Abstract
Vi evaluerte mekanismen av capsaicin-mediert ROS generasjon i kreft i bukspyttkjertelen celler. Genereringen av ROS var omtrent 4-6 ganger mer sammenlignet med kontrolldyr og så tidlig som 1 time etter behandling capsaicin i BxPC-3 og ASPC-1-celler, men ikke i normale HPDE-6-celler. Den generasjonen av ROS ble hemmet av katalase og EUK-134. Å avgrense mekanismen av ROS generasjon, ble enzymatiske aktiviteter mitokondriell kompleks-I og III-kompleks bestemt i de rene mitokondriene. Våre resultater viser at capsaicin inhiberer omtrent 2,5 til 9% og 5-20% av kompleks-I-aktivitet og 8-75% av kompleks-III-aktivitet i BxPC-3 og ASPC-1-celler respektivt, som var attenuable av SOD, katalase og EUK-134. På den annen side, capsaicin behandling ikke klarte å inhibere kompleks I eller kompleks-III-aktivitet i normale HPDE-6-celler. ATP-nivåene ble drastisk undertrykket ved capsaicin behandling i både BxPC-3 og ASPC-1-celler og dempes med katalase eller EUK-134. Oksydasjon av mitokondrier-spesifikk kardiolipin var betydelig høyere i capsaicin behandlede celler. BxPC-3 deriverte ρ
0 celler, som mangler mitokondrie-DNA, var helt motstandsdyktig mot capsaicin mediert ROS generasjon og apoptose. Våre resultater viser at frigjøring av cytokrom c og spalting av både caspase-9 og caspase-3 på grunn av avbrudd av mitokondriell membranpotensiale ble betydelig blokkert av katalase og EUK-134 i BxPC-3 celler. Våre resultater viser videre at kapsaicin behandling ikke bare inhiberer den enzymatiske aktiviteten og ekspresjon av SOD, katalase og glutationperoksidase men også redusere glutation nivå. Over-ekspresjon av katalase ved transient transfeksjon beskyttet cellene fra capsaicin-mediert ROS generasjon og apoptose. Videre svulster fra mus oralt tilført med 2,5 mg /kg kapsaicin viser nedsatt SOD-aktivitet og en økning i GSSG /GSH-nivåer sammenlignet med kontroller. Til sammen tyder våre resultater involvering av mitokondriell kompleks-I og III i capsaicin-mediert ROS generasjon og nedgang i antioksidantnivå som resulterer i alvorlig mitokondrieskade fører til apoptose i kreft i bukspyttkjertelen celler
Citation. Pramanik KC, Boreddy SR, Srivastava SK (2011) rolle av mitokondrienes elektrontransportkjeden Komplekser i Capsaicin mediert oksidativ stress fører til apoptose i kreft i bukspyttkjertelen celler. PLoS ONE 6 (5): e20151. doi: 10,1371 /journal.pone.0020151
Redaktør: Michael Polymenis, Texas A M University, USA
mottatt: 14 mars 2011; Godkjent: 19 april 2011; Publisert: 25 mai 2011
Copyright: © 2011 Pramanik et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av National Cancer Institute, National Institutes of Health R01 CA129038; R01 CA106953. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
kreft i bukspyttkjertelen er en av de mest dødelige av alle de solide maligniteter i USA [1]. Innsatsen har vært rettet mot utvikling av adjuvant og neoadjuvant terapi i et forsøk på å forbedre overlevelse [1]. Bukspyttkjertel kreft generelt reagerer dårlig på konvensjonelle behandlingsmetoder som kjemoterapi og strålebehandling [2]. Dessverre, toksisitet og iboende motstand av kjemoterapeutisk middel såsom 5-fluorouracil (5-FU) og gemcitabin i kreft i bukspyttkjertelen fortsatt er årsakene til dårlig prognose [3]. Det er ingen enighet om optimale terapeutiske midler kreft i bukspyttkjertelen, derfor utvikling av nye metoder for å forebygge og behandle kreft i bukspyttkjertelen er en viktig oppgave. Epidemiologiske studier fortsette å støtte den forutsetning at kosthold rikt på frukt, grønnsaker og litt krydder kan være beskyttende mot ulike menneske maligniteter inkludert kreft i bukspyttkjertelen og at inntak av chili peppers kan beskytte mot gastrointestinale-relatert kreft [4], [5], [6 ], [7], [8], [9], [10].
