Abstract
Bakgrunn
Tumor antigen (TA) -targeted monoklonalt antistoff (mAb) immunterapi kan være effektive for behandling av et bredt spekter av kreft årsaker; imidlertid har disse fremgangsmåter vist variabel klinisk virkning ved behandling av pasienter med prostatakreft (PCA). En hindring for tiden hindrer translasjonsforskning fremgang har vært manglende evne til å kvantifisere mAb dosen som når svulsten nettstedet og binder seg til de målrettede TAs. Koblingen av mAb til nanopartikkel-baserte magnetisk resonans imaging (MRI) prober bør tillate
in vivo
måling av pasientspesifikke biofordelinger; disse målingene kan legge til rette for framtidig utvikling av nye dosimetri paradigmer der mAb dosen titreres for å optimalisere resultatene for den enkelte pasient.
Metoder
prostata stamcelle antigen (PSCA) er bredt uttrykt på overflaten av prostatakreft (PCA) celler. Anti-human PSCA monoklonale antistoffer (mAb 7F5) ble bundet til Au /Fe
3O
4 (GoldMag) nanopartikler (mAb 7F5 @ GoldMag) å tjene som PSCA spesifikke theragnostic MR sonde tillater visualisering av mAb biodistribusjon
in vivo
. For det første antistoffet immobilisering effektiviteten av GoldMag partiklene og effekt for PSCA-spesifikk binding ble vurdert. Deretter ble PC-3 (prostatakreft med PSCA over-uttrykk) og SMMC-7721 (hepatomceller uten PSCA uttrykk) tumorbærende mus injisert med mAb 7F5 @ GoldMag for MR. MR-probe biofordelinger ble vurdert til å øke tidsintervaller etter infusjon; terapi respons ble evaluert med serie svulst volummålinger
Resultater
Målrettet binding av mAb 7F5 @ GoldMag sonder til PC-3 celler ble bekreftet ved hjelp av optiske bilder og MR.; selektiv binding ble ikke observert for SMMC-7721 svulster. Den immunterapeutisk effekt av mAb 7F5 @ GoldMag i PC-3 tumorbærende mus ble bekreftet med signifikant hemming av tumorvekst sammenlignet med ubehandlede kontrolldyr.
Konklusjon
Våre lovende resultater tyder gjennomførbarhet for å bruke mAb 7F5 @ GoldMag sonder som en roman paradigme for deteksjon og immunterapeutisk behandling av PCa. Vi optimistisk forventer at tilnærminger har potensial til å bli oversatt til de kliniske settinger
Citation. Ren J, Wang F, Wei G, Yang Y, Liu Y, Wei M, et al. (2012) MRL av prostatakreft Antigen Expression for diagnostisering og lmmunotherapy. PLoS ONE 7 (6): e38350. doi: 10,1371 /journal.pone.0038350
Redaktør: Dominique Heymann, Faculté de Médecine de Nantes, Frankrike
mottatt: 15 januar 2012; Godkjent: 03.05.2012; Publisert: 27 juni 2012
Copyright: © 2012 Ren et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble støttet med tilskudd fra Natural Science Foundation National of China (NSFC) 30973408, NSFC 81000627, og NSFC 81001015. de bevilgende myndighet hadde noen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet.
konkurrerende interesser:. forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Prostatakreft (PCA) er den vanligste kreftformen blant menn i USA, og er den andre ledende dødsårsaken av kreft hos menn [1]. Lokalisert PCa kan behandles med kirurgi eller strålebehandling, men sykdommen går igjen i omtrent 20 til 30% av pasientene. Androgen-deprivasjonsterapi, den vanligste behandlingen etter tilbakefall, er effektive, men sykdommen utvikler seg etter hvert hos de fleste pasienter som mottar slik behandling [2], [3], [4]. For menn med metastatisk PCA median overlevelse i siste fase 3-studier varierte fra 12,2 til 21,7 måneder [1], [2], [3], [4]. Et kjemoterapeutisk middel, docetaxel, er den eneste godkjente terapi vist å forlenge overlevelsen hos menn med denne tilstanden, overdragelse en median overlevelse fordel med 2 til 3 måneder [5], [6]. Konvensjonelle kreft behandlinger, for eksempel cellegift og strålebehandling, er preget av en manglende tumorcelle spesifisitet.
