Abstract
Bakgrunn
CpG island methylator fenotype (CIMP) er en distinkt fenotype forbundet med mikro ustabilitet (MSI) og
BRAF
mutasjon i tykktarmskreft. Nyere undersøkelser har valgt 5 arrangører (
CACNA1G
,
IGF2
,
NEUROG1
,
RUNX3 Hotell og
SOCS1
) som surrogatmarkører for CIMP høy. Imidlertid har ingen studie omfattende evaluert et utvidet sett av metylering markører (inkludert disse 5 merkene) ved hjelp av et stort antall svulster, eller tydet komplekse kliniske og molekylær foreninger med CIMP-høy bestemmes av validerte markør panel.
Metholodology /hovedfunnene
DNA metylering 16 CpG øyer [den over 5 pluss
CDKN2A plakater (P16),
CHFR
,
CRABP1
,
HIC1
,
IGFBP3
,
MGMT
, MINT1, MINT31,
MLH1
, P14 (
CDKN2A Twitter /ARF) og
WRN
] ble kvantifisert i 904 kolorektal kreft ved real-time PCR (MethyLight). I unsupervised hierarkisk clustering analyse, 5 markører (
CACNA1G
,
IGF2
,
NEUROG1
,
RUNX3 Hotell og
SOCS1
)
CDKN2A
,
CRABP1
, MINT31,
MLH1
, P14 og
WRN
var generelt gruppert med hverandre og med MSI og
BRAF
mutasjon.
KRAS
mutasjonen ble ikke gruppert med noen metylering markør, noe som tyder på sin tilknytning til en tilfeldig metylering mønster i CIMP-lav svulster. Utnytte validert CIMP markør panel (inkludert de 5 markører), demonstrerte multivariat logistisk regresjon som CIMP-høy uavhengig var forbundet med høy alder, proksimale beliggenhet, dårlig differensiering, MSI-high,
BRAF
mutasjon, og omvendt med LINE-en hypometylering og β-catenin (
CTNNB1
) aktivering. Mucinous funksjonen, signet ring celler, og p53-negativitet var assosiert med CIMP-high i bare univariat analyse. I lagdelte analyser, forholda CIMP-høye med dårlig differensiering,
KRAS
mutasjon og LINE-en hypometylering betydelig varierte avhengig av MSI status.
Konklusjoner
Vår studie gir verdifulle data for standardisering av bruken av CIMP-høy-spesifikke markører metylering. CIMP-high er uavhengig assosiert med kliniske og viktige molekylære funksjoner i tykk- og endetarmskreft. Våre data tyder også på at
KRAS
mutasjon er i slekt med en tilfeldig CpG island metylering mønster som kan føre til CIMP lave svulster
Citation. Nosho K, Irahara N, Shima K, Kure S , Kirkner GJ, Schernhammer ES, et al. (2008) Omfattende biostatistiske Analyse av CpG Island Methylator Phenotype i tykktarmskreft ved hjelp av en stor populasjonsbasert Sample. PLoS ONE 3 (11): e3698. doi: 10,1371 /journal.pone.0003698
Redaktør: Nils Cordes, Dresden teknologiske universitet, Tyskland
mottatt: 11. juni 2008; Godkjent: 24 oktober 2008; Publisert: 12.11.2008
Copyright: © 2008 Nosho et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av amerikanske National Institute of Health (NIH) gir P01 CA87969, P01 CA55075, P50 CA127003 og K07 CA122826 (til SO), og delvis med tilskudd fra Bennett Family Fund og fra underholdningsindustrien Foundation (EIF) gjennom EIF National Colorectal Cancer Research Alliance (NCCRA). K.N. ble støttet av en stipendet fra den japanske Society for Promotion of Science. Innholdet er utelukkende ansvaret til forfatterne og ikke nødvendigvis representerer den offisielle visninger av NCI eller NIH. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
epigenetisk avvik er viktige mekanismer i menneskekreft [1], [2]. En rekke av tumorsuppressorgener dempes av promoter CpG øy metylering [3], [4]. En undergruppe av kolorektal kreft oppviser utbredt promoter metylering, som er referert til som CpG øya methylator fenotypen (CIMP) [4] – [7]. CIMP høye kolorektal tumorer har vært forbundet med høy alder, kvinnelig kjønn, proksimale beliggenhet, mucinous og dårlig differensiering, mikro ustabilitet (MSI),
BRAF
mutasjon, høy LINE-en metylering nivå, vill-type
TP53
, stabile kromosomer, og inaktive WNT /β-catenin [8] – [23]. Men mange av disse funksjonene henger sammen, og dermed er det viktig å analysere et stort antall svulster ved multivariat analyse for å dechiffrere de komplekse relasjoner mellom CIMP høy og disse kliniske /tumor variabler.