capsaicin, en homovanillinsyre-derivat (N-vanillyl-8-metyl-nonenamide) er en aktiv og krydret komponent av varm chili pepper (fig. 1A) [11], [12] og har vært brukt som tilsetningsstoff i lang tid over hele verden, spesielt i Sør-Asia og Latin-amerikanske land [13], [14], [15], [16 ], [17]. Dette alkaloid er blitt brukt til å behandle smerte og inflammasjon, i forbindelse med en rekke sykdommer [18], [19], [20], [21]. Flere nyere studier vist at capsaicin har antiproliferativ effekt på lever [22] mage [23] prostata [24] kolon [25] og leukemiceller [26]. Capsaicin vanligvis utøver sin fysiologisk respons ved å stimulere vanilloid 1 (TRPV-1) reseptoren, men reseptor uavhengige effektene av capsaicin har blitt observert i kreftceller [25], [26], [27]. Capsaicin undertrykker veksten av kreftceller av NF-kB-inaktivering, ROS generasjoner, cellesyklus-stans og modulering av EGFR /HER-2 veier [28], [29], [30], [31], [32], [33 ]. Den nøyaktige molekylære mekanismen som fører til capsaicin oksidativt stress og apoptose forblir uklar. Vi har tidligere vist at capsaicin-indusert apoptose i kreftcellene i bukspyttkjertelen var assosiert med ROS generasjon og mitokondrielle avbrudd [34]. Men den eksakte mekanismen som capsaicin fører ROS generasjon og celledød var ikke klar.
(
A
) Oppbygging av capsaicin. Apoptose induserende effekten av capsaicin (150 um, 24 h) i (
B
) BxPC-3, (
C
) ASPC-en og (
D
) HPDE- 6-celler, ble bestemt ved bruk av annexin-V /FITC og propidiumjodid og analysert ved flow-cytometery. Resultatene er uttrykt som gjennomsnitt ± SD (n = 4) av fire uavhengige eksperimenter. * Statistisk forskjellig sammenlignet med kontroll som analyseres ved t-test (
P 0,05
). (
E
) BxPC-3-celler ble behandlet med ulike konsentrasjoner av capsaicin i 24 timer og (
F
) Cell ble behandlet på ulike tidsintervaller med 150 mikrometer capsaicin og analysert ved immunoblotting for spalting av kaspase-9, caspase-3 og PARP som beskrevet i Materialer og Metoder. Hver blot ble strippet og reprobed med anti-β-actin-antistoff for å sikre lik protein lasting. Disse eksperimentene ble utført tre ganger uavhengig av hverandre med tilsvarende observasjon gjort i hvert forsøk.
I denne studien, viser vi at capsaicin fører ROS (superoksid radikal og hydrogenperoksid) generasjon ved å hemme mitokondrie kompleks-I og komplekset-III-aktivitet og ATP nivåer i BxPC-3 og ASPC-1 humane bukspyttkjertelen kreft cellelinjer, uten å påvirke BxPC-3 deriverte ρ
0 og normale HPDE-6 celler. Samtidig catalase og glutation-peroksydase-aktivitet og ekspresjon ble undertrykt av capsaicin behandling. Supplering cellene med PEG-katalase, PEG-SOD, EUK-134 (katalase mimick) eller trans cellene med katalase nesten fullstendig blokkert capsaicin mediert ROS generasjon og apoptose. I tillegg svulster fra 2,5 mg /kg capsaicin-behandlede mus utviste redusert SOD-aktivitet og en økning i GSSG /GSH nivå. Denne studien gir et direkte bevis på hvordan capsaicin benytter mitokondriene til å forårsake oksidativt stress fører til apoptose i kreft i bukspyttkjertelen celler.
Resultater
Capsaicin utløser apoptose i kreft i bukspyttkjertelen celler, men ikke i normal HPDE-6 celler
Apoptose ble bestemt ved flow cytometery hjelp annexin-V /FITC og propidiumjodid. Behandling av BxPC-3 og ASPC-1-celler med 150 uM kapsaicin i 24 timer resulterte i omtrent 2,5-5 folds økning i apoptose (Fig. 1B-C). Interessant, capsaicin ikke klarte å indusere apoptose i normale HPDE-6-celler (Fig. 1D). Den apoptose induserende effekt av kapsaicin ble ytterligere bekreftet ved western-blotting. Som vist på fig. 1E, capsaicin behandling forårsaket betydelig aktivering av caspase-9, caspase-3 og PARP som tydelig av deres respektive skillelinjer i en konsentrasjonsavhengig måte. På den annen side, gjorde capsaicin behandling ikke forårsaket noen splittelse av caspases eller PARP i normale HPDE-6 celler (data ikke vist). I en tidsavhengig studie, kløyving av caspase 9/3 og PARP var tydelig ved 16 og 24 timer av capsaicin behandling (Fig. 1F).
