Abstract
Selv om en økt uttrykk nivå av XIAP er assosiert med kreft celle metastaser, de underliggende molekylære mekanismene forblir stort sett uutforsket. Hvis du vil kontrollere den spesifikke strukturelle grunnlaget for XIAP for regulering av kreft celle migrasjon, introduserte vi forskjellige XIAP domener i XIAP
– /- HCT116-celler, og funnet ut at reconstitutive uttrykk for full lengde HA-XIAP og HA-XIAP ΔBIR, begge som har intakt RING domene, restaurert β-Actin uttrykk, aktin polymerisasjon og kreft cellemotilitet. Mens innføringen av HA-XIAP ΔRING eller H467A mutant, som avskaffet sin E3 ligase funksjon, ikke viser åpenbare restaurering, viser at E3 ligase aktivitet XIAP RING domene spilte en avgjørende rolle XIAP i regulering av kreft cellemotilitet. Videre ble RING domene snarere enn BIR domene nødvendig for samhandling med RhoGDI uavhengig på sin E3 ligase aktivitet. For å oppsummere, vår nåværende studier funnet at rollen XIAP i regulering cellular motilitet ble frakoplet fra sine caspase-hemmende egenskaper, men relatert til fysisk interaksjon mellom RhoGDI og dens RING domene. Selv om E3 ligase aktivitet RING domene bidratt til celle migrasjon, det var ikke involvert i RhoGDI binding eller dets ubiquitinational modifikasjon
Citation. Liu J, Zhang D, Luo W, Yu J, Li J, Yu Y, et al. (2012) E3 ligaseaktivitet av XIAP RING Domain er nødvendig for XIAP-mediert Cancer Cell Migrasjon, men ikke for dens RhoGDI bindingsaktivitet. PLoS ONE 7 (4): e35682. doi: 10,1371 /journal.pone.0035682
Redaktør: Carl G. Maki, Rush University Medical Center, USA
mottatt: 10 desember 2011; Godkjent: 20 mars 2012; Publisert: 19 april 2012
Copyright: © 2012 Liu et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Funding var gitt av United States National Institutes of Health /NCI CA112557 og CA119028-05S110, NIH /NIEHS ES012451, og ES010344. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
X-bundet hemmer av apoptose protein (XIAP) er et medlem av hemmere av apoptose protein (IAP) familie [1]. XIAP ble først anerkjent av sin potente egenskaper i å regulere celle apoptose [2], [3]. Senere undersøkelser funnet at XIAP kan regulere andre cellulære trasé frikoblet fra sine caspase-hemmende aktiviteter [4], [5], majorly inspirert av funnene fra XIAP-mangelfull mus som viste ingen åpenbar apoptotisk fenotype [6]. Nylig ble en rekke bevis har antydet at engasjement av XIAP i kobber metabolismen [7], celle motilitet [8], [9] og aktivering av JNK og NFkB trasé [10], [11] var ikke relatert til dets inhibitoriske effekt på kaspaser.
De mange funksjonene XIAP rot fra sin strukturelle basis. XIAP er sammensatt av tre baculoviral IAP gjenta (BIR) domener ved amino-terminus og en carboxyl-terminal RING domain [12]. Hver BIR domene består av ca 70 aminosyrer som koordinere et sinkion via histidin og cystein-rester [13]. Dens potente anti-apoptotiske egenskaper er i hovedsak avhengig av funksjonene til en groove i BIR3 domene og to flater på BIR2 domene som har blitt rapportert å binde og hemme caspase-9 og caspase-3/7 henholdsvis [14]. RING domain er definert ved tilstedeværelsen av syv cysteiner og en histidin som danner tverrstag arkitektur og samordne to sinkioner [15]. RING domener fungerer ofte som modulerer der det gis ubiquitin ligase (E3) aktivitet [13]. Ved å mutere nøkkelen histidinresten i aminosyreposisjon 467 til alanin for menneskelig XIAP, funnet Lewis et al at E3 ubiquitin ligase funksjon av RING var nødvendig for aktivering av NFkB, mens ikke for Smad avhengig transkripsjon [16], noe som indikerer at struktur- baserte funksjoner av XIAP er også cellulær kontekstavhengig.
