Abstract
lymfeknutemetastaser indikerer dårlig prognose i spiserørskreft. For å forstå de underliggende mekanismene, de fleste studier så langt fokusert på å undersøke svulstene seg selv og /eller invaderte lymfeknuter. Men de forsømmer de potensielle hendelser innen metastatisk nisje, som forut for invasjonen. Her rapporterer vi den første beskrivelsen av denne forskriften hos pasienter på transkripsjonsnivå. Vi er fast bestemt transcriptomic profiler av fortsatt metastasefritt regionale lymfeknuter for to pasientgrupper: pasienter som klassifiseres som PN1 (n = 9, eksisterer metastatisk noder) eller pN0 (n = 5, eksisterer ingen metastatiske noder). Alle undersøkte lymfeknuter, også de fra PN1 pasienter, var fortsatt metastaser fritt. Resultatene viser at regionale lymfeknuter PN1 pasienter som skiller seg avgjørende fra de av pN0 pasienter – selv før metastasering har funnet sted. I pN0 gruppen ble observert tydelige immunresponsmønstre. I motsetning til dette, lymfeknuter PN1 gruppen oppviste en tydelig profil med redusert immunforsvar og redusert spredning, men økt apoptose, forsterket hypoplasi og morfologiske konverteringsprosesser. DKK1 var den mest betydningsfulle genet assosiert med de molekylære mekanismene som finner sted i lymfeknuter hos pasienter som lider av metastase (PN1). Vi antar at de to molekylære profiler observert utgjør ulike stadier av en progressiv sykdom. Til slutt foreslår vi at DKK1 kan spille en viktig rolle i de mekanismene som fører til lymfeknutemetastase
Citation. Otto B, Koenig AM, Tolstonog GV, Jeschke A, Klaetschke K, Vashist YK, et al. (2014) molekylære endringer i pre-metastatisk lymfeknuter av spiserørskreft pasienter. PLoS ONE 9 (7): e102552. doi: 10,1371 /journal.pone.0102552
Redaktør: Xin Yuan Guan, The University of Hong Kong, Kina
mottatt: 8 april 2014; Godkjent: 20 juni 2014; Publisert: 21.07.2014
Copyright: © 2014 Otto et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. Den forfatterne bekrefter at alle data som underbygger funnene er fullt tilgjengelig uten restriksjoner. Alle microarray data har blitt deponert i NCBI GEO offentlig register, og er tilgjengelig under deponeringsnummer GSE51021
Finansiering:. Dette arbeidet ble finansiert av Stiftung für Pathobiochemie und Molekulare Diagnostik, Deutsche Vereinte Gesellschaft für Klinische Chemie und Laboratoriumsmedizin E.V. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
I spiserørskreft (ESC), er lymfeknutemetastase assosiert med dårlig prognose. Under migreringen av tumorceller gjennom lymfekar og i løpet av deres målsøkende i lymfeknuter, disse tumorceller komme i nær kontakt til endotelceller og lymfeknute sinus. Svulstvekst utgjør i dag den viktigste grunnlaget for terapi utvalg. Men til tross for den høye prognostisk relevans lymphogenic metastaser, de molekylære mekanismene bak denne metastatisk veien er fortsatt stort sett ukjent
En rekke studier undersøkte de molekylære profiler av svulster [1] -. [4] og /eller . metastatiske lymfeknuter [5] Videre studier undersøkte lymphogenic metastaser i sammenheng med lymfatisk angiogenese [6] – [9] og chemokin forbundet [10] – [12] migrasjon. Det ble antatt at rettet migrering av esophageal carcinoma celler kan bli guidet av lokalt uttrykt chemokiner. [12] Og basert på disse funnene ville det være tenkelig at homing prosessen i lymfeknutene kan bli assistert av lektin-glykan-interaksjoner mellom svulsten celler og lymfe endotelceller. Hirakawa et al. [13] viste at i mus selv før metastasering, primære svulster (hudkreft) kan stimulere sentinel lymfeknute lymphangiogenesis. De foreslo at primære svulster kan være i stand til å forberede sin fremtid metastatisk nisje ved å produsere lymphangiogenic faktorer som kan megle deres effektiv transport til sentinel lymfeknuter.