Capsaicin fører generasjon av mitokondriell ROS i kreft i bukspyttkjertelen celler
Intracellulær ROS generasjon av capsaicin ble evaluert ved flowcytometri hjelp hydroethidine (HE) og DCFDA. Som vist på fig. 2A, i en tidsavhengig studie, capsaicin behandling forårsaket omtrent 8-9 folder økning i superoxydradikalet innen 1-2 timer som gikk ned med 24 h målt ved HE fluorescens ved flow cytometery. Tilsvar generering av hydrogenperoksyd ved capsaicin behandling økte med 4-7 folder i 1-2 timer og deretter redusert, men opprettholdes et nivå høyere enn superoksyd etter 24 timer, målt ved DCF fluorescens ved flow cytometery (Fig. 2B). Genereringen av ROS ble så tidlig som i 1 time, sammenlignet med kontroller i BxPC-3-celler. For å se hvorvidt antioksidanter kan blokkere ROS generasjon ble cellene forbehandlet med PEG-SOD (100 U /ml), PEG-katalase (500 U /ml) eller 50 pM EUK -134 (en celle gjennomtrengelig katalase etterligning) før capsaicin behandling. PEG-SOD nesten fullstendig blokkert superoksidradikalet generasjon, mens PEG-katalase fullstendig blokkert hydrogenperoksyd generasjon som målt ved HE og DCF fluorescens med henholdsvis strømnings cyometery (fig S1A-B). For å bekrefte spesifisiteten av antioksidanter, brukte vi PEG-katalase å blokkere superoksid radikal generasjon. Som forventet, PEG-katalase helt klarte å blokkere superoksid radikal generasjon (Fig S1C). Tilsvarende PEG-SOD mislyktes i å blokkere hydrogenperoksyd generasjon (data ikke vist). I etterfølgende eksperimenter, målte vi total ROS (superoksidradikalet + hydrogenperoksyd) generasjon. Tilsvarende capsaicin behandling økte samlede ROS generering av omtrent 2,5-4,5 ganger i ASPC-1-celler med maksimum ved 2 timer av behandlingen (fig. 2C). Capsaicin behandling førte ikke til noen betydelig ROS generasjon i normale HPDE-6-celler, noe som tyder på at normale celler er resistente overfor effektene av capsaicin (fig. 2D). I en kombinasjonsbehandling, våre resultater tyder på at PEG-SOD, PEG-katalase og EUK-134 vesentlig blokkert capsaicin formidlet total ROS generasjon i BxPC-3 celler (Fig. 2F).
(
A
) og (
B
) BxPC-3-celler ble behandlet med DMSO eller 150 mikrometer capsaicin for ulike tidspunkter og farget med HE og DCFDA og analysert for superoksid radikal og hydrogen peroxide henholdsvis flyt cytometery. (
C
) ASPC-en, (
D
) HPDE-6, (
E
) BxPC-3 ρ
0 celler ble behandlet med 150 mikrometer capsaicin for 2, 4 og 24 timer og analysert for total ROS generasjon (superoksyd og hydrogenperoksyd) ved flow-cytometer etter farging av cellene med HE og DCFDA. Resultatene er uttrykt som gjennomsnitt ± SD (n = 3) fra fire uavhengige eksperimenter og data som representerer gangers økning av ROS generasjon over kontrollen. * Statistisk forskjellig sammenlignet med kontroll som analyseres ved enveis ANOVA etterfulgt av Bonferroni post-hoc test
P 0,05
). (
F
) Effekt av antioksidanter på capsaicin formidlet total ROS generasjon i BxPC-3 celler. Celler ble behandlet med PEG-SOD (100 U /ml), PEG-katalase (500 U /ml) eller EUK-134 (50 uM) i 1 time, etterfulgt av 150 uM kapsaicin i 2 timer. Resultatene er uttrykt som gjennomsnitt ± SD (n = 3) av fire uavhengige eksperimenter. * Statistisk forskjellig sammenlignet med kontroll (
P 0,05
) og ** signifikant forskjell sammenlignet med capsaicin behandling (
P 0,05
), som analysert ved en-veis ANOVA, etterfulgt av Bonferroni innlegg -hoc test.