Overbevise bevis indikerer at tumor antigen (TA) -targeted monoklonalt antistoff (mAb) -basert immunterapi er klinisk effektiv for ved behandling av et bredt spekter av kreft genese [7], [8]. Imidlertid har TA-målrettede mAb-basert immunterapi viste variabel klinisk virkning ved behandling av pasienter med PCa; denne form for terapi har vært effektiv i bare en delmengde av den sykdom som uttrykker spesielt rettet TA [9], [10]. En hindring som er i ferd med å hindre eller vanskelig translasjonell fremgang har vært den manglende evne til å kvantifisere pasient-spesifikke dosen av mAb som binder til de målrettede TAS. Denne informasjonen er fortsatt i stor grad ukjent i kliniske settinger, men ville tillate pasientspesifikke dosejusteringer eller adopsjon av alternative behandlingsstrategier når det er nødvendig (dvs. målrette et annet antigen og /eller benytte alternative mAbs).
I kliniske settinger, 18- F fluorodeoxyglucose (FDG) positronemisjonstomografi (PET) gir en tidlig og nøyaktig måte å finne ut om kreft reagerer på behandlingen. Noen nye molekylær bildeteknologi med PET holde løftet for PCa ledelse. Fluorestradiol (FES) måler østrogenreseptorer å spore svulster og fluorothymidine (FLT) gir innsikt i cellevekst og spredning [11], [12]. I den senere tid er det andre metabolske PET tracere har blitt testet for prostatacancer [13], [14]. Viktigere, har det vært en studie som brukes av humanisert anti-PSCA (prostata stamcelle antigen) intakt antistoff som en molekylær avbildning sonde for PET billeddiagnostikk, som er under utvikling for evaluering i en pilot klinisk avbildning studie [13]. Imidlertid kan PET gi utilstrekkelig romlig oppløsning for påvisning av tidlig stadium av PCa [15]. Fordelene med MRI enn atombasert molekylavbildningsteknikker inkluderer høyere romlig oppløsning, overlegen kontrast mykt vev, og evnen til å integrere molekyl, anatomiske og fysiologiske bildedata, alt uten å utsette pasienten for potensielt skadelige radionuklider. I tillegg gir MR innsikt i svulst funksjon og har potensial til å bygge bro videre skillet mellom molekylærbiologi og klinisk oversettelse.
Nye prekliniske forskningsinnsats for å utvikle multi-modalitet molekylær avbildning metoder har potensial for ikke-invasiv PCa diagnose og bildestyrt immunterapi [16], [17]. Flere grupper er aktivt med utvikling av bilde prober for cellulært og molekylært MR [12], [16], [18], [19], [20]. Superparamagnetisk jernoksyd (SPIO) nanopartikler kan lett bindes til forskjellige molekylære markører inkludert ligander, antistoffer og peptider som MRI-prober [21], [22], [23], [24]. Det statiske magnetfelt er betydelig forstyrret av disse SPIO-baserte prober, dephasing av behandlingen spinner fører til lokalisert signaltap i MR-bilder.
Au /Fe
3o
4 nanopartikler med et skall /kjernestruktur blir syntetisert ved reduksjon av Au
3+ med hydroksylamin i nærvær av Fe
3o
4 [25], [26]. Au /Fe
3O
4 nanopartikler ble brukt i denne studien med en gjennomsnittlig størrelse 50 nm (shell /kjerne, 5/45 nm) i diameter (GoldMag Biotechnology Co., Ltd, Xi’an). Magnetiske nanopartikler (Fe
3O
4) har fått bred oppmerksomhet på grunn av deres potensielle bruksområder i MR [21], [22], [23], [24], [27]. Dannelsen av gull skall på den magnetiske nanopartikler ble utført ved hjelp av en iterativ metode reduksjon ved hjelp av hydroksylamin [28], [29]. Den Fe
3O
4 kjerner gir en partikkel med en liten størrelse med betydelig magnetisk moment, og en gull belegg på Fe
3O
4 kjerne kan innføre en god plattform for videre konjugering med biomolekyler spesielt for biosensorer fabrikasjon. Gullbelagt Fe
3O
4 nanopartikler ble rapportert å utvise god avlastning og affinitet via amin /tiol endegrupper [28], [29]. Med relativt større antistoff immobilisering kapasitet, Au /Fe
3O
4 nanopartikler er en god antistoff carrier sammenlignet med Au nanopartikler og Fe
3O
4 nanopartikler. På grunn av iboende høy metning magnetiseringen, Au /Fe
3O
4 nanopartikler kunne svar raskt til ytre magnetfelt med mindre tidsforbruk under separasjonsprosessen. Derfor gullbelagt magnetiske nanopartikler tilfredsstiller grunnleggende krav som immunologi transportør. Disse Au /Fe
3o
4 nanopartikler krever bare et enkelt trinn for antistoff immobilisering og gi forholdsvis store og stabile antistoffbindingskapasiteter [20], [26], [30], [31], [32]. Antistoff-konjugerte Au /Fe
3O
4 nanopartikler kan potensielt tjene som en sensitiv theragnostic MRI sonde tillater
in vivo
visualisering av mAb biodistribusjon og målrettet levering til svulster. Disse teknikkene kan til slutt tillate klinikere å optimalisere individuelle dose for bedre resultater i løpet av immunterapi og /eller tillate rask, presis adopsjon av alternative behandlingsstrategier ved behov.