Økt ekspresjon av XIAP finnes i mange kreftvevet og forbundet med chemoresistance, sykdomsutvikling og dårlig prognose [9], [17], [18], [19 ], [20], [21], [22]. De siste resultatene fra vårt laboratorium og andres vist at XIAP kunne regulere metastase [8], [23], [24]. Metastase er en viktig dødsårsak for de fleste kreftpasienter [25]. Mange molekyler som er involvert i metastatisk kaskade er styrt av medlemmene i Ras-super av små GTP-bindende proteiner, som er i stand til å binde BNP /GTP og hydrolyserer GTP fører til aktivering av nedstrøms effektor proteiner [26]. Menneskelig Rho-GTPase familien består av 23 signalmolekyler, blant RhoA, RHOB, Rac1 og Cdc42 er mest omfattende undersøkt og rapportert å kontrollere ulike aspekter av cellular motilitet og invasjon, dvs. mobilnettet polaritet, ctyoskeletal organisasjon, og signaltransduksjon [27], [28].
Rho-GTPase aktivitet er strengt kontrollert av fire viktige komponenter som er involvert i BNP /GTP-bundet GTPase syklus, inkludert GTPase aktiverende proteiner (hull), BNP-dissosiasjon hemmere (GDIs), GDI dissosiasjon faktorer (GDFs) og guanin nukleotid utvekslings faktorer (GEFs) [29]. RhoGDI spiller en nøkkelrolle i å balansere hele GTPase syklusen ved å forhindre BNP dissocation og opprettholde GTP foreningen gjennom interaksjon med prenylation gruppe GTPase. Således sequesters det GTPase i cytoplasma, mens lokalisering til den indre plasmamembranen er nødvendig for GTPase aktivering. De inhiberende virkninger av RhoGDI på GTPase-aktivitet har blitt støttet av flere linjer av bevis [30], [31], [32]. For eksempel, Leffers
et al
. har funnet at overekspresjon av RhoGDI i humane keratinocytter forårsaket avbrudd av aktin cytoskjelettet og inhibering av motilitet [32]. Derfor er RhoGDI står som en attraktiv kandidat for å regulere aktiviteten i Rho GTPase i kreftbehandling [26].
Våre nyere studier har vist at XIAP mediert kreftcelle motilities via RhoGDI avhengig måte i reguleringen av cytoskjelettet [ ,,,0],23]. I denne studien har vi ytterligere belyst de molekylære mekanismene bak XIAP-RhoGDI protein interaksjon og gitt den strukturelle grunnlaget for XIAP for bidraget til formidling av kreft cellemotilitet.
Resultater
RING domenet ble kreves for XIAP-mediert β-Actin ekspresjon
XIAP uttrykk er forhøyet i mange cancercellelinjer og nært knyttet til progresjon og aggresjon av ondartet kreft [33], [34]. Våre siste arbeid vist at XIAP kunne regulere β-Actin uttrykk [23]. Som et resultat av nedbryting av XIAP uttrykk svekkede cellemigrering hastighet og invasive evne som vist i sårheling analyse og trans-brønn assay, henholdsvis (fig. 1A-1E). Å være oppmerksom på, var det bare marginal forskjell i proliferasjonsrate mellom WT og XIAP
– /- celler når dyrket i normal cellekulturmedium (10% FBS) i inntil 5 dager, som omfattet tidsperioden for sårheling analysen ( fig. 1F), som indikerer at den reduserte cellemigrering hastighet observert i XIAP
– /- celler var ikke på grunn av defekte celleproliferasjon. Videre er den dynamiske induksjon av aktin polymerisasjon, nemlig F-aktin formasjon, ved EGF ble også dramatisk redusert i XIAP
– /- celler som detekteres av spektrofotometeret (Fig. 1G). Jevnt ble det observert en klar endring av celleskjelettet morfologi og mer perifere ruffles /membran volanger i EGF-behandlede WT HCT116-celler, men ikke i XIAP
– /- celler (figur 1 H . 1I). Disse fenomenene var reproduserbar ved å banke ned XIAP i HCT116-celler (fig. 2). Derfor indikerte det at XIAP spilte en sentral rolle i formidling av kreft celle migrasjon og invasjon.
