Abstract
Bakgrunn
Deregulering av
EGFR
signalering er vanlig i ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) og denne erkjennelse som førte til utviklingen av tyrosinkinaseinhibitorer (TKI) som er meget effektive i en undergruppe av NSCLC. Mutasjoner av
EGFR plakater (m
EGFR
) og kopiantall gevinster (CNG og står) på
EGFR plakater (g
EGFR
) og
HER2
(g
HER2
) har blitt rapportert å forutsi for TKI respons. Mutasjoner i
KRAS plakater (m
KRAS
) er assosiert med primær resistens mot TKI.
metodikk /Principal Funn
Vi har undersøkt sammenhengen mellom mutasjoner, CNG og står og respons på TKI i et stort panel av NSCLC-cellelinjer. Gener studert var
EGFR
,
HER2
,
HER3 HER4
,
KRAS
,
BRAF Hotell og
PIK3CA
. Mutasjoner ble påvist ved sekvensering, mens CNG og står ble bestemt ved kvantitativ PCR (qPCR), fluorescens in situ hybridisering (FISH) og rekke komparativ genomisk hybridisering (aCGH). IC50 verdier for TKI gefitinib (Iressa) og erlotinib (Tarceva) ble bestemt av MTS analysen. For noen av de sju gener testet, mutasjoner (39/77, 50,6%), kopinummer gevinster (50/77, 64,9%) eller enten (65/77, 84,4%) var hyppig i NSCLC linjer. Mutasjoner av
EGFR product: (13%) og
KRAS plakater (24,7%) var hyppig, mens de var mindre hyppig for de andre gener. De tre teknikker for å bestemme CNG var godt korrelert, og qPCR data ble brukt for videre analyser. CNG og står relativt hyppig for
EGFR Hotell og
KRAS
i adenokarsinomer. Mens mutasjoner var stort sett gjensidig utelukkende, CNG og står ikke var.
EGFR Hotell og
KRAS
mutant linjer ofte demonstrert mutant allel spesifikk ubalanse dvs. mutant formen var vanligvis i stort overskudd i forhold til villtype form. På en molar basis, følsomhet for gefitinib og erlotinib var høyt korrelert. Multivariate analyser førte til følgende resultater:
1. m
EGFR Hotell og g
EGFR Hotell og g
HER2
var uavhengige faktorer knyttet til gefitinib følsomhet, i synkende rekkefølge av betydning.
2. m
KRAS
var assosiert med økt in vitro resistens mot gefitinib.
Konklusjon /betydning
Vår in vitro studier bekrefter og utvide kliniske observasjoner og demonstrere den relative betydningen av både
EGFR
mutasjoner og CNG og står og
HER2
CNG og står i følsomhet for TKI
Citation. Gandhi J, Zhang J, Xie Y, Soh J, Shigematsu H, Zhang W, et al. (2009) Endringer i Gener av EGFR signalveien og deres forhold til EGFR tyrosinkinasehemmer følsomhet i Lung Cancer Cell Lines. PLoS ONE 4 (2): e4576. doi: 10,1371 /journal.pone.0004576
Redaktør: Alfred Lewin, University of Florida, USA
mottatt: 16 september 2008; Godkjent: 18 desember 2008; Publisert: 24 februar 2009
Copyright: © 2009 Gandhi et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Funding var mottatt fra Specialized Program for fremragende forskning i Lung Cancer (P50CA70907) og Early Detection Research Network, National Cancer Institute, Bethesda, Maryland (U01CA084971). Midler fra begge tilskudd ble brukt for lønn støtte og for gjennomføring av analyser. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser. Dr. Gazdar er en betalt konsulent /foreleser for Astrazeneca PLC. Dr. Garcia mottar kontakt Forskning Funding 10.000 fra Astrazeneca, Genentech og OSI; Honorarium 10 000 fra Roche. Dr. Minna mottar forskningsstøtte fra Astrazeneca PLC.
Innledning
Lungekreft er den ledende årsak til alle kreftdødsfall på verdensbasis [1]. Til tross for de siste fremskritt i diagnose og multimodalitet behandling for lungekreft, fortsatt prognosen dårlig med 5-års overlevelse på bare 16% for alle stadier [2].