prostata stamcelle antigen (PSCA) er en glykosyl phosphoinositol forankret celleoverflate-protein som hører til Thy-1 /Ly-6 klasse av overflateantigener. PSCA er en ideell kandidat for utvikling av reagenser for påvisning eller immunterapi av PCa fordi det har økt ekspresjon spesifisitet for PCa og har en celleoverflate-stedet [33], [34], [35], [36]. mAb 7F5 er for tiden anbefalt for påvisning av PSCA av human opprinnelse i løpet av Western Blotting, immunfluorescens og strømningscytometri prosedyrer [36], [37].
I denne studien mAb 7F5 ble konjugert til Au /Fe
3O
4 nanopartikler til å produsere ny MR theragnostic probe (7F5 @ Au /Fe3O4) for PCa. Hensikten med studien var å undersøke effekten av denne theragnostic MR sonde spesielt rettet mot PSCA på overflaten av menneskelige prostata kreft celler (PC-3 celler) for deteksjon og immunterapi i en mus xenograft modell.
Materialer og metoder
Cellelinjer linjer~~POS=HEADCOMP og Animal Model
Denne studien ble gjennomført med godkjenning av Institutional Animal Care og bruk komité. Alle dyrene ble plassert og håndteres i henhold til de Institutional Animal Care og bruk komité retningslinjer og alle dyr arbeidet ble godkjent av den aktuelle komiteen (IACUC 0.000.000 og 0000000A-1). Protokollen ble godkjent av den lokale etikkutvalg (etisk komité, fjerde Military Medical University 127/2008) og alle dyrene fikk human behandling i samsvar med «The Principles of Laboratory Animal Care» formulert av National Society for Medical Research og «Guide for omsorg og bruk av forsøksdyr »utgitt av National Institutes of Health (NIH publikasjon nr 86-23, revidert 1996).
Fire til seks uker gamle hårløse mus (mannlige Bab /c mus som veide mellom 25 og 30 g) ble anvendt for disse studiene. En human prostata carcinoma cellelinje; PC-3 ble satt i gang fra en beinmetastasering av en klasse IV prostatisk adenocarcinoma [33], [34], [35], [36]. Cellene ble oppnådd kommersielt fra American Type Culture Collection (ATCC; Rockville, MD) og dyrket som et monolag i Eagle «s minimum essensielt medium (Invitrogen Corp., Grand Island, New York) supplert med 15% føtalt bovint serum (FBS) ved 37 ° C under en blanding av 95% luft og 5% CO
2. For etablering av PC-tre tumorbærende modell, ble mus inokulert med 2 × 10
6 celler /5 ml PBS i høyre flanke. En annen tumor-bærende mus (SMMC-7721 svulster uten PSCA uttrykk) ble opprettet for å tjene som kontrollgruppe. SMMC-7721, en human hepatomcellelinje karsinom (HCC) cellelinje, ble dyrket i Dulbeccos modifiserte Eagle medium (DMEM, Invitrogen Corp., Grand Island, New York) supplert med 10% FBS ved 37 ° C under en blanding av 95% luft og 5% CO
2 [38].