(A), Knockout av XIAP i HCT116-celler ble bekreftet ved Western blotting-analyse. (B og C), ble Cell vandringsadferd evaluert i løpet av utførelsen av et sårhelende assay, og bilder ble tatt på forskjellige tidspunkter. Scale bar var 300 mikrometer. Såret området ble kvantifisert ved hjelp av cellemigrasjon analyse programvare, og de kvantitative data ble vist som angitt (feilfelt representerer S.D, n = 3). Stjernen (*) viser en signifikant forskjell i såret området prosentpoeng mellom de angitte cellelinjer (
p
0,05). (D og E), invasjon av WT (Vector), XIAP
– /- (Vector), og XIAP
– /- (HA-XIAP) HCT116-celler, ble bestemt, kvantifisert og uttrykt som prosentandel av invasjon. Resultatene ble representert ved gjennomsnitt ± S.D. av dataene fra tre uavhengige eksperimenter med duplikate brønner for hvert eksperiment. Stjernen (*) indikerer en betydelig reduksjon i invasjon prosent sammenlignet med det i WT (vektor) og XIAP
– /- (HA-XIAP) celler (
p
0,01). (F), De sprer priser på de angitte cellelinjer ble vurdert av en CellTiter-Glo® Lysende celleviabilitet Assay kit. Resultatene ble representert ved gjennomsnitt ± S.D. av triplikatbrønner. (G-I), De angitte celler ble behandlet med eller uten EGF og F-aktin-induksjon ble analysert med spektrofotometer (G), eller observeres i henhold konfokalt mikroskop (H), henholdsvis. Fluorescensen av celler ble kvantifisert ved programvaren til ImageJ (I). Den kvantitative data ble vist som angitt (feilfelt representerer S.D, n = 3). Stjernen (*) viser en betydelig nedgang sammenlignet med det i WT celler (
p
0,01).
(A), knockdown av XIAP i HCT116 cellene ble verifisert av Western blotting-analyse. (B og C), ble Cell vandringsadferd evaluert i løpet av utførelsen av et sårhelende assay, og bilder ble tatt på forskjellige tidspunkter. Scale bar var 300 mikrometer. Såret området ble kvantifisert ved hjelp av cellemigrasjon analyse programvare, og de kvantitative data ble vist som angitt (feilfelt representerer S.D, n = 3). Stjernen (*) viser en signifikant forskjell i såret området prosentpoeng mellom de angitte cellelinjer (
p
0,05)
XIAP protein inneholder fire funksjonelle domener, inkludert tre BIRs. og en ring domene (fig. 3A). Den anti-apoptotiske funksjonen XIAP BIRs ble rapportert å være knyttet til deres binding og nedskrivning av caspaseaktivering [1]. Den RING domene XIAP tilhører E3 ligase og formidler protein ubiquitinering og degradering [1]. Hvis du vil kontrollere den spesifikke strukturelle grunnlaget for XIAP for regulering av kreft celle migrasjon, vi tilført forskjellige HA-merket XIAP cDNA konstruerer, inkludert full-lengde (HA-XIAP), RING domene-sletting (HA-XIAPΔRING), total BIR sletting (HA -XIAPΔBIR), og en punktmutasjon H467A, noe som resulterer i tap av E3 ubiquitin ligase aktivitet, inn XIAP
– /-.-celler henholdsvis, og de stabile transfektanter ble identifisert (figur 3B). Re-konstitusjonelle ekspresjon av HA-XIAP eller HA-XIAP ΔBIR som inneholder RING domain inn i XIAP
– /- celler som resulterte i en økning i β-Actin ekspresjon sammenlignet med den i XIAP
– /- (Vector) celler, mens uttrykk for HA-XIAP ΔRING som inneholder BIR domener, eller HA-XIAP H467A som gjengir abolishment i E3 ligase aktivitet, ga ikke sammenlignbare restaurering (fig. 3C). Derfor er det demonstrert at XIAP RING domain og dens E3 ligaseaktivitet spilte en rolle i regulering av β-Actin ekspresjon.
(A) Skjematisk representasjon av XIAP protein og identifisert funksjon av hver enkelt domene. (B og C) Identifisering av de stabile transfektanter husing XIAP og dets ulike delesjons plasmider i XIAP
– /- HCT116-celler. Tallene under bandene indikerte densitometrisk analyse av relative forholdstall på beta-Actin nivåer til lastkontroller (GAPDH) evaluert av programvare fra Imagequant versjon 5.2 (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA). Resultatene var representative for minst tre uavhengige eksperimenter.