Lungekreft er preget av opphopning av flere genetiske og epigenetiske endringer slik som somatiske mutasjoner og genkopitallet gevinst eller begge deler, som resulterer i aktivering av onkogener eller inaktivering av tumorsuppressorgener [3]. Epidermal vekstfaktor reseptor (
EGFR
) deregulering har blitt observert i flere krefttyper, inkludert ikke-småcellet lungekreft (NSCLCs) [4]. Hirsch et. al. identifisert hyppig
EGFR
protein i løpet av uttrykket (62%) i NSCLCs av plateepitelkreft og adenokarsinom subtyper [5].
EGFR
løpet uttrykk er ofte forbundet med alvorlig prognose [6]. Den reseptor-tyrosinkinase (RTK) superfamilien av celleoverflatereseptorer fungerer som mediatorer for cellesignalisering av ekstra-cellulære vekstfaktorer. Medlemmer av erbB familien av RTK inkludert
EGFR (HER1 /ERBB1)
,
HER2 (ErbB2 /EGFR2)
,
HER3 (ErbB3 /EGFR3) Hotell og
HER4 (ErbB4 /EGFR4)
har fått mye oppmerksomhet gitt sin sterke tilknytning til ondartet spredning.
RAS /MAPK og PI3K /AKT banene er store signalnettverk som knytter
EGFR
aktivering til celle proliferasjon og overlevelse [7]. Som diskutert nedenfor,
EGFR
signalveien gener er blitt rapportert å være mutert i NSCLC. Avhengig av geografisk plassering,
EGFR Hotell og
KRAS
mutasjoner har blitt identifisert i -10% -30% av NSCLCs [3], [8].
EGFR
mutasjoner er uavhengig assosiert med adenokarsinom histologi, østasiatisk etnisitet, aldri røykestatus og kvinnelige kjønn. Mutasjoner av
KRAS
også målrette adenokarsinom histologi, men ellers skiller seg fra
EGFR
mutasjoner fordi de er relativt sjeldne i Østasiater og forekommer oftere hos menn og røykere [9]. Mindre vanlig, har somatiske mutasjoner også blitt funnet i andre
EGFR
pathway gener inkludert
HER2 product: (ca. 2%) [10],
HER4 product: (ca. 2%) [ ,,,0],11],
BRAF
(ca. 2%) [12], og
PIK3CA plakater (~4%) [13], [14].
genkopitallet gevinster (CNG og står) på grunn av fokal amplifikasjon eller kromosomal polysomy, er en av de andre hovedmekanismer for onkogen aktivering [15]. Lockwood et al. identifiserte flere komponenter i
EGFR
pathway signale ble ofte forsterket og over uttrykt i NSCLC. Interessant, de fant også at
EGFR
pathway genamplifisering var hyppigere i adenokarsinom subtype av NSCLC.
På grunn av den hyppige deregulering av
EGFR
pathway gener i NSCLC, EGFR ble en av de første rasjonelt utvalgte molekyler for målrettet terapi. Mens innledende målrettede metoder anvendes monoklonale antistoffer som blokkerer den ligand-reseptor-interaksjon, har nyere fremgangsmåter som anvendes lavmolekylære reversible tyrosinkinaseinhibitorer (TKI). Tyrosinkinaseaktiviteten av
EGFR
er nødvendig for de biokjemiske reaksjoner som induseres av denne reseptoren [7], [16], [17]. To TKI, gefitinib (Iressa, Astrazeneca) og erlotinib (Tarceva, Genentech) har vært mye brukt i behandling av avansert eller residiverende NSCLC. Svarene ble registrert i undergrupper, særlig østasiatisk etnisitet, kvinnelig kjønn, aldri røykestatus og adenokarsinom histologi [18], [19], [20]. Deretter
EGFR
mutasjoner ble identifisert i tyrosin kinase domene, og forutsagt respons på TKI i samme undergruppe av pasienter [21], [22], [23]. Ifølge en meta-analyse av 1170 pasienter, mer enn 70% av NSCLCs med
EGFR
mutasjoner svart på TKI, mens 10% av svulster uten
EGFR
mutasjon svarte [24]. Men videre studier indikerte at andre enn faktorer
EGFR
mutasjoner kan spille en rolle i å bestemme respons og overlevelse etter TKI behandling.
EGFR
genkopitallet gevinst var forbundet med betydelig forbedret TKI følsomhet og overlevelse i en stor uselektert studie med hensiktsmessige kontroller [25]. I tillegg har andre medlemmer av
EGFR
familie dvs.
