert 10.000 thyrosphere-deriverte celler eller 500.000 THJ-11T celler dyrket i monolag i halevenene av NOD /SCID
Il2rg – /-
mus til eksperimentelt indusere lungemetastaser. Mus ble avlivet og lunge snitt ble analysert etter seks uker. Tallrike metastatiske noduler ble observert i lungene av mus injisert med THJ-11T celler dyrket i monolag, men ingen ble funnet i lungene av mus injisert med thyrosphere-avledede celler (fig. 5E). Disse observasjonene tyder på at thyrosphere-avledet cellene ikke fremme utviklingen av lungemetastaser i dette eksperimentelt indusert lungemetastase modell.
Diskusjoner
ATC er den mest aggressive subtype av skjoldbruskkjertelkreft. På grunn av sin motstand mot alle typer av kreftterapi, median overlevelse av ATC er bare seks måneder. Imidlertid har utviklingen av mer effektive behandlinger-vært hemmet av mangel på validerte thyroid kreft cellelinjer for stor-skala medikament-screening. Etter en rapport i 2008 av alvorlige thyroid kreft cellelinje krysskontaminering [10], ble det nødvendig å generere nye, validerte cellelinjer med en detaljert karakterisering av cellelinje integritet og STR profiler som genetisk knytter linjene til deres vev av opprinnelse. De fire ATC cellelinjer som er benyttet i denne studien representerer den første panel av thyroid kreft cellelinjer som oppfyller disse strenge nye standarder. Våre resultater viser at alle fire ATC cellelinjer inneholde en liten bestand av cscs med selvfornyelse potensial. Vi har videreutviklet en enkel og robust måte å generere metastatisk ATC i en orthotopic musemodell med humane thyrospheres avledet fra disse cellelinjene. Injeksjon av thyrosphere-avledet celler i de thyroids av NOD /SCID
Il2rg – /-
mus resulterte i dannelsen av metastatiske svulster som rekapitulert kliniske kjennetegn menneskelig ATC
Thyroid cscs er. sjeldne, og fraværet av spesifikke celleoverflatemarkører gjør deres isolasjon utfordrende. Flere markører, inkludert CD44, ALDH og CD133, har vært brukt med hell for å isolere cscs fra bryst, prostata, kolorektal, glioblastom, og bukspyttkjertel kreft [13] – [17], og CD133 er tidligere blitt identifisert som en antatt CSC markør for ATC . Men publikasjoner rapporterer disse observasjonene har blitt kritisert for sin bruk av en forurenset tykktarmskreft cellelinje [8], [9]. I denne studien, ingen av ATC cellelinjer uttrykte CD133, i tråd med en tidligere funn i primærkulturer genereres fra kirurgiske prøver av human ATC [5].
Fordelene med ATC cellelinjer inkluderer muligheten til kultur dem over lange tidsperioder og å dyrke dem i store mengder for high-throughput medikament-screening applikasjoner. På tross av disse fordelene, er det nødvendig å få bekreftet våre funn i primær ATC celler fordi cellelinjer som ikke alltid rekapitulere alle sider av primære svulster. Imidlertid har sjeldenhet og hurtig dødelig natur av denne malignitet gjorde dette vanskelig å oppnå i laboratoriet.
cscs kan isoleres ved en rekke forskjellige teknikker, inkludert strømningscytometri basert på ekspresjonen av spesifikke celleoverflatemarkører som de som er omtalt ovenfor [18] – [21]. Sorteringen av side populasjoner av kreftceller gjennom Hoechst 33342 fargestoff ekskludering er en alternativ tilnærming [22]. Nyere studier har også vist at den sfæroide dannende analyse og kultur er en like effektiv fremgangsmåte for å separere cscs fra mange solide tumorer eller cancercellelinjer [23], spesielt når – slik tilfellet er med ATC – en pålitelig celleoverflate CSC markør har ennå ikke blitt identifisert.