Det er stor heterogeniteten av tumorer med hensyn til CpG øy metylering, og ikke alle CpG-øyer er metylert på tilsvarende måte i tykktarmskreft [15]. Dermed kan valget av CpG øyer vesentlig påvirke funksjonene til CIMP. Faktisk har forskjellige CIMP paneler som brukes i forskjellige studier forårsaket betydelig forvirring [7]. Weisenberger et al. [15] har vist 195 CpG øyer, og valgte fem loci (
CACNA1G
,
IGF2
,
NEUROG1
,
RUNX3 Hotell og
SOCS1
), som kan tjene som surrogatmarkører for CIMP høy. Vi har videre godkjent bruk av 8 markører (ovennevnte fem pluss
CDKN2A plakater (p16),
CRABP1 Hotell og
MLH1
) som en CIMP-høy diagnostisk panel [24 ]. Imidlertid har ingen studie omfattende sammenlignet disse CIMP-high-spesifikke CpG øyer og andre CpG øyer ved hjelp av et stort antall svulster.
I denne studien har vi vurdert 16 CpG øyer, inkludert de nye 5 CIMP markører samt som MINT (metylert i tumor) markører og andre CpG øyer, utnytte hierarkisk clustering analyse på et stort antall kolorektal kreft. Vi har også vurdert hva som kjennetegner CIMP høye svulster bestemmes av en validert markør panel, og interaksjoner av ulike kliniske og tumorfaktorer ved multivariate logistisk regresjonsanalyse. Denne studien gir begrunnelsen for standardisering av CIMP-high-spesifikke metylering markører
Metoder
Study Group
Vi utnyttet databaser av to store prospektive kohortstudier.; Nurses «Health Study (NHS, N = 121,700 kvinner fulgt siden 1976) [25], [26], og helsepersonell oppfølgingsstudie (HPFS, N = 51,500 menn fulgt siden 1986) [26]. En undergruppe av kohort deltakerne utviklet tykktarmskreft i løpet prospektiv oppfølging. Dermed disse kolorektal kreft representerte en populasjonsbasert, relativt objektivt utvalg (i forhold til en enkelt eller noen få sykehus-basert prøve). Tidligere studier på kohortene har beskrevet baseline karakteristikker av cohort deltakere og hendelses kolorektal krefttilfeller, og bekreftet at våre kolorektal kreft var godt representative som en populasjonsbasert utvalg [25], [26]. Kliniske opplysninger ble innhentet gjennom diagrammet gjennomgang av leger. Vi samles parafininnstøpte vevsblokker fra sykehus hvor deltakerne hadde gjennomgått resections av primære kolorektal kreft. Basert på tilgjengeligheten av tilstrekkelige vevsprøver, ble totalt 904 kolorektal krefttilfeller (406 fra mennenes kohort og 498 fra kvinne kohort) inkludert. Kliniske kjennetegn ved sakene er beskrevet i tabell 1 (til venstre, under kolonneoverskriften «Alle saker»). Blant våre kohortstudier, var det ingen signifikant forskjell i demografiske trekk mellom tilfeller med vev som er tilgjengelige og de uten tilgjengelig vev [26]. De fleste svulster har tidligere vært preget av statusene MSI, CIMP,
KRAS
,
BRAF
, p53, β-catenin, LINE-en metylering og 14 av de 16 metylering markører [19], [21], [24], [27]. Men ingen av våre tidligere studier har omfattende analysert de 16 metylering markører i forhold til hverandre, selvstendige sammenslutninger av CIMP med ulike kliniske, patologiske eller tumor molekylære egenskaper, eller interaksjoner av ulike faktorer på de assosiasjoner med CIMP-high etter omfattende biostatistiske metoder . Denne studien representerer en unik roman studie på sikt av 1) en stor utvalgsstørrelse; 2) den validerte sett CIMP-spesifikke metylering markører; 3) antall andre molekylære hendelser analyseres, inkludert 8 andre enn CIMP spesifikke markører, MSI,
KRAS
,
BRAF
, p53, LINE-en metylering og β-catenin CpG øyer ; og 4) omfattende statistiske analyser inkludert unsupervised hierarkisk clustering, utjevning splines å vurdere linearitet, multivariat logistisk regresjon, og stratifisert logistisk regresjon. Således, denne studien erholdt nye data fra de eksisterende materialer og database, som er analoge med nye studier ved hjelp av den godt beskrevne cellelinjer eller musemodeller. Informert samtykke ble innhentet fra alle forsøkspersonene. Tissue innsamling og analyser ble godkjent av Harvard School of Public Health og Brigham and Women Hospital Institutional Review Boards.