BxPC-3 deriverte ρ
0 cellene var helt motstandsdyktig mot capsaicin mediert ROS generasjon
for å befeste bidrag av mitokondriene i ROS generasjon av capsaicin, vi genererte ρ
0 varianter av BxPC-3 celler. ρ
0-cellene ble samlet inn og opprettholdes ved inkubering BxPC-3-celler med 60 ng /ml etidiumbromid og 50 mg /ml uridin i 12 uker og karakterisert ved PCR for å bekrefte uttømming av mtDNA og normal oksidative phosphosrylation som rapportert tidligere [35]. Overlevelsen av ρ
0-celler er avhengig av ATP avledet fra anaerob glykolyse. ρ
0 cellene er i stand til å generere ROS fra ETC komplisert som de mangler normal oksidativ fosforylering [35], [36]. Sammenlignet med villtype BxPC-3-celler, ble totalt ROS generasjon ikke i det hele tatt observert i BxPC-3 ρ
0 celler ved behandling med capsaicin (Fig. 2E). Til sammen tyder våre resultater at BxPC-3 ρ
0-cellene ble helt motstandsdyktige mot virkningene av kapsaicin sammenlignet med vill-type BxPC-3-celler.
Kapsaicin behandling inhiberer ETC Kompleks-I og Kompleks iii aktiviteter
MITOKONDRIELLE ETC komplekser er de viktigste generatorer av ROS i celler og vev. Siden vi observert ROS generasjon av capsaicin, ønsket vi å se om mitokondriene er involvert i denne prosessen. Vi har fastslått derfor de enzymatiske aktiviteter og ekspresjon av mitokondriell kompleks I, kompleks II, kompleks-III og kompleks-IV på kapsaicin behandlet BxPC-3, ASPC-1, HPDE-6 og BxPC-3 ρ
0 celler. Capsaicin behandling inhiberer kompleks-I-aktivitet ved ca. 5-20% i BxPC-3 og 2,5 til 9% i ASPC-1-celler henholdsvis, sammenlignet med de respektive kontroller (Fig. 3A-B). På den annen side, som forventet, capsaicin ikke klarte å inhibere kompleks-I-aktivitet in BxPC-3 ρ
0-celler (som mangler mitokondrie DNA) og normale HPDE-6-celler (Fig. 3C). Deretter ønsket vi å undersøke om denne nedgangen i komplekse-I aktivitet kan dempes med anti-oksidanter. Våre resultater viser at forbehandling av celler med katalase eller EUK-134 i hovedsaken blokkerte reduksjoner i kompleks-I-aktivitet ved capsaicin (Fig. 3D). Videre capsaicin behandling signifikant redusert proteinnivåer kompleks-I-protein-komplekset etter 4 timers behandling i en tidsavhengig studium og katalase eller EUK-134 forhindret denne endringen (Fig. 3E-F). Tilsvarende ble kompleks-III-aktivitet ved capsaicin hemmes av 8-75% i begge BxPC-3 og ASPC-1-celler (Fig. 4A-B). Likevel, capsaicin ikke klarte å redusere komplekse-III-aktivitet i BxPC-3 ρ
0 celler (fig. 4C). En beskjeden reduksjon i sammensatt III-aktivitet ble imidlertid ikke observert i HPDE-6-celler ved capsaicin behandling (Fig. 4C). Reduksjonen i kompleks-III-aktivitet i BxPC-3-celler etter kapsaicin ble dempet ved katalase og EUK-134 (fig. 4D). Etter avtale med virksomhetsdata, uttrykk for komplekse-III proteinkompleks ble drastisk redusert i BxPC-3 celler etter capsaicin behandling (fig. 4E). Effekten av capsaicin på proteinnivået av kompleks III ble opphevet ved katalase og EUK-134 (fig. 4F). Våre resultater viser at mitokondrie kompleks-III er mer involvert i capsaicin mediert ROS generasjon sammenlignet med kompleks-I. Capsaicin hadde ingen effekt på kompleks-II og IV (data ikke vist). Samlet utgjør disse resultatene indikerer at hemming av mitokondrie-komplekset Jeg og kompleks-III av capsaicin årsaken ROS generasjon.