thyrosphere analysen er et godt studert
in vitro
stamcelle analyse for å fastslå klonalitet og multipotency potensielle thyroid stamceller [2]. Dissosiering thyrospheres inn i enkeltceller, plating dem til begrensende fortynning og deretter utsette dem for serieaging i kultur kan ytterligere evaluere langvarig proliferasjon potensialet til disse cellene. Våre data viser at alle fire ATC cellelinjer kan bli dyrket som thyrospheres og re-passert flere ganger, bekrefter deres selvfornyelse potensialet
in vitro
. Våre cytotoksisitetstester studier viste at en liten bestand av thyrospheres fra THJ-11T cellelinjen var resistent mot cisplatin behandling. Men under samme forhold, thyrospheres og monolagcellene stammer fra THJ-16T celler var like følsomme for cisplatin. Disse forskjellene kan skyldes de molekylære og genetiske forskjeller mellom de to ATC cellelinjer og kan garanterer videre etterforskning.
cscs er i stand til å gjengi hele heterogenitet av den overordnede svulsten og vokse kontinuerlig, selv etter flere passasjer. Dermed til en definitiv måte bekrefte selvfornyelse og multipotency potensialet for en CSC
in vivo
er å regenerere svulst i immunsvikt dyr. Vi fant ut at svulster fra hver av de fire ATC cellelinjer ikke bare rekapitulert histologi og struktur av foreldre svulster, men kan også spres
in vivo
for tre passasjer. Disse resultatene støtter vår hovedhypotese at enkelte ATC celler utviser stamcelleegenskaper
in vivo
. Vi videre funnet at høyere xenografter fra alle fire ATC cellelinjer vokste raskere i NOD /SCID
Il2rg – /-
mus enn gjorde primære xenografter. Selv om disse resultatene kan ikke nødvendigvis indikerer stamcelle berikelse, de kunne tyde på at noen kreftceller i tertiær xenografter er svært proliferativ. Videre undersøkelser er nødvendig for å forklare de mer aggressive tertiære tumorxenotransplantater i ATC og å bestemme hvilke implikasjoner, hvis noen, for tilbakevendende svulster i humane pasienter.
I denne studien brukte vi NOD /SCID
Il2rg – /-
mus for å teste de ATC cellelinjer for xenograft vekst. Denne musestamme mangler modne T- og B-celler og er mangelfull i flere høy-affinitet cytokinreseptorer – inkludert IL2, IL4, IL7, IL9, IL15 og IL21 – som kreves for utvikling av NK-celler og medfødt immunitet responser. Som et resultat blir immunsystemet til denne stammen mer alvorlig svekket enn i ovennevnte standard NOD /SCID-mus. For eksempel har det blitt rapportert at en av fire tilfeldig utvalgte enkeltceller fra en human melanoma prøve kan danne en tumor i denne musemodellen, som er flere størrelsesordener større enn en-in-a-million celler blitt foreslått av studier i standard NOD /SCID-mus [12]. Det er klart at valget av genetisk modifiserte musemodeller for xenograft studier av putative cscs i vesentlig grad påvirker analysens følsomhet og må vurderes nøye ved tolkning av data. Dette NOD /SCID
Il2rg – /-.
Musestamme har blitt gullstandarden for testing CSC modell på grunn av sin overlegne xenografting evne
Vi har brukt tre forskjellige transplantasjons tilnærminger for å studere tumorigent og metastatisk potensial for thyrosphere-avledet celler. Av de tre transplantasjons områder vi demonstrert i denne rapporten – subkutan, skjoldbruskkjertelen og halevenen – bare orthotopic skjoldbrusktransplantasjon modell generert aggressive og metastatiske svulster innen to uker etter injeksjon. Til sammenligning, det subkutane modell, selv i stand til å støtte startfasen, krever mer enn 40 dager for å generere detekterbare svulster fra det samme antall celler. Endelig kan halevene-injeksjon modellen ikke initiere svulster etter enda seks uker. Disse observasjonene tyder på at det finnes en nisje i skjoldbruskkjertelen som deltar direkte i reguleringen av thyrosphere-avledede celler. ATC metastase er en kompleks og svært regulert prosess formidles ved hjelp av forskjellige tumor-avledede faktorer. Forstå hvordan thyrosphere-deriverte celler fremme lokal, men ikke lungene, kan metastase være avgjørende for å utvikle mer effektive behandlinger for metastatisk ATC.
I sammendraget, tilgjengeligheten av ATC-spesifikke thyrosphere-avledet celler og ortotopiske tumormodeller at rekapitulere den metastatisk kreft så dødelig for menneskelige pasienter gir skjoldbrusk kreftforskere et panel av enestående kliniske verktøy. Våre funn kan vise seg nyttig i klarlegging av de molekylære mekanismene bak spredning av metastatiske cscs og utforskningen av terapeutiske strategier direkte rettet mot skjoldbrusk cscs.