E3 ligase aktivitet XIAP RING domene var involvert i formidling av cellemigrasjon og aktin polymerisasjon
For ytterligere å undersøke den biologiske relevansen av β aktin uttrykk endring regulert av XIAP RING domene, sårheling analysen ble utført for å sammenligne flytterater blant ulike transfektanter bærer forskjellige domener av XIAP som angitt i fig. 3B. I samsvar med defekter i β-Actin uttrykk, innføring av verken HA-XIAP ΔRING eller HA-XIAP H467A kunne reversere nedskrivninger i celle migrasjon av XIAP
– /- celler, mens uttrykk for full lengde HA-XIAP eller HA XIAPΔBIR, som begge holder intakt RING domain, gjen reduksjon av cellemigrering evne forårsaket av XIAP uttømming (fig. 4A). Mens på grunn av den relative lave ekspresjon av HA-XIAPΔBIR i forhold til det av HA-XIAP i de enkelte transfektanter (Fig. 3B), den sårheling hastighet observert i HA-XIAPΔBIR-uttrykkende transfektanter som var langsommere enn i HA-XIAP- uttrykkende celler (fig. 4A). Prosentandelen av sår området igjen un-stengt på 4
th dag sammenlignet med det på 0 dagen ble kvantifisert ved hjelp av cellemigrasjon Analysis programvare, som viste at såret områdene i XIAP
– /- (vektor), HA XIAP ΔRING og HA-XIAP H467A transfektanter var markert høyere enn i WT HCT116-celler (fig. 4B). Derfor er det foreslått at E3 ligase aktivitet av RING domain spilte en viktig rolle i XIAP-mediert celle motilitet.
(A), ble Cell vandringsadferd evaluert med en sårhelende assay, og bilder ble tatt på forskjellige tidspunkter. Scale bar var 300 mikrometer. (B), The såret igjen un-stengt på 4
th dag ble kvantifisert ved hjelp av cellemigrasjon analyse programvare, og den kvantitative data ble vist som angitt (feilfelt representerer S.D, n = 2). Stjernen (*) viser en signifikant forskjell i andel av sår område sammenlignet med det i WT (Vector) celler (
p
0,05).
Actin filamenter spille en sentral rolle i en rekke cellulære funksjoner, for eksempel cellemigrering og morfologiske regulering [35]. For å bestemme potensiell involvering av forskjellige domener av XIAP i regulering av aktin polymerisasjon, behandlet vi cellene med EGF, og deretter ekstrahert celler for bestemmelse av F-aktin nivåer ved strømningscytometri ved bruk av stabile transfektanter som er nevnt ovenfor. Igjen, F-aktin formasjoner indusert ved hjelp av EGF behandling var åpenbart oppnådd i WT HCT116-celler, XIAP
– /- (HA-XIAP) og XIAP
– /- (HA-XIAP ΔBIR) transfektanter, mens det ikke var noen observerbar F-aktin induksjon i XIAP
– /- (vektor), XIAP
– /- (HA-XIAP ΔRING) eller XIAP
– /- (HA-XIAP H467A) transfektanter (fig. 5A) . Kvantifiseringen Resultatet er vist i fig. 5B. Tatt sammen, våre resultater viste at funksjonen av XIAP RING domain i regulering av aktin polymerisasjon og cellemotilitet ble formidlet av dets E3 ligase aktivitet.
(A), De angitte celler ble behandlet med eller uten EGF og F- Actin-induksjon ble analysert ved flow-cytometri. (B), Den kvantitative data ble vist som angitt (feilfelt representerer S.D, n = 2). Stjernen (*) viser en signifikant forskjell i F-aktin induksjon sammenlignet med i WT (Vector) celler (
p
0,05).