Likevel, til forfatternes beste kunnskap er det ingen publiserte arbeider spesifikt undersøke de tidlige molekylære mekanismene i denne metastatisk nisje i pasienter -. mekanismer innenfor de ikke-påvirket lymfeknuter, som kan forplante eller undertrykke tidlig metastase hos pasienter som lider av ESC
Hensikten med denne studien var derfor å spesifikt undersøke disse tidlige forandringer i lymfeknuter før histopathologically påvisbare metastaser. Arbeidet har vært drevet av en hypotese om at før kreftceller metastasere til regionale lymfeknuter, viktige endringer må allerede funnet sted forplanter eller undertrykke homing prosessen. For å få innsikt i denne prosessen, samlet vi svulst regional og fjernt lymfeknuter fra pasienter som lider av ESC iscenesatt som pN0 (ingen metastatisk noder finnes) eller PN1 (metastatisk noder finnes). Alle lymfeknuter inkludert i analysen var metastase-fri – uavhengig av pasientens staging. Vi utførte mikromatriseanalyser og undersøkt mekanismene knyttet til genene forskjellig uttrykt mellom regionale og fjerne lymfeknuter av samme pasient.
Nøkkelen til vårt arbeid her er to funksjoner. Først alt analysert lymfeknuter uten unntak, selv de av PN1 pasientene var fortsatt fri for metastasering. For det andre har vi brukt prøver av pasienter som ikke gjennomgår noen neoadjuvant radio kjemoterapi og etablerte ytterligere prosedyrer som sikret svært høy prøvekvalitet.
Materialer og metoder
Generelt analyse arbeidsflyt
de inkluderte pasientene led av spiserørskreft og gjennomgikk en radikal thoraco-abdominal en-bloc esophagectomy inkludert lymfeknute disseksjon av øvre og nedre mediastinum (R0 reseksjon) uten neoadjuvant radio kjemoterapi. Vi inkluderte bare lymfeknuter fra pasienter iscenesatt som pN0 (regional lymfeknuter uten metastaser) eller PN1 (regionale lymfeknuter metastase til stede) og verifisert av histopatologi at lymfeknutene valgt for vår analyse var alle tumorcelle gratis. Vi har også bekreftet av immunohistologi at disse lymfeknuter var fri for mikrometastaser. Vi har isolert fra hverandre lymfeknute total RNA for microarray ekspresjon analyse. En paret t-test ble anvendt for identifikasjon av gener som er differensielt uttrykte mellom lokale og fjernt lymfeknuter og en funksjonell berikelse og nettverksanalyse ble utført. Deretter store kandidatene ble validert via real time PCR og DKK1 ble validert i tillegg via immunhistokjemi flekker.
Experiment design
Målet med arbeidet som presenteres her var å identifisere potensielle faktorer tilrettelegging og kjøring metastaser i lymfeknuter av pasienter som lider av spiserørskreft. For å muliggjøre slik forståelse eksperimentet design (Fig. 1) innlemmet to variabler av interesse.
Lymfeknuter på to forskjellige pasientgrupper som lider (PN1) eller ikke lider (pN0) fra lymfeknutemetastase ble undersøkt. Fra hver pasient regionale lymfeknuter (tilstøtende til tumor) ble sammenlignet for å fjerne lymfeknuter (referanse som grunnlinje). Nøkkelen til forsøket er at
Alle
undersøkte lymfeknuter, inkludert de av PN1 pasienter, ble sørget for å være fortsatt fri for metastaser samt mikrometastaser.
Først prøvene ble klassifisert i henhold til rektor status for pasienter som viser (PN1 gruppe) eller ikke-Exhibiting (pN0 gruppe) metastaser i regionale lymfeknuter. Sammenligningen av PN1 og pN0 pasienter bør fremheve de generelle forskjeller i regelverket som kan føre til eller hindre fra metastaser.