Pathologic Examination, DNA Extraction og sekvensering av
KRAS Hotell og
BRAF
For alle tilfeller, patologiske funksjoner, inkludert tumor differensiering, mucinkjertler funksjoner og signetring celler ble undersøkt av en patolog (SO). Dårlig differensiering ble definert som tilstedeværelse av 50% kjertelområdet. Genomisk DNA ble ekstrahert fra parafin vev, og PCR og pyrosekvensering beregnet for
KRAS
kodoner 12 og 13, og
BRAF
kodon 600 ble utført som tidligere beskrevet [28], [29].
mikro Ustabilitet (MSI) Analyse
MSI status ble bestemt av MSI panel inkludert D2S123, D5S346, D17S250, BAT25, BAT26, BAT40, D18S55, D18S56, D18S67 og D18S487 (dvs. 10- men da panel) som tidligere beskrevet [24]. En «høy grad av MSI» (MSI-høy) ble definert som tilstedeværelse av ustabilitet i ≥30% av markørene.
Real-time PCR (MethyLight) for kvantitativ DNA Metylering analyse
Natriumbisulfitt behandling på DNA og påfølgende real-time PCR (MethyLight [30]) ble validert og utført som tidligere beskrevet [31]. Vi kvantifisert DNA metylering i 5 CIMP-spesifikke arrangører (
CACNA1G
,
IGF2
,
NEUROG1
,
RUNX3 Hotell og
SOCS1
) og 11 andre CpG øyer [
CDKN2A plakater (p16),
CHFR
,
CRABP1
,
HIC1
,
IGFBP3
,
MGMT
, MINT1, MINT31,
MLH1
, P14 (
CDKN2A Twitter /ARF), og
WRN
].
COL2A1 plakater (kollagen 2A1-genet) ble anvendt for å normalisere for mengden av templat-bisulfitt omdannet DNA [31]. Primere og prober ble tidligere beskrevet [15], [27], med unntak av
IGFBP3
, P14 og
WRN
: IGFBP3-F, 5′-G
T
T
T
CG GGC GTG AG
T
ACG A-3 «(Genbank No. M35878, nukleotid Nos 1692-1710.); IGFBP3-R, G
AA
TCG
En
CG CA
En
En hoteller, CA CG
A
CT
A
C (nukleotid nr. 1789-1810) og IGFBP3-sonde, 6FAM-
T
CG G
T
TG
T
T
T
AG GGC GAA GTA CGG G-BHQ-en (nukleotid Nos 1760-1784.) (bisulfitt-konverterte nukleotider er markert med fet skrift og kursiv); P14 (CDKN2A /ARF) -F, 5′
T
TG GAG GCG GCG AGA A
T
En T-3 «(Genbank No. L41934, nukleotid nr. 238-256) ; P14-R, 5’CCC CGT
A
A
En
CCG CG
En
En
AT
En
-3 «(nukleotid Nos 332-350.); P14-sonde, 6FAM-5’CGG
TT
C G
T
C GCG AGT GAG GGT T-3 «-BHQ-en (nukleotid Nos 299-320.); WRN-F, 5»-G
T
En TCG
TT
C GCG GCG
TTT
En
T
-3 «(Genbank No. AY442327 , nukleotid Nos 1827-1846).; WRN-R, 5 «-
En
CG
AAA
CCG
En
T
En
TCC GAA
A
TC A – 3 «(nukleotid nr. 1887-1908) og WRN-sonde, 6FAM-
TTT
T
T
T
T
TG CGG
T
CG
T
TG CGG G-BHQ- (nukleotid nr. 1855-1876). PCR tilstand var innledende denaturering ved 95 ° C i 10 minutter etterfulgt av 45 sykluser med 95 ° C i 15 sekunder og 60 ° C i 1 min. En standardkurve ble laget for hver PCR-plate av dupliserte PCR presiseringer for
COL2A1
på sulfitt-konvertert humant genomisk DNA på 4 forskjellige konsentrasjoner (i en 5-gangers fortynning serien). Prosentandelen av metylert referansen (PMR, dvs. grad av metylering) på et bestemt locus ble beregnet ved å dividere
GENE: COL2A1
forholdet mellom mal beløp i en prøve av
GENE: COL2A1
forholdet mellom mal beløp i
Sss
i-behandlet humant genomisk DNA (formodentlig fullt denaturert) og multiplisere denne verdien med 100. Metylering positivitet ble satt som PMR≥4 som tidligere validert [31].