XIAP RING Domain samhandlet med RhoGDI, uavhengig på sin E3 ligaseaktivitet
Våre siste arbeid viste at RhoGDI var involvert i aktin polymerisasjon regulert av XIAP [23]. Derfor har oppdaget at det er fysisk interaksjon mellom disse to molekyler ved ko-immunoutfelling anvendelse av anti-XIAP spesifikt antistoff. Resultatene viste at RhoGDI ble detektert i ko-immunopresipitert kompleks i XIAP
+ /+, men ikke XIAP
– /- HCT116-celler (Fig. 6A), noe som tyder på at RhoGDI kan samhandle med endogent XIAP. Samspillet mellom XIAP og RhoGDI ble ytterligere bekreftet innbyrdes ved påvisning av XIAP i ko-immunutfelling kompleks trukket ned ved hjelp av anti-GFP antistoff ved hjelp av transfektanter av XIAP
– /- (HA-XIAP /GFP-RhoGDI), mens det var ingen påviselig nivå av XIAP i Co-IP kompleks i transfektanter av XIAP
– /- (HA-XIAP /GFP-vektor) (figur 6B.). Så vi slått ned RhoGDI i WT og XIAP
– /- celler for å bekrefte deltakelse av RhoGDI i cellemotilitet. Sårheling analyseresultatene viste at knockdown av RhoGDI i WT celler ikke føre til en tydelig endring i sårheling rente, men en bemerkelsesverdig økt celle migrasjon ble observert i XIAP
– /- (shRNA-RhoGDI) celler i forhold til at det i ikke-tie kontroll, XIAP
– /- (non-lyddemping) celler (fig. 6C). Konsekvent, knockdown av RhoGDI uttrykk også økt F-aktin innhold i XIAP
– /- (Si-RhoGDI) celler eksponert for EGF (Fig 6D, p 0,05.). Sekvensene til de RhoGDI genet (401-419), som var komplementære til siRNA oligonukleotid i pEGFP-C3 /RhoGDI-re-konstruksjon, ble mutert for å forhindre ødeleggelse av eksogent mRNA ved RhoGDI siRNA [36]. Som vist på fig. 6E, overekspresjon av pEGFP-C3 /RhoGDI-re ble identifisert i XIAP
– /- (Si-RhoGDI + RhoGDI-re). Dette reconstitutive uttrykk for RhoGDI i XIAP
– /- (Si-RhoGDI + RhoGDI-re) dramatisk svekket aktin polymerisasjon indusert av EGF behandling i forhold til at det i XIAP
– /- (Si-RhoGDI) celler (2 % vs. 14%, p 0,01, figur 6F).. Videre reconstitutive uttrykk for RhoGDI i XIAP
– /- (Si-RhoGDI + RhoGDI-re) celler restaurerte hemmende rolle RhoGDI på trådformede aktin dannelse (Fig 6G.), Noe som tyder på at gjeninnføring av RhoGDI-re aktivert erstatning for tap av endogen RhoGDI funksjon på aktin polymerisasjon i XIAP
– /- celler. Våre resultater gitt bevis for at RhoGDI kan være involvert i XIAP RING domene-mediert regulering av aktin polymerisasjon og cellemigrasjon
(A), Lysates fra WT og XIAP
-. /- HCT116 cellene var Co-immunopresipitert med anti-XIAP (mus) antistoff eller normal mus IgG, og immunopresipitatene ble deretter utsatt for immunblotting med anti-RhoGDI (kanin) eller anti-XIAP (kanin) antistoffer. Fem prosent av lysatene ble brukt som input. (B), XIAP
– /- (HA-XIAP) celler ble transient transfektert med GFP-RhoGDI eller tom vektor, gftp-vektor. Co-immunoutfelling ble utført med anti-GFP antistoff-konjugert agarosekuler. Immunopresipitater ble deretter utsatt for immunblotting ved bruk av antistoffer som angitt. (C). Stabile transfektanter av shRNA-RhoGDI i WT og XIAP
– /- celler ble identifisert. Cellemigrasjon ble bestemt ved sårheling analyser på de angitte tider mellom ikke-taushet shRNA-RhoGDI transfektanter i WT og XIAP
– /- cellene hhv. Såret området ble kvantifisert ved hjelp av cellemigrasjon analyse programvare, og den kvantitative data ble vist som angitt (feilfelt representerer S.D, n = 3). Stjernen (*) viser en signifikant forskjell mellom de angitte cellelinjer (
p
0,05). Scale bar var 300 mikrometer. (D), var De angitte celler behandlet med EGF i 1 minutt for bestemmelse av F-aktin-induksjon ved strømningscytometri. (E), Konstitutiv ekspresjon av GFP-RhoGDI-Re i XIAP
– /- (Si-RhoGDI) ble bekreftet ved Western blotting. (F og G), relativ induksjon av F-aktin i nærvær av EGF ble bestemt ved spektrofotometrisk (F), og nivåene av trådformede Aktin ble observert i henhold til konfokal mikroskopi (G) i de angitte transfektanter. Stjernen (*) indikerer en betydelig økning i forhold til de i XIAP