Anleggs og evaluering av mAb 7F5 @ Au /Fe3O4 theragnostic MR Probe
MR theragnostic prober ble konstruert ved hjelp av enten PCa spesifikk mAb 7F5 (i Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, California) eller et ikke-spesifikt antistoff, mus anti-humant IgG (Wuhan BOOSTER Biology Co. Wuhan) for å tjene som en kontroll probe. Begge 7F5 @ Au /Fe3O4 og IgG @ Au /Fe3O4 prober ble konstruert som tidligere beskrevet [20], [26], [30], [31], [32]. I korte trekk ble 200 pl (1 mg /ml) av Au /Fe
3o
4 nanopartikler ble plassert i et rør pipette. Dette rør ble så plassert i en magnetisk separator i 2 min. 100 mikrogram antistoffprotein (enten mAb 7F5 eller IgG) ble oppløst i 400 ul koblingsbuffer; det utskilte Au /Fe
3o
4 nanopartiklene ble deretter tilsatt til 350 pl av antistoffløsningen. Den gjenværende antistoffløsning (50 ul) ble anvendt for kobling av effektivitetstester. Antistoffet løsning med Au /Fe
3o
4 nanopartikler ble plassert i et konstant temperatur (37 ° C) risteapparat i 20 minutter ved 180 rpm, flyttet til et sentrifugerør. Dette rør ble anbragt i en magnetisk separator for å fjerne supernatanten av immobilisert antistoff-Au /Fe
3o
4 nanopartikler. 50 ul av denne supernatant ble anvendt for kobling av effektivitetstester. Bindingskapasiteten av Au /Fe
3o
4 overflate ble bestemt ved anvendelse av en UV-VIS spektrofotometer (PerkinElmer, Waltham, Massachusetts) og koblingsgrad (andel av protein opptak) beregnet: x 100%, med OD ( pre) og OD (post) absorbansmålingene ved 280 nm for de 50 fil før og etter kobling antistoff løsninger, henholdsvis. Spesifikk binding ble evaluert som tidligere beskrevet [20], [26], [30], [31], [32]. I korte trekk, separat, 5 mikrogram /ml 7F5 @ Au /Fe3O4 eller IgG @ Au /Fe3O4 ble inkubert med 5 × 10
5 PC-3 celler og SMMC-7721 celler for 30 min i fluorescens-aktivert celle sortering (FACS ) buffer. Cellene ble vasket to ganger med PBS, farget med fluorescein-isotiocyanat (FITC) konjugert geite-anti-muse-sekundært antistoff via inkubasjon i 1,5 timer (romtemperatur). Prøvene ble vasket to ganger med PBS for evaluering av spesifikk binding ved hjelp av strømningscytometri-analyse. For optisk mikroskopi analyse, PC-3 og SMMC-7721 celler holdt glassene. Separat 200 mikrogram /ml 7F5 @ Au /Fe3O4 eller IgG @ Au /Fe3O4 ble deretter inkubert med PC-3 celler og SMMC-7721 celler for natten ved 37 ° C. Cellene ble vasket tre ganger med PBS. Cellene ble farget med Cy3 konjugert geite-anti-muse-sekundært antistoff via inkubasjon i 1,5 timer ved romtemperatur. Cellene ble deretter fiksert i 4% formalin i 30 minutter og kjernekontra ble oppnådd med 4, 6-diamidino-2-fenylindol-dihydroklorid (DAPI, Sigma, St. Louis, MO) farging i en 1,5 mikrogram /ml oppløsning (5 min /RT). Til slutt, Dekk ble montert og deretter visualisert med laser scanning konfokalmikroskopi (LSCM, Olympus Optical Co. Ltd., Tokyo, Japan).
toksisitet av 7F5 @ Au /Fe3O4 MR Probe i dyrking av PC-3 celler
PC-3-celler med 93% -95% levedyktigheten (trypan blå-farging) ble sådd ut i 96-brønn plater (4000 celler /brønn) med 4 ml kulturmedium. Dagen etter 20 ul mAb 7F5 eller 20 mL mAb 7F5 @ GoldMag prob ble lagt inn i PC-3 cellesuspensjoner. I begge tilfeller vil den endelige konsentrasjonen av mAb 7F5 var den samme (0,2, 2, 4, 8 og 16 ug /ml, som hver n = 6). Cellene ble behandlet med forskjellige mAb 7F5 konsentrasjoner (fra mAb 7F5 løsning eller mAb 7F5 @ GoldMag) i 96-brønners plater i cellekultur-inkubator i 24 timer. Toksisiteten av ekvivalente mengder av GoldMag partikler sammenlignet med mAb 7F5 @ GoldMag ble evaluert i tillegg. Sluttkonsentrasjonen av GoldMag partikkel var de samme (2, 4, 8, 16, og 32 ug /ml, som hver n = 6). Den celleviabilitet (antall levende celler) ble målt ved trypan-blå-farging etter behandling 24 timer. Cellen hemming ble beregnet ved hjelp av formelen: celle hemming rate = (1- Npost /Npre) x 100%; hvor Npost er antall levende celler og Npre er antall celler i brønnene forbehandlet.