enzymatiske aktiviteter mitokondriell kompleks Jeg ble bestemt i de rene mitochondria isolert fra kontroll og 150 mikrometer capsaicin behandlet (
A
) BxPC-3 og (
B
) ASPC-1 celler for 2, 4 og 24 timer. (
C
) Sammenligning av kompleks-I-aktivitet in ASPC-1, BxPC-3, BxPC-3 ρ
0 og HPDE-6-celler behandlet med 150 uM i 24 timer. (
D
) capsaicin-formidlet reduksjon av kompleks-I-aktivitet ble hindret av forbehandling av BxPC-3-celler med katalase (2000 U /ml) og EUK-134 (50 uM) i 1 time, etterfulgt av 150 uM capsaicin i 24 timer. Resultater er uttrykt i løpet av kontrollen som gjennomsnitt ± SD (n = 3) for tre uavhengige eksperimenter. * Statistisk forskjellig sammenlignet med kontroll (
P 0,05
) og ** signifikant forskjell sammenlignet med capsaicin behandling (
P 0,05
), som analysert ved en-veis ANOVA, etterfulgt av Bonferroni innlegg -hoc test. (
E
) Complex-I protein ble bestemt ved immunoblotting bruke ren mitokondrie protein isolert fra kontroll og 150 mikrometer capsaicin behandlet BxPC-3 celler for de angitte tidsperioder eller (
F
) 1 h før behandling med katalase (2000 U /ml) eller EUK-134 (50 uM) fulgt av 150 uM kapsaicin i 24 timer. Immunoblotting for hvert protein ble utført tre ganger, uavhengig av hverandre, og lignende resultater ble oppnådd. Blottene ble strippet og reprobed med anti-Cox-IV for mitokondrielle proteiner for å sikre lik protein lasting.
Mitokondrie kompleks-III-aktivitet ble bestemt i de rene mitochondria isolert fra kontroll og 150 mikrometer capsaicin behandlet (
A
) BxPC-3 og (
B
) ASPC-1 celler for 2, 4 og 24 t. (
C
) Sammenligning av kompleks-III-aktivitet i ASPC-1, BxPC-3, BxPC-3 ρ
0 og HPDE-6-celler behandlet med 150 uM kapsaicin i 24 timer. (
D
) capsaicin-formidlet reduksjon av kompleks-III-aktivitet ble dempet ved forbehandling av BxPC-3-celler med katalase (2000 U /ml) eller EUK-134 (50 uM) i 1 time, etterfulgt av 150 uM capsaicin i 24 timer. Resultater er uttrykt i løpet av kontrollen som gjennomsnitt ± SD (n = 3) av fire uavhengige eksperimenter. * Statistisk forskjellig sammenlignet med kontroll (
P 0,05
) og ** signifikant forskjell sammenlignet med capsaicin behandling (
P 0,05
), som analysert ved en-veis ANOVA, etterfulgt av Bonferroni innlegg -hoc test. (
E
) kompleks-III protein ble bestemt ved immunobloting bruke ren mitokondrie protein isolert fra kontroll og 150 mikrometer capsaicin behandlet BxPC-3 celler for angitte tidsperioder eller (
F
) Forbehandling med katalase (2000 u /ml) eller EUK-134 (50 uM) i 1 time, etterfulgt av 150 uM kapsaicin i 24 timer. Ekspresjon av kompleks-III-proteinet ble bestemt ved immunoblotting fra isolerte mitokondrier rene som beskrevet i fremgangsmåten. Hver blot ble strippet og reprobed med anti-Cox-IV antistoff for å sikre lik protein lasting. Disse eksperimentene ble utført tre ganger uavhengig av hverandre med tilsvarende resultat oppnås i hvert forsøk.
Effekt av capsaicin på mitokondriell ATP generasjon
Mitokondrier er den viktigste kilden til energi for cellene. Vi ved ønsket å vite om capsaicin mediert forstyrrelse av mitokondrie respiratoriske komplekser påvirket ATP generasjon. For å bestemme nivåer av ATP, evaluert vi kompleks-V ATP syntase aktivitet i mitokondriene isolert fra kontroll og capsaicin behandlet BxPC-3 og ASPC-1 celler. Genereringen av ATP er gjennom kompleks-V i mitokondriene. Capsaicin behandling utarmet ATP-nivåer ved ca. 75% i begge BxPC-3 og ASPC-1-celler sammenlignet med kontrollen (Fig. 5A-B). Vi observerte også at katalase og EUK-134 betydelig hindret nedgang i ATP nivåer i respons til capsaicin behandling (Fig. 5C). For ytterligere å bekrefte disse observasjonene, ble ekspresjon av mitokondriell kompleks V-protein bestemt ved western blotting. Våre resultater viser at capsaicin behandling reduserte ekspresjonen av kompleks V-protein som starter så tidlig som 1 time men var mer fremtredende ved 16 og 24 timer (fig. 5D). Denne nedgang i kompleks-V ekspresjon ble dempet ved katalase og EUK-134 (fig. 5E). Samlet våre resultater viser at capsaicin behandling drastisk forstyrrer mitokondrielle funksjoner presser cellene mot apoptose.