For det andre, to lymfeknuteprøver ble samlet inn fra hver pasient, en node ligger nær svulsten (regional ) og den andre noden fjernt til tumoren. Mens de fjerne noder fungert som referanseprøve de regionale noder ble undersøkt for transkripsjons forskrifter. Den parvise sammenligningen av tumor fjerne prøver med pasientspesifikke regionale noder skal avsløre de tidlige forskrifter potensielt følge av beliggenhet nær svulsten. I denne publikasjonen begrepet «oppregulering» er brukt for de gener og funksjoner som oppviser en høyere ekspresjon i de regionale lymfeknuter i forhold til den fjerne lymfeknuter. Omvendt er de gener og funksjoner som er redusert i de regionale lymfeknutene kalt «nedregulert».
Det er viktig å merke seg at alle noder undersøkte ble sørget for å være stille metastase fri, uavhengig av pasientene «PN1 /pN0 klassifisering og av plasseringen i forhold til tumoren. Dette bør tillate identifisering av tidlige endringer som skjer
før
til metastase homing
Etikk komité godkjenning pasienter samtykke
Denne studien ble utført i samsvar med gjeldende regelverk og ble godkjent av etikkomiteen, Tyskland Hamburg under stemme nummer PV3548. Pasienter skriftlig samtykke til å delta i studien ble samlet inn i samsvar med gjeldende regelverk.
Prøvemateriale
Totalt prøver fra 22 pasienter med spiserøret karsinom ble analysert, hvorav 14 prøve parene utstilt et tilstrekkelig utvalg kvalitet. For hver pasientprøve par av svulst nært og kreft fjerne lymfeknuter ble samlet for å redusere inter-individuelle forskjeller som kan oppstå på grunn av avvikende genetisk bakgrunn. Lymfeknuter ble umiddelbart dissekert på utvinning i drift rommet. Segmentene som er dedikert for den microarray ekspresjon analysen var direkte transportert i flytende nitrogen til laboratoriet for RNA-ekstraksjon. Den andre delen av lymfeknuter ble dyppet i parafin for klassifisering og diagnostisering.
Operasjon prosedyre
Etter histologisk diagnose av en spiserørskreft, pasienter med tidlig stadium lesjoner (pT1a) ble henvist til kirurgi enten hvis endoskopisk reseksjon var ufullstendig eller svulsten ble iscenesatt som pT1b. Pasientene ble henvist direkte til kirurgi hvis preoperativ staging var mistenkelig for enten muskulære veggen engasjement (CT2) eller spredning til lymfeknuter (CN1). Ingen pasienter ble sendt til neoadjuvant terapi.
Alle pasientene gjennomgikk median T-formet laparatomy og høyresidig torakotomi. For pasienter med krage anastomose en ekstra venstresidig cervicotomy til krage anastomosen ble utført. Hver pasient fikk en radikal en bloc esophagectomy med reseksjon av spiserøret, thorax kanalsystem, azygos vene, ipsilaterale pleura, og alle periesophageal vev i bakre mediastinum. Rekonstruksjon ble utført av magesonde eller tykktarm inter vanligvis med en høy intrathoracic eller livmorhals anastomose.
I tillegg er en standardisert to-feltet lymphadenectomy ble utført. Alle lymfeknuter ble systematisk samplet fra åtte steder: regional mediastinum, både i nærheten av tumoren og fjernt fra det; infraclavicular; magen (nedre mediastinalt); perigastric lymfeknuter (inkludert venstre og høyre perikardial); vanlige leverpulsåren lymfeknuter; og lymfeknuter på cøliaki stammen. Alle noder ble kartlagt av kirurgen i henhold til ordningen med American Thoracic Society som modifisert av Casson et al. [14] Alle resected prøvene ble vurdert av en erfaren patolog.
Postoperativ oppfølging ble gjennomført som en del av den vanlige ettervern. Pasientene ble sett på poliklinikken på 3 til 4 måneders intervaller for de første 2 årene, og ved 6-måneders intervaller etterpå. Oppfølging evaluering inkludert fysisk undersøkelse, vanlig brystet røntgen, ultralyd abdomen, endoskopi, endosonography, CT av brystkassen og magen, med PET-CT etter januar 2006 i utvalgte tilfeller, CEA og CA 19-9 svulst markør studier, og bein skanner . Når tilbakefall ble mistenkt, ekstra radiologisk, endoskopisk eller histologisk bekreftelse ble søkt.