toksisitet av 7F5 @ Au /Fe3O4 MR Probe i Mus
Six-uke- gamle nakne mus (hann Bb /c-mus, som veide mellom 30 og 35 g, n = 35) ble anvendt til de toksisitetstester. Alle gruppene fikk en enkelt dose via intravenøs injeksjon. Tre grupper av mus (hver gruppe n = 5) fikk 7F5 @ Au /Fe
3O
4; tre grupper av mus (hver gruppe n = 5) som er mottatt IgG @ Au /Fe3O4 på et doser på 100, 200 og 300 pl henholdsvis (normalisert dose 1 mg Au /Fe
3o
4 med 50 pg antistoff i hvert ml i følgende eksperiment). Ytterligere kontrollgruppe mottok saltvannsinjeksjoner (300 ul, n = 5). Giftigheten av 7F5 @ Au /Fe3O4 eller IgG @ Au /Fe3O4 prober ble vurdert med flere indekser. For akutt giftighet ble dyrene observert for arrangementer som vitale tegn, psykisk, kosthold og aktivitetsnivå etter administrasjon av sonden i 96 timer. Systemisk toksisitet ble evaluert ved hjelp av de forandringer i dyrs kroppsvekter. Vekten og fysiske tilstand av alle musene ble overvåket i et tidsrom på 30 dager. Dyrene ble veid på dagen av sonden injeksjon og hvert 5 dager etterpå inntil 30 dager etter injeksjon.
Magnetic Resonance Imaging
Disse studiene ble utført ved hjelp av en klinisk 3.0T hele kroppen MR -systemet (Siemens Magnetom Trio, Erlangen, Tyskland). Systemet var i stand til å arbeide ved et maksimum slew rate på 200 tonn /m /ms og en maksimal stigning styrke på 40 mT /m. Integrert system kroppen spoler ble brukt for RF eksitasjon og en åtte-kanals klinisk hodet spiral ble benyttet for signalmottak.
In vitro MR av 7F5 @ Au /Fe3O4 Målrettet Cells
PC-3 celler og SMMC-7721 celler ble dyrket med 7F5 @ Au /Fe3O4 og IgG @ Au /Fe3O4 separat for 12 timer. Konsentrasjonene av 7F5 @ Au /Fe3O4 og IgG @ Au /Fe3O4 var 1 mg Au /Fe
3o
4 per 50 ug antistoff for hver 1 ml kulturmedium med 0,5 millioner celler. Etter 12 timer ble de høstede celler ble vasket 3 ganger med PBS. Celleprøver ble blandet med 1,5 ml 1% agarose i små sentrifugerør som inneholdt I) PC-3 + 7F5 @ Au /Fe3O4; II) PC-3 + IgG @ Au /Fe3O4; III) SMMC-7721 + 7F5 @ Au /Fe
3O
4; eller IV) SMMC-7721 + IgG @ Au /Fe3O4 med hver prøve inneholdt omtrent 5 x 10
5 merkede celler (hver gruppe, n = 8). Fast spin-ekko T1-vektet (T1W) og T2-vektet (T2w) MR-målinger ble utført ved hjelp av følgende parametere: repetisjon tid (TR) /ekko tid (TE) = 500/25 ms (T1W) og 4000/90 ms (T2w), synsfelt (FOV) = 156 × 156 mm
2; skive tykkelse = 2 mm; matrise size = 192 × 192.
In vivo MR av 7F5 @ Au /Fe3O4 Målrettet Svulster
PC-3 og SMMC-7721 tumorbærende mus ble injisert med enten 200 ul (1 mg Au /Fe
3O
4 med 50 mikrogram antistoff i hver ml) 7F5 @ Au /Fe3O4 via halevenen (PC-3 tumorbærende mus, n = 8; SMMC-7721 tumorbærende mus, n = 8), eller 200 pl IgG @ Au /Fe3O4 (hver, n = 8). Under MRI undersøkelser ble musene bedøvet med ketamin (80 mg /kg) via intraperitoneal injeksjon (IP). MR-undersøkelser ble utført før og 6, 12 og 24 timer etter injeksjonen. Etter lokalisering speider skanner, ble FSE T1W og T2w målinger utføres (T1W: TR /TE = 500/25 ms; T2w: TR /TE = 4000/90 ms, slice tykkelse = 3 mm, FOV = 56,25 x 100 mm
2; skive tykkelse /dekketykkelse = 2 /12,8 mm; matrise size = 72 × 128). Etter MR, ble musene avlivet via CO
2.