HER2 product: [26] og
EGFR3 product: [27] kan være viktige faktorer involvert i TKI følsomhet. En ytterligere kompleksitet er klinisk observasjon at somatiske mutasjoner av
KRAS
gi iboende motstand mot TKI [28].
For ytterligere å forstå forholdet mellom TKI følsomhet og deregulering av
EGFR
pathway gener, undersøkte vi mutasjonen og kopiere antall status på syv av disse genene (
EGFR
,
HER2
,
HER3
,
HER4
,
KRAS
,
BRAF
, og
PIK3CA
) i et stort panel av lungekreftcellelinjer og korrelert dataene med in vitro følsomhet for TKI.
Materialer og metoder
tumorcellelinjer
Vi studerte totalt 112 cellelinjer som består av 77 NSCLC og 32 småcellet lungekreft (SCLC) og tre linjer fra små cellekreft ved ekstrapulmonal sider (ekstrapulmonær små cellekreft, ExPuSC) [29]. Alle bortsett fra tre av disse cellelinjer ble etablert av forfatterne [30] på ett av to steder. Cellelinjer initiert ved NCI har prefikset NCI-H mens linjene etablert ved UT Southwestern har prefikset HCC. NCI-H3255 ble hentet fra Dr. Bruce Johnson (Lowe Senter for Thoracic Oncology, Dana-Farber Cancer Institute, Boston, MA) [22]. PC-9 (opprinnelig fra Tokyo Medical University, Tokyo, Japan) ble oppnådd fra Dr. Bert Vogel (Johns Hopkins University School of Medicine, Baltimore, MD). Calu-3 ble kjøpt fra American Type Culture Center (Manassas, Virginia). Vi har også undersøkt åtte udødeliggjort menneskelige bronkial epiteliale cellelinjer (HBECs, HBEC1KT, HBEC3KT, HBEC4KT, HBEC5KT, HBEC17KT, HBEC30KT, HBEC31KT og HBEC34KT), som ble initiert av oss [31].
De fleste av tumorcelle linjene~~POS=HEADCOMP ble opprettholdt i RPMI1640 supplert med 5-10% føtalt bovint serum (FBS). Noen cellelinjer ble dyrket i ACL4 (for NSCLC-linjer) og Hites (for SCLC linjer) supplert med 5% FBS. Alle HBEC cellelinjer ble opprettholdt i keratinocytt-SFM (Invitrogen, Carlsbad, CA) med bovint hypofyseekstrakt (BPE) og rekombinant epidermal vekstfaktor (EGF) [31]. Alle cellelinjer ble inkubert ved 37 ° C i en fuktet atmosfære med 5% CO
2.
genetiske fingeravtrykk av hver cellelinje ble oppnådd (1,2 Powerplex system, Promega, Madison, WI) og hvert -cellelinjen hadde en unik genetisk profil som var identisk med profilene oppnådd fra American Type Culture Collection.
DNA og RNA-ekstraksjon
Genomisk DNA ble erholdt fra cellelinje tene ved standard fenol-kloroform (01:01) ekstraksjon etterfulgt av etanolutfelling [32] eller ved å bruke DNeasy Tissue Kit (Qiagen, Valencia, CA). Totalt RNA ble oppnådd fra cellelinjer ved bruk av RNeasy Mini Kit Plus (QIAGEN). cDNA ble fremstilt som beskrevet tidligere [14].
gensekvensering
DNA-sekvensering og mutasjonsanalyse for
EGFR plakater (eksoner 18-21),
HER2
(eksoner 19 og 20),
KRAS
(kodon 12, 13 og 61),
BRAF
(eksoner 11 og 15) og
PIK3CA plakater (eksoner 9 og 20) ble gjort som rapportert av oss tidligere [10], [14], [32].
HER3
(eksoner 18-21) og
HER4 plakater (exons18-23) mutasjonstatus ble analysert ved PCR-amplifisering av genomisk DNA eller cDNA og direkte sekvensering av PCR-produkter [10]. De mutasjoner i disse genene ble bestemt ved hjelp av PCR-primerne som angitt (tabell S6). Alle PCR ble utført i 25 pl volum inneholdende 100 ng av DNA ved bruk HotStarTaq DNA-polymerase (Qiagen Inc., Valencia, California). DNA ble amplifisert for 32 til 34 sykluser ved 95 ° C i 30 sekunder, 62 ° C til 68 ° C i 30 sekunder og 72 ° C i 30 sekunder, etterfulgt av 7 minutters forlengelse ved 72 ° C. Alle PCR-produktene ble inkubert ved bruk av eksonuklease I og alkalisk rekefosfatase (Amersham Biosciences Co., Piscataway, NJ) og sekvensert direkte ved hjelp av Applied Biosystems PRISM fargestoffterminatorsyklussekvenseringsmetode (Perkin-Elmer Co., Foster City, CA). Alle mutasjoner ble bekreftet av uavhengige sekvensering i begge retninger.