Tilbakefall ble diagnostisert hvis påvist av biopsi eller utvetydige bevis på tumormasser (nylig vises metastaser eller lokalt residiv) med en tendens til å vokse i løpet av videre oppfølging og /eller oppfølging inntil døden. Tilbakevendende sykdom ble definert som enten lokoregionalt (forekommer i øvre del av magen eller mediastium) eller som fjernmetastaser.
Micrometastasis farging
Hematoxylin og eosin farging ble brukt for tumorcelle deteksjon for første diagnostisk trinn . Histologisk «tumor-free» lymfeknuter ble deretter screenet immunohistokjemisk ved hjelp av anti-cytokeratin antistoff AE1 /AE3 (Dako, Glostrup, Danmark) fortynnet 1:50 (v /v) av den biotin-streptavidin-metoden som beskrevet tidligere. [15] AE1 /AE3 er en blanding av to antistoffer som gjenkjenner basiske og sure CK på overflaten og i cytoplasma av alle epitelceller (unntatt parietale celler, hepatocytter, og overfladiske lag av plateepitel). Antistoffene reagerer ikke med mesenchymale vev, inkludert lymfoid vev [16].
Formalin fast og parafininnebygde deler av 5 til 6 um tykkelse ble skåret ved tre forskjellige nivåer i hver node og deparaffinized i henhold til standard histologiske teknikker og overført til glassplater som ble behandlet med 3-triethoxysilylpropylamin (Merck, Darmstadt, Tyskland). En del av prøven erholdt ved hvert nivå ble farget ved bruk av alkalisk fosfatase-anti-alkalisk fosfatase-teknikk i kombinasjon med den nye fuksin flekk (Sena, Heidelberg, Tyskland) for visualisering reaksjon [17].
Deler av normal tykktarmsslimhinnen fungerte som positiv farging kontroller og isotype-matchet, irrelevante murine monoklonale antistoffer tjente som negative kontroller (renset immunoglobulin mus myelom protein for IgG1, Sigma, Deisenhofen, Tyskland).
Glassene ble evaluert i en blindet prosedyre av to uavhengige etterforskere. Ved incongruent funnene en tredje etterforsker ble konsultert og en samtykkende vedtaket ble gjort. Minimal tumorcelleinvolvering i en lymfeknute som ble ansett for å være tumorfrie ved konvensjonell histologisk farging ble definert som tilstedeværelse av en til ti-positive celler i kroppen til noden.
Prøve fremstilling og rensing
Isolering av total RNA fra flytende nitrogen fryses lymfeknute prøver ble utført med Trizol fra Invitrogen i henhold til produsentens protokoll (Rev. dato 12. juni 2007) og ble renset etterpå med den Qiagen RNeasy-Mini Kit. Konsentrasjoner ble bestemt med en PeqLab Nanodrop fotometer og RNA kvalitet ved kapillær elektroforese ved hjelp av en Agilent Bioanalyzer 2100 System. Ut av de 22 prøve parene 9 par av pasienter med observert langt metastaser og 5 prøve par av pasienter uten langt metastase observert viste en RNA kvalitet tilstrekkelig for følgende analyse.
Microarray analyse
Microarray forsøkene ble utført ved hjelp av Affymetrix menneskelig hele genom GeneChips U133 Plus 2.0 (Affymetrix, Santa Clara, USA) ifølge produsentens protokoll. For å fremstille RNA for ekspresjon arrays cDNA-syntese med de foregående fotometrisk bestemmelse av RNA-konsentrasjonen ble utført. De følgende trinn ble utført ved anvendelse av 250 ng av total RNA for den første trådsyntese. Prøvepreparering innlemmet trinn for cDNA-syntese, rensing, syntese av den biotin-stemplet cRNA, transkripsjon in vitro, fragmentering, hybridisering og vasking og farging. Preparatet ble utført i henhold til en syklus protokollen bruker Genechip 3 «IVT Express Kit fra Affymetrix. For Hybridisering 12,5 ug fragmentert cRNA ble anvendt. Matriser ble inkubert i 16 timer i Affymetrix Hybidization Ovn 640 ved 45 ° C. Vasking og farging trinn ble utført halvautomatisk i Affymetrix lufthåndtering Station 450, enkelttrinn etter den Affymetrix en syklus Protokoll for standard arrays. Etter vask og farging arrays ble skannet med Affymetrix Genechip Scanner 3000 7G og kommandokonsollen programvare ved en bølgelengde på 570 nm og en pikselstørrelse på 1,56 mikrometer.