(
En
) BxPC-3 (
B
) ASPC-1 celler ble behandlet med DMSO eller 150 uM kapsaicin i 24 timer, og (
C
) BxPC-3-celler ble behandlet med katalase (2000 U /ml) eller EUK-134 (50 uM) 1 time før 150 uM capsaicin behandling i 24 timer, og ATP-syntase-aktivitet ble bestemt i ren mitokondriene protein isolert fra kontroll og behandlede celler som beskrevet i fremgangsmåten delen. Resultatene er uttrykt som gjennomsnitt ± SD (n = 3) for tre uavhengige eksperimenter. * Statistisk signifikant sammenlignet med kontrollen eller ** statistisk signifikant sammenlignet med capsaicin behandling, som analysert ved en-veis ANOVA, etterfulgt av Bonferroni post-hoc-test (
P 0,05
). (
D
) Effekt av capsaicin behandling på komplekse-V protein uttrykk. BxPC-3-celler ble behandlet med DMSO eller 150 uM kapsaicin i angitte tidsperioder eller (
E
) BxPC-3-celler ble behandlet med katalase (2000 U /ml) eller EUK-134 (50 uM) i 1 t før behandling med 150 uM kapsaicin i 24 timer. Ekspresjon av kompleks-V-protein ble bestemt ved immunoblotting i ren mitokondrie protein, som beskrevet i fremgangsmåten i avsnitt. Hver blot ble strippet og reprobed med anti-Cox-IV antistoff for å sikre lik protein lasting. Disse eksperimentene ble utført tre ganger uavhengig av hverandre med tilsvarende resultater som ble oppnådd i hvert forsøk.
Kapsaicin forstyrrer mitokondriemembranpotensialet og forårsake oksydasjon av mitokondriell lipid
Overdreven intracellulær ROS føre cellene til apoptose etter forstyrre mitokondrie membran potensial. Endringen i mitokondriemembranpotensialet av kapsaicin ble således bestemt ved farging av celle med mitokondriemembranen følsomt fargestoff TMRM og analysert ved strømningscytometri. Vi fant at capsaicin behandling signifikant redusert på mitokondriemembranen potensialet i BxPC-3-celler med 26% sammenlignet med kontrollen (Fig. 6A). For å bekrefte om capsaicin mediert ROS fører til endring i mitokondriemembranen potensial, ble katalase og EUK-134 brukt. Forbehandling av celler med begge antioksydanter, etterfulgt av capsaicin fullstendig forhindret fallet i mitokondriemembranen potensial (fig. 6A). Vi undersøkte videre muligheten om capsaicin fortrinnsvis indusere mitokondrie lipidperoksidasjon i BxPC-3 celler. For dette formål ble cellene farget med nonyl- akridinorange (NAO) for å detektere oksidasjon av kardiolipin, en mitokondriemembranen lipidkomponent, ved fluorescens mikroskopi og flowcytometri [37]. Cardiolipin er utelukkende til stede i mitokondrier og etter å ha blitt merket med NAO og utstillinger gul fluorescens. Når vi analyserte cellene under fluorescerende mikroskop, observerte vi at nesten alle celler fra kontrollgruppen ble oppviser gul farge. Men redusert gule flekker og omgjort til grønt i capsaicin behandlede celler indikerer drastisk oksidasjon av kardiolipin (Fig. 6B). Likevel, katalase og EUK-134 fullstendig forhindret oksydasjon av kardiolipin (fig. 6B). Disse resultatene ble bekreftet ved hjelp av strømningscytometri hvor vi observert at capsaicin forårsaker kardiolipin oksydasjon i BxPC-3-celler, som vist ved en forskyvning av NAO fluorescens mot venstre (fig. 6C). Vi har videre brukt katalase og EUK-134 for å se om oksydasjon av kardiolipin kan forebygges. Vi fant at tillegg av katalase eller EUK-134 nesten fullstendig blokkert forskyvning av NAO farging (Fig. 6C) tyder på at nedgangen av NAO fluorescens skyldes oksidasjon av mitokondriell lipid kardiolipin av mitokondrie ROS.