Kopier nummer evaluering
Kopier nummer gevinster kan bli vurdert av en rekke metoder. For kliniske prøver, blir fluorescens in situ hybridisering (FISH) ofte brukt som den kan diskriminere mellom tumor og ikke-maligne celler. Laboratoriestudier av tumorcellelinjer (som er fri for ikke-maligne celler) ofte benytter kvantitativ PCR (qPCR). En alternativ metode er matrisen komparativ genomisk hybridisering (aCGH). Fordi direkte sammenligninger av disse metodene har sjelden blitt rapportert [33], benyttet vi alle tre metodene.
Sanntids qPCR
Gene kopiantall ble bestemt ved hjelp av sanntids kvantitativ PCR ansette Chromo4 PCR-system (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). For å bestemme kopiantallet av et målgen, anvendte vi kontroll gener lokalisert på samme kromosom som målgenet (tabell S6). De resulterende forhold ble sammenlignet med tilsvarende forholdstall fra diploide celler (middelverdiene for de åtte HBEC cellelinjer. TaqMan metodikk ble anvendt bortsett fra
PIK3CA product: [14]. Primere og prober ble valgt av TaqMan Primer Express ™ 1.5 (Applied Biosystem, Foster City, CA). primere ble innkjøpt fra Invitrogen og prober fra Biosearch Technologies (Novato, CA). Sekvensen av primere og prober er vist i tabell S6. Standardkurver kurver~~POS=HEADCOMP ble konstruert med serielle fortynninger av spesifikke PCR-produktene. forsterknings mikser (25 ul) inneholdt prøve-DNA (20 ng), 10 x TaqMan-buffer (2,5 pl), 200 uM dNTP, 1,25 U Hotstar Taq ™ DNA polymerase, 200 nM hver primer og 100 nM sonde. de varme veksling består 5 min ved 95 ° C og 40 sykluser ved 95 ° C i 15 s og 60 ° C i 30 sek. Alle prøvene ble analysert in triplo. para~~POS=TRUNC C
t er definert som den fraksjonelle syklus nummer ved hvilken fluorescensen dannet ved spaltning av sonden passerer en fast terskel over basislinjen. Målgenet kopi-antall i ukjente prøver blir kvantifisert ved å måle C
t-verdier og ved hjelp av en standardkurve for å bestemme kopitallet [34]. Genkopitallet ble beregnet ved hjelp av følgende ligning: g = (S
T /S
C) /(N
T /N
C).
PIK3CA
kopiere nummer ble vurdert som beskrevet av oss tidligere [14].
Flislegging banen aCGH
aCGH ble utført som tidligere beskrevet [14], [15]. Genomiske ubalanser ble identifisert ved hjelp av aCGH-Smooth [35] som tidligere beskrevet [36].
FISH analyser
Dual-farge FISH analyser ble utført i henhold til en standard protokoll [37], [38 ]. Sonde sett, EGFR /CEP7 og PathVysion og kontroller CEP7 ble hentet fra Abbott Molecular (Des Plaines, Illinois), HER3 /CEP12 ble hentet fra QBiogene; BRAF probe ble generert fra det bakterielle kunstige klon (BAC) klon benyttet for aCGH. Kopi Numrene på målgener (merket med rødt fluoroforer) og CEP prober (merket i Spectrum Grønn) ble bekreftet i minst 100 interfase celler og 20 metafase sprer seg. Bilder ble tatt og slått sammen med CytoVision arbeidsstasjon (Applied Imaging, San Jose, California).
Sub-kloning
Genomisk DNA ble isolert fra mutant
EGFR
eller
KRAS
NSCLC cellelinjer og brukes som en mal for PCR oppformering av
EGFR
eller
KRAS
. Primerne og betingelsene for PCR-reaksjonene var som beskrevet tidligere. PCR-produkter ble klonet inn i pCR2.1-TOPO vektor ved hjelp av TOPO TA-kloningssett (Invitrogen). Rundt 20 kloner (range15-25) ble valgt for sekvensering ved hjelp av enten M13 forover primer eller tilsvarende
EGFR
eller
KRAS
primere. Resultatene er uttrykt som prosentandelen av mutante alleler stede i det totale antall klonet.