Statistisk analyse
Lymfeknuter fra begge pasientgrupper (pN0 og PN1) ble analysert uavhengig. Som fokus for dette arbeidet var tidlige endringer foregående metastaser, ble bare metastaser gratis lymfeknuter analysert. Tumor fjernt lymfeknute prøver ble brukt som referanse for de sammenkoblede regionale lymfeknuter.
Bakgrunn korreksjon og normalisering ble utført ved hjelp av RMA prosedyre og quantile normalisering. En paret t-test innenfor de to gruppene (pN0, PN1) ble utført, og en bootstrapping prosedyre ble utført for å justere for falske positive forskrifter. Som cutoff verdier en korrigert p-verdi på 0,05, en rå p-verdi på 0,01 og en signal-log-forholdet (SLR) av ± 0,7 ble brukt til å bestemme topp-regulerte gener.
Etter differensial genekspresjon analysen vi utførte gen sett berikelse og nettverksanalyse med Oppfinnsomhet Pathway Analysis programvare (Oppfinnsomhet Systems, versjon 162830). For analyse den korrigerte p-verdi cutoff ble satt til en mindre streng verdi på ± 0,1 for å tillate inkorporering av mer subtile forandringer.
Validation via RT-PCR
Tolv av de fast kandidat gener ble validert via RT-PCR ved hjelp av tre tekniske replikater per prøve. RT-PCR ble utført med 96-brønners plater på StepOne Plus Real Time PCR System fra Applied Biosystems. For hver prøve ble 2 ul med en konsentrasjon på 5 ng /ul ble anvendt. For å ta høyde for svingninger i prøvekonsentrasjon Beta-2-mikroglobulin (B2M) ble tatt som rengjøring referanse. For bestemmelse av forskriften om ekspresjonsnivået middelverdien av de tre tekniske gjentak «delta-Ct-verdier ble beregnet. Betydningen av endringene ble bestemt ved hjelp av en paret t-test mellom tumor nære og kreft fjerne gjennomsnittlig delta-Ct-verdier innenfor hver gruppe (pN0, PN1).
DKK1 Immunohistochemistry
Immunohistochemistry ble utført på parafinsnitt av de undersøkte lymfeknuter bruker polyklonale antistoff mot DKK1 (1:100, Abcam, # ab61034). For immunhistokjemiske deteksjon seksjonene ble deparaffinized, utvannet, og forbehandlet med 0,1% pronase, i 10 minutter for enzymatisk antigen avsløring. Etter inkubering i 3% hydrogenperoksid i 15 minutter for å blokkere endogen peroksidase-aktivitet og inkubering med 5% BSA i 30 minutter for å blokkere ikke-spesifikk antistoffbinding primært antistoff ble anvendt. Immunhistokjemisk farging ble utført over natten ved 4 ° C. Et biotinylert sekundært geite-anti-kanin-IgG (1:200, Dako Cytomation) ble anvendt, fulgt av inkubasjon med et streptavidin /HRP (1:200, Dako Cytomation) som en tredje antistoff. Peroxydaseaktivitet ble oppdaget ved hjelp av DAB som kromogen substrat (Dako Cytomation). Seksjoner ble kontra med hematoxylin, dehydrert, og montert. Bilder ble samlet inn på et Zeiss Mirax MIDI lysbilde skanner (Zeiss) og bildene ble tatt ved hjelp av Pannoramic Viewer-programvaren.
Resultater
metastasefritt regionale lymfeknuter varierer mellom PN1 og pN0 pasienter på transcriptomic nivå
Vi spurte om a) den metastatisk nisje i lymfeknuter kan bli påvirket selv før metastaser har funnet sted, og hvis b) fortsatt metastase-frie lymfeknuter PN1 pasienter kan være mer på randen av metastatisk invasjon enn de av pN0 pasienter og hvis c) derfor disse «PN1» lymfeknuter kan vise forskjellige transkripsjonsdereguleringer i forbindelse med nisje forberedelse
Vi inkluderte kreft regionale lymfeknuter fra 14 spiserørskreft pasienter (n = 9 PN1 pasienter.; n = 5 pN0 pasienter) for å undersøke genuttrykket i potensialet metastatisk nisje. I tillegg samlet vi en sammenkoblet svulst fjernt lymfeknute fra hver pasient for å tjene som referanse for de regionale noder (Fig. 1). Etterpå ble de analysert på transcriptomic nivå av mikromatriseteknologi.