Vurdering av 7F5 @ Au /Fe3O4 Probe biodistribusjon
tumorvev ble høstet fra seks mus etter 7F5 @ Au /Fe3O4 probe infusjon ( 3 fra hver tumor-type) for histologisk analyse. Tumorvev ble frosset i oktober medium og i snitt på 5 um intervaller. For prøysser bluing farging ble disse delene inkubert i en 01:01 oppløsning av 10% vandig oppløsning av kaliumferrocyanid og 20% saltsyre i 30 minutter.
i ytterligere 24 mus ble anvendt for kvantitativ analyse av 7F5 @ Au /Fe3O4 og IgG @ Au /Fe3O4 probe distribusjoner (4 grupper, 6 mus /gruppe som har PC-3 eller SMMC-7721 svulster og mottar enten 7F5 @ Au /Fe3O4 og IgG @ Au /Fe3O4 probe infusjoner). Lever, milt og tumorprøver ble samlet fra hvert dyr ved 24 timer etter injeksjon. Disse vev ble fremstilt for induktivt koblet plasma-atom-emisjonsspektroskopi med et CCD-detektor. (ICP-AES, Varian, Palo Alto, CA) ved oppslutning av cellene med 25% saltsyre og deretter oppvarming av oppløsningen til en fast rest dannet. De karbonholdige materialer ble fjernet og faststoffet oppløst i 2% HNO
3 (salpetersyre). Spektrometeret Detekteringsbølgelengden ble satt til 238 nm for jern og kalibrert med tre forskjellige standardprøver (Fe valgt som spormetallelement for ICP-AES vurdering av sonde distribusjon gitt at Fe er prinsippet komponent i Au /Fe
3O
4 nanopartikler).
Anti-tumor effekt av Theragnostic Au /Fe
3O
4 MR Probe
15 dager etter tumorcelle implantasjon, 200 pl av 7F5 @ Au /Fe3O4 probe (PC-3 tumor-bærende mus, n = 15; SMMC-7721 tumor-bærende mus, n = 15) eller 200 pl av kontroll IgG @ Au /Fe3O4 probe (PC-3 tumorbærende mus, n = 15; SMMC-7721 tumor-bærende mus, n = 15) ble injisert via halevenen på dagene 0, 4 og 8. Vitale tegn, mental status, ble det observert diett og aktivitetsnivå for hvert dyr daglig tumor~~POS=TRUNC størrelsen~~POS=HEADCOMP ble målt i tre dimensjoner (lengde, bredde og høyde) med en skyvelære, og tumorvolumet ble beregnet ved bruk av tumorvolumet formel = 4 /3π x (lengde /2) x (bredde /2) x (høyde /2) [39] . Tumorvolumet ble målt på flere tidspunkter etter administrasjon av sonden (20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60 og 65 dager etter tumorcelle implantasjon, sonde infusjon på dag 15). Alle mus ble avlivet på dag 65.
Bildeanalyse og statistiske metoder
Bilde analysene ble utført ved hjelp av ImageJ (versjon 1.34s, National Institutes of Health, MD, USA). Region av interesse (ROI) ble trukket omfatter tverrsnitt av respektive ampuller eller muse svulster (ROI inkludert omtrent 30 voxel for hvert fantom hetteglass, 30 voxel for hver
in vitro
celle prøverør eller 40 voxel for hver svulst ) for å måle gjennomsnitts T2w signalintensitet (S
mean). Separat ROI ble trukket utsiden av røret eller innenfor et område fri for vev (tegnet ved konsistente posisjoner mellom gjentatte målinger) for å beregne relative støynivåer basert på standardavviket av bakgrunnssignalet (NSD). Disse beregningene ble brukt for å estimere den relative signal-til-støy-forhold (SNR) = S
bety /NSD for hver måling. For tumor-bærende mus ble disse målingene gjentatt for hvert MR-undersøkelse post-injeksjon; disse målingene ble også gjentatt for hver
in vitro
Au /Fe
3O
4 celleprøveglass.