TKI følsomhet
MTS kolorimetrisk analyse (Promega) ble utført i henhold til produsentens instruksjoner. Denne analyse er basert på omdannelsen av MTS i form av oppløselig formazan ved endogene dehydrogenase enzymer som finnes i metabolsk aktive celler. Celler ble sådd ut i 1 x 10
3-4 x 10
3 celler /brønn i vevskultur behandlede 96-brønners plater. Den følgende dag, TKI (gefitinib eller erlotinib) ble tilsatt til hver plate i en fortynning serie tvers over platen, slik at åtte forskjellige konsentrasjoner av medikamentet ble testet. På dag 5, ble 20 ul av MTS tilsatt, fulgt av en 1 times inkubering ved 37 ° C og deretter ble absorbansen ble avlest ved 490 nm på en plateavleser.
96-brønners plate data ble importert til en in-house Database of in vitro legemiddel Følsomhet analyser (Divisa av Luc Girard, manuskript under forberedelse) hvor IC50s beregnes samt ulike statistiske analyser. For å beregne IC50 verdier, data var bakgrunnen korrigert (kolonne 1 og 12 vanligvis inneholdt media uten celler eller narkotika, og fungerte som bakgrunnsverdier), og montert på DRC-modellen (R-pakke «DRC» av Christian Ritz og Jens Streibig, https://www.bioassay.dk) for å generere en sigmoidal kurve som den konsentrasjonen som inhiberer 50% av cellene (IC50) ble bestemt.
Statistiske analyser
Fisher to-tailed eksakte tester ble bestemt ved bruk av Prism 4 programvare (Graph Pad, San Diego, California). P-verdiene 0,05 ble betraktet som signifikant. Andre statistiske analyser er omtalt under egnede kategorier i under resultatene.
Resultater
Mutasjoner (m) og CNG og står (g) i lungekreftcellelinjer
Vi undersøkte 32 SCLC og tre linjer fra små cellekreft fra ekstrapulmonær områder (ekstrapulmonær små cellekreft, ExPuSC), for somatiske mutasjoner og CNG og står for
EGFR
sti gener. Vi fant totalt bare tre mutasjoner i 35 cellelinjer og alle tre var
PIK3CA
mutasjoner (tabell S1). CNG og står for
EGFR
pathway gener ble sjelden møtte i SCLC (tabell S2). Siden somatiske mutasjoner og CNG og står for
EGFR
pathway gener var sjeldne i SCLC, vi begrenset våre videre studier for å NSCLC.
For noen av de sju gener testet, mutasjoner (39/77, 50,6% ), kopinummer gevinster (50/77, 64,9%) eller enten (65/77, 84,4%) var hyppig i NSCLC linjer. Disse funnene er nærmere omtalt nedenfor.
Mutasjoner (m) av
EGFR
pathway gener i NSCLC
Vi undersøkte NSCLC linjer, for somatiske mutasjoner av
EGFR
pathway gener som er oppført i metodedelen. Vi har funnet totalt 40 mutasjoner i 39 (50,6%) cellelinjer (figur 1a, Tabell S3). Disse mutasjonene besto av 19
KRAS plakater (24,7%), 10
EGFR product: (13%), fem
BRAF plakater (6,5%), fire
PIK3CA
(5,2%), en
HER2 plakater (1,3%), en
HER4 plakater (2,2%) og ingen for
HER3
. m
EGFR
, m
BRAF Hotell og m
HER2
var tilstede utelukkende adenokarsinomer mens m
KRAS
var hyppigere i adenokarsinom og store celle histologier. m
PIK3CA
var de eneste mutasjoner som ikke er rettet mot adenokarsinom histologi (Fig. 1c).