pyrosekvensering for å måle LINE-en Metylering
for å nøyaktig kvantifisere relativt høye LINE-1 metylering nivåer, benyttet vi pyrosekvensering som tidligere beskrevet [21]. LINE-en metylering nivå målt med pyrosekvensering har vist seg å korrelere godt med generell 5-metylcytosin nivå (dvs. genom-DNA-metylering bred level) i tumorceller [32], [33].
Immunhistokjemi for p53 og β-catenin
microarray (TMA) ble konstruert og immunhistokjemi for p53 og β-catenin ble utført som tidligere beskrevet [19], [34]. Passende positive og negative kontroller ble inkludert i hver kjøring av immunhistokjemi. Cytoplasmisk og kjernefysisk β-catenin uttrykk ble registrert separat som enten ingen uttrykk (0), svak uttrykk (1+), eller moderat /sterkt uttrykk (2+). Den β-catenin aktivering poengsum ble beregnet som summen av kjernefysiske score (0-2), cytoplasmatiske score (0-2) og membran score (0 hvis membranfarging var positiv, en hvis membranen uttrykk var tapt), som opprinnelig beskrevet av Jass et al. [35]. Alle immunohistochemically-fargede objektglass ble undersøkt av en av de etterforsker (β-catenin av K.N .; p53 ved S.O.) uvitende om andre data. Stikkprøver av 402 og 118 svulster ble revurdert for β-catenin og p53, henholdsvis av en annen observatør (β-catenin av SO, p53 av KN) uvitende om andre data, og konkordanser mellom de to observatører var 0,83 for β-catenin (κ = 0,65, p 0,0001), og 0,87 for p53 (κ = 0,75, p 0,0001)., noe som indikerer betydelig enighet
Statistical Analysis
for cluster analyse av biomarkører inkludert de 16 metylering markører, MSI,
KRAS Hotell og
BRAF
, benyttet vi gjennomsnittlig kobling hierarkisk clustering med en euklidsk avstand beregning som gjennomføres i MeV (https://www.tm4.org) [36]. Den khikvadrattest ble brukt for å undersøke en sammenheng mellom CIMP og andre kategoriske variabler av interesse. Den t-test forutsatt ulike avvik ble utført for å sammenligne gjennomsnittsalder og mener LINE-en metylering nivå. Den κ koeffisienten ble beregnet til å vurdere avtalen mellom hver av de 16 markører (positive vs negative) og 16-markør CIMP panel (CIMP-høy positiv vs negativ).
For å undersøke relasjonene i en gitt variabel og CIMP høy, vi utnyttet ubetinget logistiske regresjonsmodeller for å beregne odds ratio (ORS) for CIMP høy, i henhold til statusen for gitt variabel, ujustert og justert for alder, kjønn, tumor beliggenhet, scene, differensiering, line- en metylering nivå, og status for MSI,
KRAS
,
BRAF
, p53 og β-catenin. For å justere for potensielle confounding, alder og LINE-en metylering nivå ble brukt som kontinuerlige variabler, og alle de andre variablene ble brukt som kategoriske variabler.