– /- (Si-kontroll) (
p
0,05), og den (♣) viser en betydelig reduksjon i sammenligning de i XIAP
– /- (Si-RhoGDI) celler (
p
0,001, n = 3)
for å finne spesifikke XIAP domener som er involvert i samhandling. med RhoGDI protein, vi co-transfektert GFP-RhoGDI konstruere med HA-XIAP, HA-XIAP H467A, HA-XIAP ΔRING og HA-XIAP ΔBIR henholdsvis i XIAP
– /- celler. Som vist på fig. 7A, HA-tag ble påvist i co-immun trukket ned av anti-GFP antistoff i transfektanter husing HA-XIAP og HA-XIAP ΔBIR. Videre ble lik affinitet til GFP-RhoGDI observert i transfektanter av HA-XIAP H467A, en mutasjon med tap av E3 ligase aktivitet i RING domene. Mens bare en marginal band av HA ble observert i immun fra HA-XIAP ΔRING transfektanter, avsløre at XIAP RING domene spilt en rolle i samspill med RhoGDI uavhengig på sin E3 ligase aktivitet. I tillegg, selv RING domain of XIAP kunne binde seg til RhoGDI, deres interaksjon resulterte ikke i ubiquitinering av RhoGDI (fig. 7B og 7C). Konjugering av ubiquitin til RhoGDI knapt ble påvist selv i nærvær av eksogent villtype ubiquitin i det immunologiske kompleks trukket ned av GFP som er merket for å RhoGDI (fig. 7B). Heller ikke uttrykker mutant av ubiquitin gjengi noen åpenbare reduksjoner i ubiquitinering av RhoGDI (Fig. 7B). Også var det ingen observerbar forskjell i RhoGDI ubiquitinering blant WT celler og XIAP
– /- celler (Fig. 7B). De lignende funn ble gjengitt i 293T-celler, som vist i fig. 7C. Derfor ble det foreslått at selv om E3 ligaseaktivitet var nødvendig for XIAP-mediert cellemigrasjon, det ikke var avgjørende for RhoGDI bindende, verken for sin ubiquitinational modifikasjon
(A), XIAP
-. /- -celler ble transfektert med GFP-RhoGDI, sammen med HA-XIAP, HA-XIAP H467A, HA-XIAP ΔRING, eller HA-XIAP ΔBIR. Co-immunoutfelling ble utført med anti-GFP antistoff-konjugert agarosekuler. Immunopresipitater ble deretter utsatt for immunblotting for deteksjon av XIAP ved hjelp av HA-antistoff. (B). WT (Vector), XIAP
– /- (Vector) og XIAP
– /- (HA-XIAP) HCT116-celler ble transfektert med konstruksjoner av GFP-RhoGDI i kombinasjon med Ubiquitin-WT, Ubiquitin-K48R, Ubiquitin -K63R eller Ubiquitin-K48R /K63R (KKRR). Førtiåtte timer etter transfeksjon, ble cellene lysert og ko-immunopresipitert med anti-GFP-antistoff, og deretter immunoblottet med anti-Ub og anti-GFP-antistoffer. (C), ble 293T-celler transfektert med forskjellige konstruksjoner som er angitt for deteksjon av RhoGDI ubiquitinering ved hjelp av anti-Ub og anti-GFP-antistoffer. (D) En modell for XIAP regulert modulering av celle motilitet: XIAP bindes til RhoGDI gjennom sin RING domene og hemmer RhoGDI SUMOylation noe som fører til nedregulering av RhoGDI funksjon og fremmer aktin polymerisasjon og celle motilitet. Eller E3 ligase aktivitet XIAP RING domene kan regulere noen un-verifisert faktorer som senere styrer cellemigrasjon uavhengig av RhoGDI bindende.
Diskusjoner
Våre tidligere funn har vist at enten knockout eller knockdown av XIAP redusert HCT116 cellemigrasjon og invasjonen [23]. I denne studien har vi gitt den strukturelle grunnlaget for XIAP for sine tilsynsfunksjoner i kreft metastasering. Ved å innføre ulike XIAP domener i XIAP
– /- celler, vårt arbeid viste at RING domene heller enn BIR domene var nødvendig for β-Actin uttrykk, cellemigrasjon samt RhoGDI interaksjon. E3 ligase aktivitet av RING domain bidratt til de første to effekter, men var ikke involvert i RhoGDI binding eller dets ubiquitinational modifisering, noe som indikerer at rollen til XIAP i regulering av cellulær motilitet var frakoplet fra sin kaspase-hemmende egenskaper, men er relatert til dens RING funksjon hvilken skyldtes blant annet fysisk interaksjon med RhoGDI (fig. 7D).