Fig 1a. viser hyppigheten av mutasjoner og kopiere antall gevinster på
EGFR
pathway gener (
EGFR
,
KRAS
,
BRAF
,
PIK3CA
,
HER2
,
HER3 Hotell og
HER4
). Førti mutasjoner ble identifisert i 39 cellelinjer. Mutasjoner og kopinummer gevinster var hyppigere for
EGFR plakater (13%, 40,3%) og
KRAS plakater (24,7%, 14,3%) enn andre genet. CNG og står for
HER2 plakater (18,2%) var også vanlig. Vi identifiserte bare en
HER2 Hotell og en
HER4
somatisk mutasjon. Tallene over søylene angir antall cellelinjer med mutasjoner (blå søyler) eller kopi nummer gevinster (røde søyler). Fig 1b. Figuren viser antall gener som viser CNG og står i mutant og vill-type-cellelinjer. Av de 77 cellelinjene som ble undersøkt, 39 (50,6%) hadde en mutasjon i minst ett av de syv EGFR pathway genene som ble undersøkt. CNG og står var hyppig i både muterte og villtype cellelinjer. Fig 1c. viser hyppigheten av mutasjoner på grunnlag av NSCLC subtype. Mutasjoner av
EGFR Hotell og
BRAF
ble utelukkende funnet i adenokarsinom subtype. Singelen
HER2
mutasjon var i et adenokarsinom i forhold til
HER4
somatisk mutasjon som ble identifisert i en plateepitelkarsinom ca. Fig 1d. viser hyppigheten av kopinummer gevinster (CNG og står) (g 4 av qPCR) på grunnlag av NSCLC subtype. CNG og står for
BRAF Hotell og
PIK3CA
ble sett hovedsakelig i adenokarsinom og plateepitelkarsinom hhv. CNG og står for resten av genene ikke favorisere noen subtype.
Mutasjoner er gjensidig utelukkende
Vi undersøkte for noen sammenheng mellom somatiske mutasjoner i enkeltcellelinjer. For å teste hypotesen om at
EGFR
pathway genmutasjoner er gjensidig utelukkende, vi brukte Monte Carlo-simuleringer for å beregne den empiriske p-verdi. Nullhypotesen er at mutasjoner vil oppstå uavhengig av hverandre. Vi simulert felles distribusjon av mutasjons hendelser blant disse sju gener ved hjelp av de observerte marginale mutasjon priser og den uavhengige antakelsen. I hver simulering, bemerkes at det antall cellelinjer med multiple mutasjoner. Vi gjentok simuleringer 10.000 ganger og oppnådd den empiriske fordelingen av antall cellelinjer med multiple mutasjoner; Da vi sammenlignet observerte antall cellelinjer med multiple mutasjoner med dette empiriske fordelingen for å beregne p-verdi
For denne studien, er den ensidig p-verdi på 0,0014.; derfor vi forkastet nullhypotesen og konkluderte med at genmutasjoner er gjensidig eksklusive arrangementer for disse genene i NSCLC cellelinjer, med ett unntak (tabell 1). Stor cell carcinoma linje NCI-H460 hadde både
KRAS Hotell og
PIK3CA
mutasjoner.
Sammenligning av metoder for å bestemme kopitall gevinster
aCGH , FISH og qPCR ble brukt til å teste gen kopiantall for NSCLC cellelinjer. Det er ingen klar biologisk terskelverdi for å definere de unormale kopiantall for NSCLC menneskelige cellelinjer; vi valgt terskelverdiene som kunne oppnå best positiv eller negativ kategori enighet blant de tre testene. Spesielt beregnet vi Kappa statistikken [39] mellom aCGH og qPCR tester over to dimensjonale lodde nett som 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5 og 5; og deretter gjorde det samme for fisk og qPCR. De grenseverdier som oppnådde den beste avtalen mellom tre tester var som følger: 4 for qPCR, 3 for CGH og 4.5 for fisk; og vi brukte disse verdiene til å definere tilstedeværelsen av kopitall gevinster i NSCLC cellelinjer. Ved hjelp av disse cut-off-verdier og alle tilgjengelige data, var det svært signifikant konkordans (p 0,001) mellom de tre metodene som er vist i tabell 2.
EGFR
sti genet CNG og står
som qPCR data var komplett for alle linjer (mens undergrupper ble testet ved de to andre metoder som er mer arbeidskrevende og dyrt), brukte vi qPCR data for alle videre analyser. Kopier nummer gevinster ble hyppig ( 10%) for
EGFR
,
HER2
,
HER3 Hotell og
KRAS plakater (fig 1a, tabell S4) . Spesielt gevinster for
EGFR
var mer enn dobbelt så hyppig (40%) enn for noen annen genet. Generelt, med unntak av g
BRAF plakater (begrenset til adenokarsinom histologi), og g
PIK3CA product: (i stor grad begrenset til plateepitel histologi), CNG og står ikke viser noen åpenbar histologi subtype skjevhet ( fig. 1c).