For alder og LINE-en, vi vurderte ikke-linearitet av sannsynligheten ratio test som sammenlignet en regresjonsmodell, inkludert en kvadratisk (eller kubisk) sikt med en modell unntatt den. Sannsynligheten ratio test viste at blant annet den kvadratiske uttrykket ikke vesentlig endre modellen passer (p = 0,86 for alder, p = 0,078 for LINE-1), og at blant annet kubikk sikt ikke vesentlig endre modellen passer (p = 0,87 for alder , p = 0,084 for LINE-1). Vi har også undersøkt muligheten for en ikke-lineær sammenheng mellom alder (eller LINE-en metylering) og CIMP-høy, ikke-parametrisk med begrenset cubic splines [37].
dikotomisert tumor plassering (proksimale vs. distal), tumor differensiering (dårlig vs. brønn /moderat), signetringceller (nåværende vs. fraværende), MSI (høy kontra ikke-MSI-høy), p53 (positiv vs negativ),
KRAS
(mutert vs. vill-type),
BRAF plakater (mutert vs. vill-type) og β-catenin (aktiv vs. inaktiv). Det var 3 kategorier for mucinous funksjonen (0%, 1-49%, og ≥50%) i den første hovedanalysen (tabell 2). Vi dikotomisert mucinous funksjonen (til stede vs. fraværende) i videregående stratifisert analysene og analyser av samspillet, fordi multivariate ORS for CIMP-høy var lik på tvers av 1-49% mucinous og ≥50% mucinkjertler kategorier (i referanse til den ikke-mucinous kategori ). Det var 4 kategorier for trinn (I, II, III og IV) i det første hoved analyse (tabell 2). Vi dikotomisert tumorstadium (I vs. II-IV) i videregående stratifisert analysene og analyser av samspillet, fordi multivariate ORS for CIMP-høy var lik på tvers av stadium II-IV (i referanse til scenen jeg).
Når det var manglende informasjon om tumorstadium (12%), LINE-1 (3,9% mangler), MSI (3,2% mangler), p53 (1,3% mangler),
KRAS plakater (2,3% mangler) eller
BRAF plakater (4,7% mangler), tildelt vi en egen ( «mangler») indikatorvariabel og omfatter de tilfeller i de multivariate analysemodeller. Vi bekreftet at unntatt tilfeller med en manglende variabel ikke vesentlig endre resultatene (data ikke vist). Det var ingen manglende informasjon i andre variabler
En sammenslutning av hver variabel med CIMP-high ble også vurdert i lag av viktige kliniske eller molekylære funksjoner, inkludert alder ( . 65 år gammel vs. ≥65 år gammel ), sex, tumor plassering (proksimale vs. distal), MSI status, og
BRAF
status. For stratifisert analyse, hver multivariate logistisk regresjonsmodell inkludert en variabel av interesse som ble stratifisert etter en gitt stratifying variabel (for eksempel alder) og justert for alle andre variabler (SAS-koder tilgjengelig på forespørsel).
En interaksjon ble vurdert ved å inkludere kryssproduktet sikt av en gitt variabel (for eksempel MSI) og en annen variabel av interesse i en regresjonsmodell, og sannsynligheten ratio test sammenlignet en modell inkludert kryssproduktet sikt med det unntatt den. I tillegg til interaksjoner av enhver variabel med MSI, beliggenhet, alder, kjønn og
BRAF
, undersøkte vi alle mulige gjenværende toveis interaksjoner, og fant ingen signifikante interaksjoner (data ikke vist).
Alle statistiske analyser med unntak for clustering analyse brukes SAS versjon 9.1 (SAS Institute, Cary, NC). Alle p-verdiene var tosidig, og statistisk signifikans ble definert som p≤0.05. Likevel ble flere hypoteser testing vurderes ved tolkning av data, spesielt i å undersøke flere toveis interaksjoner.
Resultater
Evaluering av 16 metylering markører
Vi har fått 904 tykktarmskreft prøver og kvantifisert DNA metylering i de 16 loci [
CACNA1G
,
IGF2
,
NEUROG1
,
RUNX3
,
SOCS1
,
CDKN2A plakater (p16),
CRABP1
,
MLH1
,
CHFR
,
HIC1
,
IGFBP3
MGMT
, MINT1, MINT31, P14 (
CDKN2A Twitter /ARF), og
Adv
] av real-time PCR (MethyLight [30]) analyser. Den første fem loci (opp til
SOCS1
) ble valgt som gode prediktorer for CIMP (CpG island methylator fenotype) ved screening av 195 CpG øyer [15]. Bruken av de første 8 loci (opp til
MLH1
) som en CIMP-høy diagnostisk panelet tidligere er validert [24].