i sårheling analysen, fant vi at reconstitutive uttrykk for full lengde hA-XIAP og hA-XIAP ΔBIR, som begge har RING domene, inn XIAP
– /- HCT116 cellene restaurert kreft cellemotilitet, mens innføring av HA-XIAP ΔRING eller H467A mutant, som avskaffet sin E3 ligase funksjon, ikke viser åpenbare restaurering, viser at E3 ligase aktivitet XIAP RING domene spilt en rolle i XIAP regulering av kreft cellemotilitet. Endringer i beta-Actin nivåer vekket ved å uttrykke ulike domener av XIAP var i samsvar med deres virkninger i celle migrasjon. Sjefen intracellulære «motor» i celle migrasjon er aktin cytoskjelettet [37]. Tidligere studier antydet at EGF indusert cellemigrasjon ved omorganisering av aktin cytoskjelettet og massiv opphopning av F-aktin [38]. I våre studier, feilfunksjon av aktin polymerisasjon i XIAP
– /- celler kan bli reddet ved å re-konstitusjonelle uttrykk for enten full lengde HA-XIAP eller HA-XIAP ΔBIR, mens overekspresjon av HA-XIAP ΔRING eller H467A viste ingen av disse restaureringer. Etter avtale med våre funn, Mehrotra upubliserte data også hyllet som E3 ligase aktivitet XIAP var avgjørende for dens regulerende rolle i celle metastase basert på observasjonen at H467A XIAP mutant unnlatt å synergize med survivin stimulere NFkB avhengig vei [24]. Derfor var det klart at funksjonen til XIAP i regulering av cellemigrasjon var avhengig av sin E3 ligase aktivitet RING domene heller enn beslektet med sin anti-apoptotiske potensialer.
Det har vært antydet at rollen tilgangspunkter i cellen motilitet kan være evolusjonært konservert siden
Drosophila
IAP homolog DIAP1 har vært innblandet i celle migrasjon og morphogenesis ved regulering av ikke-apoptotiske caspase aktivitet [13]. DIAP1 har vist seg å fremme hårsekkceller migrasjon i egget kammer under
Drosophila
oogenesen via regulere aktiviteten av små GTPase, Rac. Mutasjoner i DIAP1 utstilt defekter i cellevandring sannsynligvis på grunn av endringer i aktin avhengig cellulær organisasjon [13], som var ganske likt med det vi observerte i XIAP
– /- celler i den aktuelle studier. Små GTPases spille viktige funksjoner i en mengde av cellulære hendelser, som regulerer trådformede aktin systemer [39]. Rho familie GTPases fungere som molekylære brytere sykling mellom inaktive BNP-bundet form i cytosol og aktiv GTP-bundet tilstand i cytoplasma membranen [40]. RhoGDI ble karakterisert som en down-regulator av Rho GTPases ved å trekke dem fra membraner og oppløsende dem i cytosol. RhoGDI kan også samhandle med bryter regionene GTPases og begrense tilgjengeligheten til GEFs og hull slik som å holde GTPase i de inaktive tilstander [39]. Som vi rapporterte her, XIAP var i stand til å fysisk samhandle med RhoGDI og hemme sin aktivitet i forskrift aktin cytoskjelettet montering. Så når XIAP var sterkt uttrykt, ble RhoGDI aktivitet trykt som ga en forklaring på observasjoner som banket ned RhoGDI i WT HCT116 cellene ikke påvirke sårheling rate siden RhoGDI aktivitet allerede har blitt hemmet av XIAP, mens i XIAP
– /-. celler hvor undertrykkende effekt på RhoGDI aktivitet var ugyldig, RhoGDI slå ned utstilt mye mer opplagt biologiske effekter
i tillegg har våre studier vist at RING domene (XIAP ΔBIR), men ikke BIR domener (XIAP ΔRING ), kan ko-immunopresipitert i immunkomplekset ved hjelp av antistoff spesifikt mot GFP-RhoGDI. Selv om E3 ligase aktivitet RING domenet ble vist å være nødvendig for cellemigrasjon, gjorde svekkelse av sin funksjon ved H467A mutasjon ikke påvirke samspillet med RhoGDI. Så det ble antatt at i tillegg RhoGDI, kan det være andre nedstrøms mål for E3 ligase aktivitet XIAP ansvarlig for å kontrollere cellemotilitet, som NFkB [24] eller noen un-identifisert faktorer. Selv om E3 ligase aktivitet XIAP bidratt til autoubiquitination av XIAP seg selv og ubiquitinering av sine bindingspartnere, som Smac og AIF ble RhoGDI ikke utsatt for ubiquitin konjugering selv når XIAP ble overexpressed.