Materialer og metoder
Menneskelig ATC cellekultur, kolonidannelse analysen, og thyrosphere analysen
Den menneskelige ATC cellelinjer THJ-11T, THJ-16T, ble THJ-21T og THJ-29T [11] gitt av Dr. John A. Copland (Mayo Clinic). Celler ble dyrket i RPMI-1640 medium (Cellgro, Manassas, VA) supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS), ikke-essensielle aminosyrer, natriumpyruvat og penicillin-streptomycin-amfotericin B. Kulturene ble holdt i et fuktig kammer i en 5% CO
2 /luftblanding ved 37 ° C. For kolonien-formasjon analysen ble cellene dyrket i methylcellulose baserte medier MethoCult i henhold til produsentens instruksjoner (Stemcell Technologies, Vancouver, Canada). For den sfæroide dannende analysen ble enkle celler platet med 5000 celler /brønn på ultra-low-feste seks-brønners plater (Fisher Scientific Co., Hampton, NH). Spheres ble talt etter syv dager. Prosentdelen av celler som danner thyrospheres beregnes ut fra det totale antall celler sådd. Telleren er antall thyrospheres dannet per brønn, og nevneren er 5.000.
For
in vitro
serieaging, thyrospheres ble samlet ved forsiktig sentrifugering ved 800 rpm i 5 min og dissosiert enzymatisk med 0,05% trypsin /EDTA. De dissosierte celler ble passert gjennom 40 mikrometer mesh filtre (BD Falcon Cell Sil, Franklin Lakes, NJ) for å eliminere dubletter eller trillinger. Enkeltceller ble sådd ut ved 5000 celler /brønn på ultra-low-feste seks-brønns plater for å generere sekundære thyrospheres. Tre slike runder med serie passasje ble utført. I noen eksperimenter, ble sfærer oppsamlet etter syv dager, trypsinert inn i enkeltcellesuspensjoner, og deretter blandet med Matrigel /RPMI i en 1:01 fortynning for injeksjon i mus.
RNA isolering og QRT-PCR
Total RNA ble isolert fra 1 x 10
6 celler med RNeasy-sett (Qiagen, Valencia, CA) og ble behandlet med RNase-fri DNase (Qiagen). To mikrogram av total RNA ble revers transkribert til cDNA ved hjelp av Thermoscript First Strand Synthesis System (Invitrogen, Grand Island, NY). De oligonukleotid sekvenser av primere (
Pax8
,
TTF1
,
TSHR
,
TG
,
NIS Hotell og
TPO
) har blitt publisert andre steder [24], [25]. MRNA nivåene ble kvantifisert i triplikat ved QRT-PCR på en ViiA7 PCR System (Applied Biosystems, Foster City, CA). PCR ble utført med en SYBR Grønn PCR Master mix. Menneskelig GAPDH ble brukt som husholdningsgenet i løpet av de presiseringer.
In vivo
tumorigenitet eksperimenter
Åtte uker gammel kvinne NOD /SCID
Il2rg
– /-
mus ble oppnådd fra Taconic Farms Inc. og vedlikeholdt under patogenfrie forhold med godkjenning av Institutional Animal Care og bruk komité Saint Louis University School of Medicine. For subkutan transplantasjon, enkle celler ble resuspendert i 100 pl Matrigel /RPMI i 1:01 fortynning og injiseres subkutant i NOD /SCID
Il2rg
– /-
mus. Tumorbelastning ble målt to ganger i uken ved palpasjon og calipers, og tumorvolumet ble beregnet ved den følgende formel: (π /6) × stor diameter x (liten diameter)
2. Musene ble overvåket i tre til fem måneder for utseende og utvikling av svulster. Mus ble ofret når svulstene nådde 1,5 cm
3.
For serie passasje, ble svulster høstet, hakket, kollagenase-fordøyd og gått gjennom 40 mikrometer mesh filtre for å oppnå en enkelt-cellesuspensjon. Den resulterende cellepopulasjon ble kalt «sekundær passage» og ble dyrket i tre til sju dager i RPMI /10% FBS medium og deretter re-inokulert i NOD /SCID
Il2rg
– /-
mus. Påfølgende tumorer ble anvendt for gjentatte runder med ATC celleisolering og generering av ekstra serielt-passaged ATC celler opp til tre passasjer.