(
A
) BxPC-3-celler ble behandlet med katalase (2000 U /ml) eller EUK-134 (50 uM) i 1 time, etterfulgt av 150 uM kapsaicin i 24 timer og forandringen i mitokondriemembranpotensialet ble bestemt etter farging cellen med mitokondriemembranen følsomt fargestoff TMRM og analysert ved strømningscytometri. Høyre panel viser kvantifisering av mitokondriemembranen potensial. (
B
) Effekt av capsaicin på mitokondrie lipidperoksidasjon. BxPC-3-celler ble behandlet med katalase (2000 U /ml) eller EUK-134 (50 uM) i 1 time før behandling med 150 uM kapsaicin i 24 timer og farget med nonyl- akridinorange (NAO) for å detektere oksidasjon av kardiolipin, en mitokondrie membran lipid komponent av fluorescens mikroskopi, og (
D
) flowcytometri og panel høyre viser kvantifisering av mitokondrie cardiolipid oksidasjon. Representativt resultat fra tre eksperimenter utført uavhengig. * Statistisk forskjellig sammenlignet med kontroll (
P 0,05
) eller ** signifikant forskjell sammenlignet med capsaicin behandling alene (
P 0,05
), som analysert ved en-veis ANOVA, etterfulgt av Bonferroni post-hoc test.
capsaicin-indusert apoptose er attenuable av anti-oksidanter
Vi observerte at capsaicin fører ROS generasjon ved å forstyrre mitokondrienes funksjon. Når mitokondrie funksjoner blir forstyrret, er cytokrom-c frigjøres fra mitokondrier inn i cytosol og aktiverer caspase-3 kaskade som fører cellene inn i apoptose. Vi lurte på om katalase og EUK-134 kan oppheve capsaicin indusert apoptose. Som vist på fig. 7A, PEG-SOD, PEG-katalase og EUK-134 betydelig beskyttet BxPC-3 celler fra Capsaicin indusert apoptose. Disse resultatene ble ytterligere bekreftet ved å evaluere frigjøring av cytokrom-c og spaltning av caspase-3 ved western blotting. Våre resultater viser at både katalase og EUK-134 vesentlig hindret frigjøringen av cytokrom-c i cytosol og spaltning av caspase-3-mediert av capsaicin (Fig. 7C). Det er bemerkelsesverdig at BxPC-3 ρ
0 celler, som er i stand til å produsere ROS gjennom mitokondriene, var helt resistent mot apoptose induserende virkninger av capsaicin (fig. 7B), noe som bekrefter involvering av mitokondriene i capsaicin mediert ROS generasjon og apoptose.
(
A
) BxPC-3-celler ble forbehandlet med PEG-SOD (100 U /ml), PEG-katalase (500 U /ml) eller EUK-134 (50 uM ) i 1 time og deretter behandlet med DMSO eller 150 uM kapsaicin i 24 timer, (
B
) BxPC-3 ρ
0-cellene ble behandlet med DMSO eller 150 uM kapsaicin i 24 timer, og apoptose ble bestemt ved anvendelse av annexin-V /FITC og propidiumjodid og analysert ved flow-cytometery. Resultatene er uttrykt som gjennomsnitt ± SD (n = 3) for tre uavhengige eksperimenter. * Statistisk forskjellig sammenlignet med kontroll (
P 0,05
) eller ** statistisk signifikant sammenlignet med capsaicin behandling (
P 0,05
), som analysert ved en-veis ANOVA, etterfulgt av Bonferroni største post-hoc test. (C) Cytokrom-c og Cl-caspase-3 ble bestemt ved immunoblotting i BxPC-3-celler forbehandlet med katalase (2000 U /ml) eller EUK-134 (50 uM) i 1 time før behandling med 150 uM kapsaicin i 24 h. Hver blot ble strippet og reprobed med anti-aktin antistoff for å sikre lik protein lasting. Disse eksperimentene ble utført tre ganger, uavhengig av hverandre, og tilsvarende resultater ble oppnådd.