For å evaluere 16 metylering markører på en objektiv måte, vi gjennomført en unsupervised hierarkisk clustering analyse av de 16 metylering markører og status for MSI (mikro ustabilitet), og
KRAS Hotell og
BRAF
onkogener, ved hjelp av 860 svulster med alle disse resultatene tilgjengelig (figur 1 ). De 8 CIMP høye markører (
CACNA1G
,
CDKN2A plakater (p16),
CRABP1
,
IGF2
,
MLH1
,
NEUROG1
,
RUNX3 Hotell og
SOCS1
) ble vanligvis gruppert sammen, noe som indikerer god overensstemmelse mellom metylering mønstre i disse markørene og støtte disse 8 markører som gode CIMP høye markører. I tillegg P14, MINT31 og
WRN
ble også gruppert med 8 markører. De andre 5 metylering markører (
MGMT
,
HIC1
,
CHFR
, MINT1 og
IGFBP3
) ble ikke gruppert tett med hverandre eller 8 markører.
BRAF Hotell og MSI variabler, som har vært kjent for å være assosiert med CIMP-høy [15], [18], [24], ble også gruppert sammen med disse 8 markører, indikerer tette assosiasjoner med CIMP- høy. Spesielt,
KRAS
mutasjonen ble ikke gruppert med noen av metylering markører, noe som tyder på sin tilknytning til en tilfeldig metylering mønster (spesielt i CIMP-lav svulster som har vært forbundet med
KRAS
mutasjon [29 ], se også figur Supplemental S1). Vi brukte clustering analyse bare for undersøkelse av markør clustering, men ikke for svulst klassifisering. Det var på grunn gruppering av markører var meget stabilt med et stort antall tumorer (dvs., med unntak av noen svulster fant ikke vesentlig påvirke resultater), mens tumor klassifisering av clustering analyse basert på de 16 markørene var ikke stabil.
Horisontal og vertikale aksene representerer markører og saker, henholdsvis. Den utvidede visningen av clustering treet for markørene er vist til høyre. De 8 markører i vår CIMP-høy diagnostisk panel (
CACNA1G
,
IGF2
,
RUNX3
,
MLH1
,
SOCS1
CDKN2A plakater (p16),
CRABP1 Hotell og
NEUROG1
) er samlet tett, og støtter at disse markørene er gode CIMP høye markører. Vær også oppmerksom på det nære forholdet mellom MSI,
BRAF Hotell og de 8 CIMP høye markører.
KRAS
mutasjon er ikke gruppert med noen av metylering markører analysert, noe som tyder på at
KRAS
mutasjon (som er assosiert med CIMP-lav [24], [29], se Supplemental figur) er sannsynligvis forbundet med en tilfeldig metylering mønster.
for å beskrive ytelsen til hver av de 16 markørene på en objektiv måte, vi beregnet κ koeffisient (for avtale statistikk), sensitivitet og spesifisitet av hver maker for CIMP- høy diagnosen bestemmes av de 16 markører (tabell Supplemental S1). Den cutoff for CIMP-høy var satt som ≥11 /16 eller ≥ 10/16 denaturert markører basert på fordelingen av
KRAS Hotell og
BRAF
mutasjoner (Supplemental figur), og på den forrige funn som CIMP høy er forbundet med
BRAF
mutasjon og CIMP-low er assosiert med
KRAS
mutasjon [24], [29]. Sensitiviteten og spesifisiteten for hver markør reflekterte samlet samstemmighet av en metylering mønster med de resterende 15 markører. Det var tydelig at resultatene av de 8 CIMP-panel markører (
CACNA1G
,
CDKN2A
,
CRABP1
,
IGF2
,
MLH1
,
NEUROG1
,
RUNX3 Hotell og
SOCS1
) var generelt god. Den κ koeffisient var større enn 0,5 for alle disse 8 markører.
RUNX3
var den eneste beste markør for CIMP-høy diagnose. Blant de andre 8 markører (
CHFR
,
HIC1
,
IGFBP3
,
MGMT
, MINT1, MINT31, P14 og
WRN
), bare MINT31 og P14 viste konsekvent κ koeffisient som er større enn 0,5, og god følsomhet /spesifisitet. Dette var i samsvar med clustering analyse som viste at MINT31 og P14 gruppert med de 8 CIMP-panel markører.