Til sammen våre nåværende studier avdekket at E3 ligase aktivitet XIAP RING domene bidratt til aktin polymerisasjon, cytoskjelettet dannelse og cellemigrasjon. Selv RING domene var nødvendig for RhoGDI samhandling som formidlet celle motilities, var dens E3 ligaseaktivitet ikke involvert i RhoGDI binding eller ubiqutination. Alternativet molekylære grunnlaget for sin E3 ligaseaktivitet gjenstår fortsatt å være fullt preget.
Materialer og metoder
Plasmider
plasmider uttrykker HA-merket XIAP, HA-XIAP ΔRING, HA-XIAP ΔBIR, HA-XIAP H467A, og pEBB-HA uttrykk tom vektor, var gaver fra Dr. Colin S Duckett (University of Texas, Austin, Texas) [16]. pEGFP-C3 /RhoGDI vektor uttrykker grønt fluorescerende protein (GFP) -tagged RhoGDI og Rac1 ble vennlig levert av Dr. Mark R. Philips (New York University School of Medicine, New York, NY, USA). pRNA-U6 /siRhoGDI og pEGFP-C3 /mRhoGDI (RhoGDI genet ble mutert fra 403-AAA GGC GTC AAG ATT GAC-420-403-AAG GGA GTA AAA ATC GAT-420 for å hindre ødeleggelse av eksogene mRNA ved den tilsvarende siRNA) var gitt av Dr. BL Zhang som tidligere beskrevet [36]. Menneskelig XIAP og RhoGDI shRNA plasmider ble kjøpt fra Open Biosystems (Pittsburgh, Pennsylvania)
Cell Kultur og Transfeksjon
Wild-type og XIAP
-. /- HCT116-celler (human tykktarmskreft cellelinjer) var hyggelige gaver fra Dr. Bert Vogel (Howard Hughes Medical Institute og Sidney Kimmel Comprehensive Cancer Center, The Johns Hopkins Medical Institutions, Baltimore, MD) [37]. WT og XIAP
– /- HCT116-celler ble dyrket i McCoys 5A medium (Invitrogen, Carlsbad, CA) tilsatt 10% føtalt bovint serum (FBS, Nova-Tech, Grand Island, NE) og penicillin /streptomycin (Life Technologies Grand Island, New York). Celle transfections ble utført med Lipofectamine reagens (Invitrogen) eller FuGENE® HD Transfeksjon Reagens (Roche Applied Science, Indianapolis, IN). For stabil transfeksjon ble kulturer utsatt for hygromycin B eller G418 eller puromycin (Life Technologies) narkotika valg, og cellene overlevende fra antibiotika utvalg ble samlet som stabile masse transfektanter. Disse stabile transfektanter ble deretter dyrket i den valgte antibiotika-fritt medium i minst to passeringer før anvendelse i forsøkene.
Wound Healing Assay
Celler ble sådd ut i hver brønn av seks-brønners plater og dyrket inntil 80% samløpet. Sår ble gjort av sterile pipettespisser. Cellene ble vasket med serumfritt PBS og deretter dyrket i normalt medium for de forskjellige tidspunkter. Bilder ble tatt hvert 24 timer før såret ble leget i foreldre celler [41]. Såret området ble kvantifisert ved hjelp av cellevandring Analysis programvare (Muscale LLC, Scottsdale, Arizona).
Cell Invasion analysen
En BD BioCoatTM MatrigelTM Invasion Chamber (BD Biosciences, San Diego, CA) ble brukt for invasjon analysen. Celler (2,5 × 10
4) ble sådd per innsats i tre eksemplarer i 500 mL serumfrie McCoys 5A medium. Innsett ble plassert i brønner inneholdende 500 ul medium med 5% FBS og TPA (20 ng /ml). Cellene ble inkubert i 72 timer i en inkubator med 5% CO
2 fuktig atmosfære. Deretter celler på den øvre overflate av filtrene ble først avbildet og deretter helt fjernet ved å gni med en bomullspinne. Membranen ble kuttet med en skarp skalpell og plasseres i 96-brønners plate.