Alle statistiske beregninger ble utført ved hjelp av SPSS programvarepakke (SPSS, Chicago , IL, USA). For systemiske toksisitetsstudier, for å ta hensyn til variasjoner i utgangskroppsvekt, ble tidsforløpet av kroppsvekt målinger for hvert dyr rapportert som en prosent av den opprinnelige utgangsvekten. Enveis ANOVA ble brukt til å sammenligne disse justert kroppsvekt indeksene over behandlingsgruppene ved hvert tidsintervall etter infusjon (Tukey post-hoc korreksjon, p 0,05 vurdert som statistisk signifikant). Deretter ble enveis ANOVA brukes til å sammenligne a) T2w SNR målinger fra
in vitro
prøvehetteglass som inneholder forskjellige cellelinjer og målretting delene og b)
in vivo
T2w SNR målinger i svulster på pre-infusjon og tre post-infusjonstidsintervaller (separat sammenligninger for PC-3 og SMMC-7221 musemodeller). Tilsvarende ble en-veis ANOVA anvendt for å sammenligne organspesifikke ICP-AES målinger av sonde-konsentrasjonen i PC-3 og SMMC-7721 tumor-bærende mus. Til slutt, for terapeutiske effektstudiene, ved hver post-infusjon observasjonsintervall, en t-test ble brukt for å sammenligne svulst volummålinger mellom behandlede og kontrolldyrene. (P 0,05 vurdert som statistisk signifikant)
Resultater
Immobilisering Effektivitet og spesifikk binding Assessment
frekvensen av antistoff-immobilisert kopling ble gradvis redusert med økende konsentrasjoner av mAb 7F5. Tilsetning av 60 ug av mAb 7F5 til en 1 mg prøve av Au /Fe
3o
4 nanopartikler ga et koblingsvirkningsgrad nær 83 ± 9%; således, for en 1 mg prøve, omtrent 50 ug av mAb 7F5 ble overflate-koblet til den Au /Fe
3o
4 nanopartikler. For å unngå skjevheter under senere
in vitro
og
in vivo
sammenligningsstudier, kobling av effektivitet ble også bestemt for det ikke-spesifikke antistoff IgG. Under lignende betingelser, IgG til Au /Fe
3o
4 nanopartikkelkoblingseffektivitet var ca. 71 ± 5% og krever således tilsetning av 80 pg IgG-protein for å oppnå en overflate-kopling på 50 pg IgG til tilsvarende 1 mg prøve av Au /Fe
3o
4 nanopartikler. Flowcytometri viste at den positive frekvensen av binding var 93,6 ± 8,2% for de 7F5 @ AU /Fe3O4 + PC-3 celler, mens den positive prisen var bare 4,2 ± 1,2% for 7F5 @ Au /Fe3O4 + SMMC-7721. Den positive frekvensen av binding var 5,7 ± 1,7% for IgG @ AU /Fe3O4 + PC-3 celler og 6,9 ± 2,1% for IgG @ Au /Fe3O4 + SMMC-7721 celler. Rød fluorescens ble observert i membranen og cytoplasma i 7F5 @ Au /Fe3O4 + PC-3-celler med LSCM (øverste rad i fig. 1) mens ingen rød fluorescens ble observert i 7F5 @ Au /Fe3O4 + SMMC-7721-celler (nederste rad i fig. 1). For IgG @ Au /Fe3O4 gruppe ble ingen rød fluorescens observert for både PC-3-celler og SMMC-7721 cellelinjer
Red fluorescens (7F5 @ Au /Fe3O4rpar;. Observert i membranen til 7F5 @ Au /Fe3O4 + PC-3-celler (øverste rad), mens ingen rød fluorescens ble observert i membran av 7F5 @ Au /Fe3O4 + SMMC-7721-celler (nederste rad). Celle kjerner ble farget blå i farge via DAPI (midterste kolonne). 7F5 @ Au /Fe3O4 fluorescens bilder og DAPI bilder er slått sammen i kolonnen helt til høyre. Scale bar, 10 mikrometer.
toksisitet av 7F5 @ GoldMag MR Probe i dyrking av PC-3 celler
toksisitet av 7F5 @ GoldMag MR Probe in vitro ble vist i figur S1 Giftigheten av mAb 7F5 eller 7F5 @ GoldMag ble demonstrert og cellen inhiberingsraten økte med økende mAb konsentrasjon,.. det er ingen statistisk signifikans i hver konsentrasjon av mAb 7F5 eller 7F5 @ GoldMag (p . 0,05 i hver konsentrasjon, fig S1A). Dessuten, når sammenlignet med 7F5 @ GoldMag gruppe, GoldMag partikkel alene påvirket ikke celleproliferasjon (p 0,05 i hver konsentrasjon, fig. S1B)
Giftig Theragnostic Au /Fe
3O
4 Probe i Mus
Akutt toksisitet:. Alle mus overlevde og ingen unormale reaksjoner i vitale tegn, mental status, kosthold , og aktivitetsnivå 96hrs etter administrasjon. Systemisk toksisitet i fig. 2: mus i kontrollgruppen fikk vekt jevnt i løpet av forsøket; mens vektøkning ble svakt redusert i dyr som fikk en infusjon av 7F5 @ Au /Fe3O4 ved doser på både 100 pl og 200 pl. ble ikke observert noen signifikant forskjell mellom 7F5 @ Au /Fe3O4 og saltvann gruppene på noe tidspunkt, og ingen av disse musene døde under 30-dagers observasjonsperiode etter infusjon. Ingen kliniske tegn på toksisitet som skjelving, redusert aktivitet, eller ustabile bevegelser ble observert. Lignende resultater ble observert for IgG @ Au /Fe3O4 behandlede dyr ved doser på 100 pl og 200 pl (data ikke vist). Men fra 20-dagers observasjonsintervall og framover, de dyr som mottok en 300 pl dose viste signifikant lavere kroppsvekten sammenlignet med de dyr i kontroll- og to lavere dosegruppene (p 0,05 for hver av disse normaliserte kroppsvektøkning sammenligninger). En mus i denne høydosegruppen døde på dag 30. Lignende resultater ble observert for den høye dosen IgG @ Au /Fe3O4 gruppe med to av disse mus døde på dag 25 og 27, henholdsvis. Fire mus fra høydose grupper (tre mus fra 7F5 @ Au /Fe3O4 gruppe og en fra IgG @ Au /Fe3O4 gruppe) viste kliniske tegn på toksisitet, inkludert skjelving, redusert aktivitet og ustabile bevegelser etter dag 20. Disse resultatene antyder økt systemisk toksisitet for disse dyrene som fikk en 300 mL dose av enten 7F5 @ Au /Fe3O4 eller IgG @ Au /Fe3O4 sonder.