Vi sammenlignet også all-16-markør panel med 8-markør CIMP panel. Bruke 8-maker panelet, eller den 16-maker panel, ble CIMP-høy definert som ≥6 /8 eller ≥11 /16 denaturert markører, henholdsvis. Blant de 904 sakene, 879 tilfeller (97,2%) viste konkordant diagnosen CIMP status mellom 16-markør panel og 8-markør panel (κ = 0,89, p 0,0001). Når 16-markør CIMP panel ble brukt, sammenslutninger av CIMP-high med kliniske og molekylær funksjonene var svært lik de CIMP-høye foreninger ved 8-markør CIMP panel (data ikke vist). Vi har også bekreftet en høy grad av enighet (98,6% konkordant, κ = 0,94) mellom 8-markør panel og 5-markør panel beskrevet av Weisenberger et al. [15]. Derfor, i senere analyser, brukte vi åtte-markør CIMP panel som vi hadde omfattende validert [24].
CIMP-high i tykktarmskreft
Vi vurderte klinisk, patologisk og molekylære funksjoner CIMP-høy kolorektal kreft (tabell 1). Ved univariat analyse, CIMP-høy var assosiert med kvinnelig kjønn, alder, proksimale beliggenhet, dårlig differensiering, mucin, signetring celler, MSI-high og
BRAF
mutasjon, og omvendt med stadium I,
KRAS
mutasjon, LINE-en hypometylering, positive p53, og aktiv β-catenin (alle p 0,004).
Age ble lineært assosiert med CIMP-high i logistisk regresjonsanalyse (p for trend 0,0001). Vi viste ikke signifikant ulinearitet ved sannsynligheten ratio test som sammenlignet en modell inkludert en kvadratisk (eller kubisk) sikt med en modell unntatt det (p 0,85). Likeledes LINE-en hypometylering ble omvendt lineært assosiert med CIMP-høy (p for trend 0,0001), og det var ingen signifikant ulinearitet ved sannsynligheten ratio test, ved hjelp av et kvadratisk (eller kubisk) sikt (p≥0.078) . Ikke-para begrenset kubiske splines støttet også en lineær sammenheng mellom alder og CIMP-høy (figur 2) og en invers lineær sammenheng mellom LINE-en hypometylering og CIMP-høy (figur 3).
Logg
e (OR for CIMP-høy) (y-aksen) i henhold til alder (x-aksen) er vist (med ung alder som en referent). Brutte linjer angir 95% konfidensintervall. Legg merke til lineær sammenheng mellom alder og CIMP-høy. CIMP, CpG island methylator fenotype; OR, odds ratio.
Logg
e (OR for CIMP-høy) (y-aksen) i henhold til LINE-en metylering (x-aksen) er vist (med høyt nivå LINE-1 metylering som en referent). Brutte linjer angir 95% konfidensintervall. Legg merke til den inverse lineær sammenheng mellom LINE-en hypometylering og CIMP høy. CIMP, CpG island methylator fenotype; LINE-en, lange ispedd nucleotide element-1; OR, odds ratio.
I multivariat logistisk regresjonsanalyse, CIMP-høy var signifikant forbundet med høy alder, proksimale beliggenhet, dårlig differensiering, MSI-high og
BRAF
mutasjon, og inverst med aktiv β-catenin og LINE-en hypometylering (tabell 2). Men alle de andre funksjonene (kvinnelig, scene, mucin, signetring celler,
KRAS Kjøpe og p53) ikke lenger var signifikant assosiert med CIMP-high i multivariat analyse. Vi undersøkte videre for potensielle confounders i foreningen av hver variabel med CIMP høy. Med unntak av sex, som alle de andre variablene viste betydelige endringer i odds ratio (OR) for foreningen med CIMP-høy etter justering for MSI,
BRAF Hotell og /eller svulst plassering (eller andre variabler) (tabell 2 ). Disse resultatene indikerer eksistensen av komplekse relasjoner mellom kliniske og molekylære funksjoner (inkludert CIMP) i tykktarmskreft, som er oppsummert i figur 4.