Forholdet mellom mutasjoner og kopiantall gevinster
I motsetning til mutasjoner, kopinummer gevinster var ikke gjensidig utelukkende enten med andre CNG og står eller med mutasjoner (fig. 2). Vi fant CNG og står for to eller flere gener i 32,5% (25/77) av cellelinjer (tabell S4). Men, bemerket vi en meget signifikant sammenheng mellom mutasjoner av
EGFR
eller
KRAS Hotell og CNG og står på sine respektive gener (fig 3a, 3b).
Fig 2a. viser at kopiantall gevinster og mutasjoner er ikke gjensidig utelukkende. Som det fremgår av figuren CNG og står for
EGFR Hotell og
KRAS
er betydelig hyppigere i
EGFR Hotell og
KRAS
mutantcellelinjer henholdsvis (p 0,05 ). Det var bare en
HER2 Hotell og
HER4
mutant NSCLC cellelinje og dermed ble de ikke inkludert i dette tallet. Fig 2b. viser at kopiantall gevinster er ikke gjensidig utelukkende og gevinster av ett gen kan forekomme i nærvær av gevinster for andre gener.
EGFR Kjøpe og
KRAS
gener fortrinnsvis ha kopitall gevinster (CNG) i cellelinjer som bærer de respektive mutasjoner (paneler a og b). I mutant linjer, det mutante allelet nesten alltid er i overskudd sammenlignet med villtype-allelet (paneler C og D), et fenomen som vi har kalt MASI. I de fleste MASI tilfeller mutant allel demonstrerer CNG og står; imidlertid MASI kan også være til stede i cellelinjer som har en diploid kopiantallet av oncogenet, (ervervet uniparental disomy) enten ensartet (NCI-H460) eller heterogene (NCI-H1975).
mutant allel-spesifikk ubalanse (MASI) for
EGFR Hotell og
KRAS
gener
Som nevnt ovenfor CNG og står for
EGFR Hotell og
KRAS
var hyppigere i cellelinjer skjuler disse mutasjonene. Ansette sub-kloning metoden beskrevet tidligere, vi undersøkt om
EGFR Hotell og
KRAS
gener fortrinnsvis demonstrert mutant allel spesifikke CNG og står i cellelinjer som bærer de respektive mutasjoner (Fig. 3). Dataene, for å teste om mutante alleler forsterkes i genet muterte cellelinjer er samlet data med binært utfall. Hver cellelinje er en klynge og nullhypotesen er at mutasjonsfrekvensen er 0,5. Fordi antall subkloner i hver cellelinje variert, brukte vi analysen tilnærming for gruppert binær utfallet med ulike blokkstørrelser, [40]. I mutant linjer, det mutante allel var nesten alltid i overskudd sammenlignet med villtype-allelet, et fenomen som vi har kalt MASI. P-verdien for
EGFR
mutantcellelinjer var 0.019 og for
KRAS
mutant cellelinje var 0,0003 indikerer at de mutante alleler var fortrinnsvis dominerende i begge tilfeller. De fleste MASI tilfeller var på grunn av økt kopiantallet av det mutante allelet. Men i et mindretall av tilfellene MASI ble også bemerket i celler med diploide eller i nærheten av diploide kopiantall (ervervet uniparental disomy). Dermed har vi brukt begrepet MASI i motsetning til mutant allel konkrete gevinster.
Kjennetegn på
EGFR
Mutant cellelinjer
De klinisk-patologiske og molekylære data for 10 NSCLC celle linjer som rommer
er EGFR
mutasjoner sammenfattet i tabell 3. Alle inneholdt en av de to store mutasjoner i kinase domene, enten delesjoner av exon 19 (n = 7) eller L858R mutasjon i exon 21 (n = 3 ). Mutasjoner ble utelukkende sett i adenokarsinom og aldri røykere eller pasienter med lav tobakk eksponering (eller under 10 pakke år). En
EGFR
mutant cellelinje ble utviklet i Japan og de resterende ni ble utviklet i Nord-Amerika. Av de ni utviklet i Nord-Amerika, bare en var fra en person av asiatisk etnisitet. I tillegg har vi identifisert at
EGFR
mutasjoner var mer vanlig i relativt yngre aldersgruppen ( 55 år).