Nøkkelen til arbeidet som presenteres her er at alle noder undersøkte ble bekreftet å være histopathologically og immunohistologically metastase og micrometastasis-fri, uavhengig av pasientenes PN1 /pN0 klassifisering og av plasseringen i forhold til tumoren. Dette bør tillate identifisering av tidlige endringer som skjer
før
til metastase homing. Informasjon om pasientenes alder, kjønn, histologi eller klassifikasjoner er gitt i tabell S1.
For å identifisere potensielle pre-invasive endringene vi sammenlignet de regionale lymfeknuter med de fjerne lymfeknuter med paret T-test i to grupper (pN0, PN1). Tumor fjerne lymfeknuter fungert som referanse for de regionale noder, slik at opp-regelverket skildre disse genene med et høyere uttrykk nivå i de regionale noder og ned-forskrifter henholdsvis disse genene med et lavere uttrykk nivå. Den T-test ble etterfulgt av en bootstrapping fremgangsmåte for å ta hensyn til flere testing. Som cutoff verdier en korrigert p-verdi på 0,05, en rå p-verdi på 0,01 og en signal-log-forholdet (SLR) av ± 0,7 ble brukt til å bestemme topp-regulerte gener. De mest betydningsfulle kandidatene identifisert er vist i tabell 1, er fullstendig statistikk gitt i tabell S2.
Bruk av disse tersklene vi identifiserte 173 transkripsjoner (128 gener) betydelig regulert mellom regionale og fjerne lymfeknuter pN0- klassifiserte pasientene. Flere av disse genene ble assosiert med immunrespons (for eksempel CD64, CD32,
FPR1 Hotell og
FPR2
, [18]
IGHG1
,
IL1R2
CCL23
,
MSR1
,
C5AR1
,
LILRA5
, [19] eller
LILRB2 product: [20]). Interessant et par av kreft og metastase forbundet gener ble deregulert i tillegg (for eksempel
L1CAM plakater (CD171), [21]
EREG
, [22], [23]
NOVA1
,
HPR
, [24] eller
LAMC2 product: [25], [26]). Epiregulin, f.eks, er en angiogen faktor som kan forplante metastase ved at kreftceller til å bryte lunge endotelceller barrierer og i sin tur ved å slippe dem inn i sirkulasjonssystemet [22], [23].
I motsetning identifiserte vi 134 feilregulert transkripsjoner (109 gener inkludert
IGF1
,
DKK1
,
PRIMA1 Hotell og
LTF
) i de regionale lymfeknutene PN1-klassifiserte pasientene. Blant de genene pro-proliferativ og anti-apoptotiske molekyler ble nedregulert – for eksempel
IGF1 Hotell og
LTF
som fungerer gjennom regulering av AKT signalveien [27] og ERK1 /2 pathway [28] hhv. PRIMA1 modulerer CXCR4 uttrykk [29] -. Et molekyl som allerede har blitt beskrevet å korrelere sterkt med økt lymfatisk metastase [11], [12], [29]
Spesielt
DKK1
utstilt viktigste deregulering (2 ganger endring, p-verdi på 0,0029). Genet ble klart nedregulert i de regionale lymfeknutene PN1 pasienter. DKK1 er en WNT pathway inhibitor som har vist seg å være av prognostisk betydning i forskjellige tumortyper slik som brystcancer, lungecancer, myelom men også i spiserørskreft [30] -. [38] I tillegg DKK1 ble rapportert å være høyere hos serum fra MGP pasienter [37].