Kapsaicin behandling forstyrrer redoks cellulær homeostase resulterer i oksidativt stress
Redox homeostase i en celle er på grunn av en fin balanse mellom den intracellulære ROS og ROS scavenging antioksidanter og enzymsystemer. Redusert GSH er et intracellulært antioksidant og er kjent for å opprettholde cellulær redoks balanse. Vi målte således intracellulære GSH-nivåer og også bestemmes nivåene av oksidert form av GSH (GSSG). Som vist på fig. 8A, capsaicin behandling betydelig økt GSSG nivåer; og redusert GSH nivåer indikerer forskyvning av redoks likevekt mot pro-oksidanter tilstand (fig. 8A-B). De andre enzymsystemer som spiller rolle i redoks balanse inkluderer superoksid dismutase (SOD), katalase og glutation peroxidase (GPX). Superoksidradikaler er generert av kompleks-I og III-kompleks av mitokondrier og blir raskt omdannet til hydrogenperoksid på grunn av dismutering av superoksid dismutase. Som vist på fig. 8C, capsaicin behandling inhiberte 23-51% SOD-aktivitet i en tidsavhengig studium. De to andre enzymer (katalase og gpx) er involvert i avgift intracellulære peroksider inkludert hydrogenperoksid. Våre resultater viser at capsaicin betydelig redusert av den enzymatiske aktivitet av katalase innen 2 timer etter behandlingen (fig. 8D). Disse observasjonene ble bekreftet av katalase protein uttrykk. Vi har observert at katalase ekspresjon ble redusert etter 2 timer av capsaicin behandling (Fig. 8 D-E). Gjennom våre studier, observerte vi at katalase eller EUK-134 tilskudd forhindres ROS generering og beskytter cellene mot de skadelige virkninger av capsaicin, hvilket klart indikerer at katalase spiller en kritisk rolle i capsaicin mediert oksidativt stress og apoptose i kreft i bukspyttkjertelen celler. Siden glutation peroxidase er et annet viktig enzym som benytter GSH som underlag for å avgifte hydrogenperoksid, bestemt vi sin enzymatisk aktivitet og protein uttrykk. Som det kan ses i fig. 8 F-G, capsaicin redusert GPX aktivitet og ekspresjon i BxPC-3-celler i respons til capsaicin behandling. Faktisk var ekspresjonen av GPX betydelig redusert bare etter 1 time med kapsaicin behandling. Til sammen tyder våre resultater at uttømming av GSH nivå og hemming av SOD, katalase og GPX av capsaicin forstyrrer den cellulære redoks homeostase resulterer i økt oksidativt stress.
(A) Virkning av capsaicin på nivåene av oksidert glutation (GSSG). BxPC-3-celler ble behandlet med DMSO eller 150 mikrometer capsaicin for 2, 4 og 24 timer og GSSG og (
B
) GSH nivåer ble bestemt ved hjelp av et kommersielt tilgjengelig kit. Disse forsøk ble gjentatt to ganger med lignende resultater som oppnås hver gang. (
C
) SOD, (
D
) Catalase, (
F
) GPX aktiviteter ble bestemt som beskrevet i metode delen. BxPC-3-celler ble behandlet med DMSO eller 150 uM kapsaicin i 2, 4 og 24 timer. Resultatene er uttrykt som gjennomsnitt ± SD (n = 3) for tre uavhengige eksperimenter. * Statistisk forskjellig sammenlignet med kontroll (
P 0,05
) som analysert ved en-veis ANOVA, etterfulgt av Bonferroni post-hoc test.
(E) og (G)
Ekspresjon av katalase og GPx1 ble bestemt ved immunblotting av BxPC-3-celler behandlet med DMSO eller 150 uM kapsaicin i angitt tidsperiode. Hver blot ble strippet og reprobed med anti-aktin antistoff for å sikre lik protein lasting. Disse eksperimentene ble utført tre ganger, uavhengig av hverandre, og tilsvarende resultater ble oppnådd.
ektopisk ekspresjon av katalase beskytter cellene fra capsaicin mediert ROS generasjon og apoptose
Siden vi observert at capsaicin mediert ROS generasjon , mitokondrieskade og apoptose ble svekket av katalase eller EUK-134, siden ønsket vi å se om ektopisk uttrykk for katalase kan beskytte cellene mot capsaicin mediert skade. Vi transient transfektert cellene med katalase som uttrykker plasmid og var i stand til å oppnå omtrent 1,6 ganger overekspresjon av katalase i forhold til vektorkontrollen (fig. 9A). Nedgangen i katalase ekspresjon av capsaicin behandling ble blokkert i cellene transfektert med katalase (Fig. 9A). Videre, katalase som overuttrykker BxPC-3-celler fullstendig blokkert total ROS generering av capsaicin, og beskytter cellene fra apoptose i forhold til capsaicin behandlede vektor-transfekterte celler (fig. 9B-C). Frigjøringen av cytokrom c og spaltning av caspase-3 ble også fullstendig blokkert på cellene som overuttrykker katalase (Fig. 9A). På fig.