Syv av disse cellelinjene var følsomme for gefitinib. De tre resistente linjene hadde en annen mutasjon: enten T790M motstand assosiert mutasjon i ekson 20 (n = 2) eller en homozygot delesjon av
PTEN
genet og fravær av sin protein [41] (forfatternes upubliserte observasjoner ).
Effekter av mutasjoner og kopiere nummer gevinster på følsomhet for TKI
for å evaluere effekten av mutasjoner og kopiere nummer gevinster på følsomhet for TKI, vi analyserte IC50 verdier på 45 NSCLC cellelinjer . Fordi TKI klinisk sensitivitet fortrinnsvis rettet mot adenokarsinom histologi, inkludert vi 31 adenokarsinomer. Hele undergruppe inkludert alt av
EGFR
,
HER2 Hotell og
HER4
mutantcellelinjer og 12
KRAS Hotell og 3
BRAF
cellelinjer. Fordi
PIK3CA
mutasjoner favoriserte ikke-adenocarcinom histologi bare en
PIK3CA
mutant cellelinje ble inkludert. Av hele undergruppe 17 linjer var villtype for alle gener testet (tabell S5)
Vi fant en utmerket samsvar mellom IC50 verdier mellom gefitinib og erlotinib. (P 0,0001) (figur 4, tabell S7). Fordi våre datasett for gefitinib følsomhet var mer omfattende vi har valgt å utnytte gefitinib data for videre analyser
Førtifem cellelinjer ble testet for følsomhet for både narkotika og samstemmighet var utmerket (p 0,0001)..
fig. 5 illustrerer følsomhetsmønstrene for de testede cellelinjer. Den in vitro konsentrasjon på 1 pM anvendt i vevskultur korrelerer med plasmakonsentrasjonen av gefitinib hos pasienter behandlet med standarddosen av gefitinib, dvs. 250 mg per dag. Denne terskelen har blitt brukt av forskere i det siste for å skille sensitiv fra ufølsomme og /eller resistente cellelinjer [7]. På grunnlag av den ovennevnte terskel og formen av kurven, delt vi våre cellelinjer i 3 kategorier: sensitive (≤1 um), mellomprodukt ( 1 uM men ≤10 uM) og resistente ( 10 pM ) som vist i figur fig. 5. IC50-verdiene følge en linje som viste en skråning forandring punkt ved omtrent 10 uM, og således viste en tilsynelatende bimodal fordeling (fig. 5). Som cellelinjer med verdier under 1 um ble betraktet som sensitive, vi vilkårlig inndelt verdier mellom 1 og 10 uM til å være mellomproduktet i følsomhet.
Fig 5. viser en log kurve av de gefitinib IC50-verdier for 45-småcellet lungekreft celle linjer. De er klassifisert i tre kategorier på grunnlag av gefitinib IC50: Sensitive (IC50 1 mm), middels (IC50 en men 10 mm) og Resistent (IC50 10 mm). Av de ni sensitive cellelinjer, sju av dem havna
EGFR
mutasjoner, har en CNG og står for
EGFR Hotell og man har CNG for
HER2
. Av de resterende
EGFR
mutant cellelinjer, to hadde T790M mutasjon (en middels og en resistent) og en hadde en homozygot delesjon av
PTEN plakater (resistent).
KRAS
mutant og villtype cellelinjer var resistente mot gefitinib.
Det var ni cellelinjer i den følsomme gruppen og de inkluderte syv av de ti m
EGFR
linjer, en g
EGFR
cellelinje og en g
HER2
cellelinje. Den mellomkategori besto av bare to cellelinjer; en m
EGFR
cellelinje som har en sekundær T790M mutasjon og en g
HER2
cellelinje. Den resistente cellelinje kategorien var den største og inkludert to m
EGFR
cellelinjer, en som har den sekundære T790M mutasjon og den andre har homozygot sletting av
PTEN
genet. De resterende resistente linjer tatt med alle de villtype linjer og alle linjene har
KRAS
,
BRAF
,
HER2
,
HER4 Hotell og
PIK3CA
mutasjoner.
Ved hjelp av univariat tester, analyserte vi sammenhengen mellom gefitinib følsomhet og mutasjonsstatus eller CNG og står for de forskjellige
EGFR
pathway gener og fant en signifikant sammenheng mellom gefitinib følsomhet med
EGFR
mutasjon (p = 0,002) og
EGFR
kopiere antall gevinster (p = 0,001). Vi testet hypotesen om at KRAS-mutasjoner gi iboende motstand mot TKI.