Vi validert 12 av de mest betydningsfulle gener via RT-PCR (fig. 2). For fem av disse genene (
ISL1
,
LAMC2
,
NOVA1
,
EREG
,
L1CAM
) regulerings tendenser og Styrkene ble bekreftet skjønt p-verdier bestemt i den PCR-analyse lå mellom 0,08 og 0,15, sannsynligvis på grunn av den lille prøvestørrelsen. Syv gener (
IGF1
,
IGFBP5
,
DKK1
,
LTF
,
TBX3
,
FOXG1
LILRA
) kan bli validert som viser en signifikant p-verdi under 0,05. Høyeste signifikans (p-verdi på 3 * 10e-4) ble observert igjen for
DKK1 product: (se tabell S3).
Viste signal-log-prosenter av de regionale lymfeknuter i sammenligning til tumor fjerne lymfeknuter (referanse) for et valgt sett av topp regulerte gener.
Ved tidspunktet for oppfølgingsanalyse fem PN1 pasientene døde, samt en pN0 pasient. Sistnevnte pasient hadde utstilt lungemetastaser i en oppfølgingsundersøkelse. Interessant denne pasienten utgjør en avvikende i forhold til
DKK1
uttrykk viser en nedregulering i de regionale lymfeknuter.
Resultatene beskrevet i dette avsnittet viser at disse metastasefritt PN1 lymfeknuter utstillings genet regelverket klart forskjellige fra de i pN0 lymfeknuter. Videre de indikerer at DKK1 kan være signifikant assosiert med de underliggende mekanismene.
De funksjonelle mønstre i pN0 og PN1 prøvene er tydelig, men tett koblet
Basert på disse funnene vi spurte om de observerte regelverket faktisk skildre ulike molekylære mekanismer – eller bare ulike representanter for de samme mekanismene. Vi utførte derfor genet sett berikelse og nettverksanalyse.
Fordi utvalgsstørrelsen som brukes i vårt arbeid er ganske liten p-verdien fordelingen påvirkes i T-test. Tar hensyn til dette og for å tillate innføring av mer subtile endringer, som likevel kan legge til det store bildet, bestemte vi oss for å bruke en mindre strenge p-verdi på ± 0,1 for å identifisere regulerte gener som skal inkluderes i analysen.
Vårt analyse viste slående forskjellige profiler (fig. 3) som karakteriserer de tumor tilstøtende lymfeknuter av PN1 og pN0 pasienter. Resultatene viste en klar aktivering av immunresponsmekanismer i pN0 gruppen. De regulerte gener ble assosiert med økt betennelsesreaksjon, antigen presentasjon, redusert cellevekst, immun celle sporing og celle-til-celle signalisering, mens spredning og kreft-assosiert mekanismer ble redusert.
Viste er biologiske og molekylære funksjoner og underfunksjoner knyttet til gener reguleres i regionale lymfeknuter i forhold til de fjerne lymfeknuter (referanse) av PN1 eller pN0 pasienter. Singelen gjennomsiktig sirkler skildre de viktigste funksjonene, den fargede (red: aktivert, blå: inaktivert) sirkler innenfor skildre betydelig beriket underfunksjoner (f.eks innen PN1 celledød sirkel: «apoptose av leukemiceller» – rød, eller «celle overlevelse «- blå). Blå underfunksjoner har en sterk forutsigelse for å bli inaktivert, røde underfunksjoner som skal aktiveres. Jo dypere farge jo mer pålitelig (z-score) er aktiverings statens anslag. Størrelsen på sirklene øker med signifikans (p-verdi) av genet liste tilknytning til underfunksjoner. Analysen ble utført med Oppfinnsomhet Pathway Analysis programvare. Det kan være tydelig sett at metastasefritt regionale lymfeknuter PN1 pasienter viser en helt annen regulering-mønster som de av pN0 pasienter.
I motsetning regionale lymfeknuter PN1 pasienter viste en reduksjon av immun respons forbundet mekanismer (fig. 3). I tillegg ble redusert spredning, så vel som redusert vev struktur, morfologi og utvikling observert på den ene siden – og økt apoptose og hypoplasi på den andre. Tidsmessig er det bør forventes at disse lymfeknutene ville være nærmere poenget med metastatisk invasjon, så det var overraskende at immunresponsen mønsteret ble nedregulert.