In vitro
MR av 7F5 @ Au /Fe3O4 Målrettet Cells
In vitro
studiene viste signifikant større T2w SNR reduksjoner innenfor PC-3 + 7F5 @ Au /Fe3O4 celleprøver (tube i) sammenlignet med PC-3 + IgG @ Au /Fe3O4 celleprøver, SMMC-7721 + 7F5 @ Au /Fe3O4 prøver, og SMMC-7721 + IgG @ Au /Fe3O4 samples innen rør II, III og IV henholdsvis (fig. 3A). Prøvene i rør II, III og IV viste ingen tydelig merk SNR reduksjoner (sammenligninger ga ingen statistisk signifikante forskjeller fra kontroll, p 0,05 for hver sammenligning); den T2w SNR i PC-3 + 7F5 @ Au /Fe3O4 celleprøve (tube I) var betydelig lavere enn den T2w SNR innenfor prøverør II, III og IV i fig. 3B (p 0,05 for hver sammenligning)
Tube jeg. PC-3 + 7F5 @ Au /Fe3O4 celleprøve, tube II: PC-3 + IgG @ Au /Fe3O4 prøve; tube III: SMMC-7721 + 7F5 @ Au /Fe3O4 prøve; Tube IV: SMMC-7721 + IgG @ Au /Fe3O4 prøven. Kvantitativ T2w SNR målinger (B) for celle prøverør avbildet i (A).
In vivo
MR av 7F5 @ Au /Fe3O4 Målrettet Svulster
PC-3 tumorbærende mus administreres 7F5 @ Au /Fe3O4 nanopartikler vist markert nedgang i T2w svulst signalintensitet på 6, 12 og 24 timer etter infusjon (øverste rad i fig. 4). Ingen tydelig merkbar tumorsignalforandringer ble observert for SMMC -7721 tumorbærende mus ved en hvilken som helst av de tre etter infusjon tidspunkter (nederste linje i fig. 4). Histologiske analyser (. Prøyssisk blå flekker i figur 4) viste heterogen deponering av Au /Fe3O4 Au /Fe
3O
4 nanopartikler avbildet som punktat blå-farget foci i PC-3 tumorvev; Men disse forekomstene ble ikke observert innenfor SMMC-7721 tumorvev.
PC-3 tumorbærende mus administreres 7F5 @ Au /Fe3O4 nanopartikler vist markert nedgang i T2w svulst signalintensitet 6, 12 og 24 timer etter -infusion (øverste rad). Ingen tydelig merkbar tumorsignalforandringer ble observert for SMMC -7721 tumorbærende mus ved en hvilken som helst av de tre etter infusjon tidspunkter (nederste rad). Prøyssiske blå flekker (PB) viste at Au /Fe3O4 nanopartikler avbildet som punktat blå-farget foci i PC-3 tumorvev; disse forekomstene ble ikke observert innenfor SMMC-7721 tumorvev. Skala barer, 10 mm for MR og 50 mikrometer for prøyssisk blå flekker image.
Etter 7F5 @ Au /Fe3O4 infusjon, T2w SNR endringer i PC-3 svulster var statistisk signifikant sammenlignet med baseline pre -infusion tumor SNR-nivåer (p 0,05 for hver sammenligning), fig. 5A. Det ble observert flere betydelige reduksjoner i tumor SNR mellom 6 og 12 timer etter infusjon tidspunkter (p 0,001); samtidig bety T2w tumor SNR senere øket 24 timer etter infusjon (i forhold til tidligere måling ved 12 timer etter infusjon), dette funn var ikke statistisk signifikant gitt strøm prøvestørrelse (p = 0,145).