Den stiplede linjen viser relativt svak sammenheng.
foreninger med CIMP-high i lag av MSI
molekylær klassifisering av MSI status er stadig viktigere i tykk- og endetarmskreft [38] – [40]. Derfor undersøkte vi forholdet av kliniske og tumor variabler med CIMP-high i MSI-høye tumorer og ikke-MSI-høye tumorer (Tabell 3). Alder, proksimale beliggenhet og
BRAF
mutasjon var signifikant assosiert med CIMP-høy i både MSI-høye og MSI-høye svulster. I kontrast, forholda CIMP-high med dårlig differensiering,
KRAS
mutasjon og LINE-en hypometylering ut til å være annerledes i henhold til MSI status (p for samhandling 0,005). CIMP-høy var assosiert med dårlig differensiering og omvendt proporsjonalt med
KRAS
mutasjon i MSI-høy-tumorer, men ikke i ikke-MSI høye tumorer. LINE-en hypometylering ble omvendt assosiert med CIMP-high i ikke-MSI-høye svulster, men ikke i MSI-høye svulster.
Foreninger med CIMP-high i lag av svulst plassering
Det er vist for en molekylær forskjell mellom nære og fjerne kolorektal kreft [38], [41]. Derfor undersøkte vi forholdet av kliniske og tumor variabler med CIMP-høy i proksimale svulster og distale svulster (tabell 4). Forholda CIMP-high med variablene ikke ut til å variere i henhold til tumor plassering (alle p for samhandling 0,23).
Foreninger med CIMP-high i andre stratifisert analysene
Vi undersøkte forholdet av kliniske og tumor variabler med CIMP-high i lag av kjønn, alder ( 65 år gammel vs. ≥65 år gammel) og
BRAF
status. Vurderer flere hypoteser testing (12-hypoteser testing hver), gjorde effekten av variablene ikke ut til signifikant forskjellig i forhold til alder (alle p for samhandling 0,03) og kjønn (alle p for samhandling 0,02). Spesielt, effekten av LINE-en hypometylering synes å variere i henhold til
BRAF
status (p for interaksjon = 0,001) (tabell 5). En signifikant invers assosiasjon av LINE-en hypometylering med CIMP-høy var til stede i
BRAF
-mutated svulster [justert OR = 0,022; 95% konfidensintervall (CI), 0,003 til 0,17], men ikke i
BRAF
-wild-type tumorer (justert OR = 0,87; 95% CI, 0,25 til 3,06)
Vi har også undersøkt alle de gjenværende potensielle toveis interaksjoner av tilgjengelige kliniske og tumor variabler, og fant ingen signifikante interaksjoner med hensyn til de assosiasjoner med CIMP-høy (data ikke vist).
Diskusjoner
i denne studien benytte en stor utvalgsstørrelse, evaluert vi 16 metylering stakere på en objektiv måte. De 16 metylering markører inkludert de 5 markører (
CACNA1G
,
IGF2
,
NEUROG1
,
RUNX3 Hotell og
SOCS1
) som ble valgt ved screening av 195 CpG øyer [15] og ytterligere validerte å bli inkludert i CIMP-høy diagnostisk panel (det over 5 pluss
CDKN2A
,
CRABP1 Hotell og
MLH1
) [24]. Ved unsupervised hierarkisk clustering analysen ble de 5 metylering markører gruppert med hverandre så vel som med MSI (mikro ustabilitet) og
BRAF
mutasjon. Analyse av κ koeffisient, sensitivitet og spesifisitet også vist gode resultater av de 5 metylering markører med generelt konkordant metylering mønster. Utnytte validert CIMP panel, har vi tydet de komplekse relasjoner CIMP-high med forskjellige kliniske, patologiske og molekylære funksjoner i tykk- og endetarmskreft. Våre data gir en begrunnelse for av den validerte CIMP spesifikke metylering markør panel.
Denne studien er den første omfattende undersøkelse for å sammenligne de 5 nye CIMP høye markører [15] med MINT1, MINT31 og andre CpG øyer ved hjelp av en stor prøvestørrelse. Utførelse av de 5 nye markører (
CACNA1G
,
IGF2
,
NEUROG1
,
RUNX3
, og
SOCS1
),
CRABP1 Hotell og
MLH1
var konsekvent overlegen som i
WRN
, MINT1,
CHFR
,
IGFBP3
,
HIC1