Videre analyse spådd en inaktivering av β-catenin og nedstrøms regulatorer (fig. 4a). Blant de store β-catenin mål,
VEGFA
,
CCND1
,
MSX1
,
IGFBP5 og DKK1
viste en redusert uttrykk på microarray. Selv om bare basert på statistiske sannsynligheter, er prediksjon bemerkelsesverdig fordi aktiv β-catenin er nødvendig for
DKK1
uttrykk. [39] Den potensielle aktivitet av β-catenin derfor kan korrelere med den observerte nedregulering av
DKK1
.
nettverksanalyse ble utført ved hjelp av oppfinnsomhet Pathway Analysis programvare. a) mekanistisk nettverk av β-catenin nedstrøms regulatorer Viser spådd aktivering staten og den regulatoriske forhold (aktivering eller hemming) mellom de enkelte regulatorer. β-catenin og en rekke nedstrøms regulatorer er spådd til å bli inaktivert. b) Analysen viser en tett forbindelse mellom genene regulert i PN1 prøvene (lys grå noder), og de som er regulert i pN0 prøvene (mørk grå noder) forbundet av ERK1 /2 og DKK1 innebygd i nettverket.
For ytterligere å undersøke hvordan relaterte underliggende molekylære stier er, vi inkluderte genuttrykk forskrifter observert i PN1 prøver (109 gener) og i pN0 prøver (128 gener) i en felles liste og utført nettverksanalyse. Interessant, til tross for den klare forskjell i molekylmekanismen profiler mellom PN1 og pN0 prøver, analyse viste at flere av de involverte gener (28/128 pN0 gener; 19/109 PN1 gener) syntes å være tett forbundet (figur 4b.) På tvers av både grupper -. med DKK1 integrert i nettverket
tatt sammen disse observasjonene tyder på at metastasefritt regionale lymfeknuter PN1 pasienter er allerede underlagt molekylære prosesser forskjellige for de av pN0 pasienter – selv om metastase ennå ikke har funnet sted i disse nodene. I tillegg en involvering av
DKK1
regulering via Wnt /β-catenin veien virker mer troverdige. Dette blir sagt, de molekylære nettverk bak disse ulike mønstre kan være koblet. I ESC pasienter lymfeknutemetastase er bare et spørsmål om tid, med mindre en betimelig tumorreseksjon utføres. Derfor synes det sannsynlig at de observerte transkripsjons mønstrene ikke korrelerer med to helt forskjellige mekanismer, men heller viser to tidspunkter i en voksende prosess.
DKK1 kan observeres i forskjellige understrukturer av lymfeknute og i fartøyets endotelceller
på grunn av betydningen av
DKK1
i våre resultater og fordi DKK1 har allerede vist seg å være prognostisk for utfallet av en rekke ondartede kreft enheter [30] – [38] vi fokusert på dette molekylet i immunhistokjemiske validering. Vi farget parafinsnitt av de undersøkte lymfeknuter ved hjelp av en polyklonale antistoff mot DKK1 og kontra seksjonene med hematoksylin. Den immunhistokjemisk farging viste en tendens til å bli mindre DKK1 uttrykkes i regionale PN1 pasientenes lymfeknuter (fig. 5a). I DKK1 positive lymfeknuter dets ekspresjon kunne klart observert i subkapsulær sinus og i noen tilfeller som strekker seg inn i det mellomliggende sinus og trabeculae (Fig. 5b). Videre i et par prøver DKK1 uttrykk kunne observeres i fartøyet endotelceller (Fig. 5c).
Lymfeknutene ble farget ved hjelp av en polyklonale antistoff mot DKK1 (1:100, Abcam, # ab61034) og kontra med hematoxylin. a) representant DKK1 negative lymfeknute. Skala: 200 mikrometer. b) Representant DKK1 positiv lymfeknute. Subkapsulær sinus er merket med (I) og mellom sinus og trabeculae med (II). Skala: 200 mikrometer. c) DKK1 positive vaskulære endotelceller. Skala:.. 100 mikrometer
Diskusjoner
Mens flere kreftforekomst falt i USA og andre vestlige land de siste tiårene forekomsten av esophageal adenokarsinom har økt [ ,,,0],40] en parametere som indikerer sykdomsprogresjon er svulstvekst som i dag danner grunnlaget for behandlingen valg.
