Abstract
Lungekreft er en av de mest vanlige typer kreft og årsaker 1,38 millioner dødsfall årlig, som i 2008 på verdensbasis. Identifisere naturlige anti-lunge kreft agenter har blitt svært viktig. Gambogenic syre (GNA) er en av de aktive forbindelsene ifølge Gamboge, en tradisjonell medisin som ble brukt som en drastisk avføringsmiddel, brekkmiddel, eller vermifuge for behandling av bendelorm. Nylig har økende bevis indikerte at GNA utøver lovende anti-tumor effekter; men er fortsatt den underliggende mekanismen uklart. I denne artikkelen, fant vi at GNA kan indusere dannelsen av vakuoler, som ble knyttet til autofagi i A549 og HeLa celler. Videre undersøkelser viste at GNA utløser initiering av autophagy basert på resultatene av MDC flekker, AO farging, akkumulering av LC3 II, aktivering av Beclin 1 og fosforylering av P70S6K. Men degradering av p62 ble avbrutt og gratis GFP ble ikke utgitt i Gna behandlede celler, som indikerte en blokk i autofagi forandring. Videre studier viste at Gna blokkerer fusjon mellom autophagosomes og lysosomer ved å hemme forsuring i lysosomer. Denne dysfunksjonelle autofagi spiller en pro-død rolle i GNA-behandlede celler ved å aktivere p53, Bax og kløyvde caspase-3 samtidig redusere BCL-2. Beclin en knockdown sterkt redusert GNA-indusert celledød og effekter på p53, Bax, kløyvde caspase-3 og BCL-2. Lignende resultater ble oppnådd ved bruk av en xenograft modell. Våre funn viser, for første gang, at GNA kan føre til avvikende autofagi å indusere celledød og kan foreslå potensialet anvendelsen av GNA som et verktøy eller levedyktig stoffet i kreftterapi
Citation. Mei W, Dong C Hui C, Bin L, Fenggen Y, Jingjing S, et al. (2014) Gambogenic Acid Kills lungekreft celler gjennom Aberrant Autophagy. PLoS ONE 9 (1): e83604. doi: 10,1371 /journal.pone.0083604
Redaktør: Eric Asselin, University of Quebec i Trois-Rivieres, Canada
mottatt: 18 juni 2013; Godkjent: 05.11.2013; Publisert: 10 januar 2014
Copyright: © 2014 Mei et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av Natural Science Foundation of China National, nr 81173600 (Q.-L. Li); Foundation National Natural Science of Anhui-provinsen i Kina, nr 11040606M190 (Q.-L. Li) og Key Project i National Science Technology Pillar Program 2009ZX09103-399 (Q.-L. Li, Co-PI). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Lungekreft har vært en av de mest vanlige typer kreft i flere tiår, og står for 15-20% av alle kreftrelaterte dødsfall globalt [1] – [2]. I 2008 ble anslagsvis 1,61 millioner nye tilfeller per år rapportert på verdensbasis. Lungekreft er en viktig dødsårsak i den vestlige verden og den vanligste kreftformen i Kina [3]. Kirurgisk reseksjon er den primære metode for behandling av lungekreft. Imidlertid er kjemoterapi /strålebehandling likevel effektiv behandling for pasienter med fremskreden ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) og småcellet lungekreft [4]. Følgelig er nye terapeutiske strategier og medikamenter presserende behov for behandling av lungekreft.
Autophagy er et fysiologisk selvfordøyelsesprosess som forringer cytoplasma-komponentene for å opprettholde cellulær metabolisme under næringsmangel og /eller metabolsk stress. Under autophagy, makromolekyler, langlivede proteiner og skadede organeller (slik som det endoplasmatiske retikulum og mitokondrier) er omgitt av autophagosomes. De autophagosomes deretter fusjonere med lysosomer, hvor sequestered innholdet gjennomgår nedbrytning og gjenvinning av hjemmehørende hydrolaser. Autophagy er viktig i alle celler for fjerning av langlivede proteiner eller skadede organeller. Denne evnen gjør autophagy å være en lovende kandidat for en overlevelsesmekanisme som reaksjon på flere påkjenninger [5]. Imidlertid har flere nyere studier antydet at autofagi fungerer også som en pro-død mekanisme forårsaket av anti-tumor terapi [6] – [9]. Faktisk er autophagic celledød anses å være programmert celledød type II, mens apoptose er programmert celledød type I [10]. Disse to typer av celledød er blitt beskrevet som distinkte former av celledød; men mange studier viser krysstale mellom de to typene. For eksempel, p53, som er en potent induser av apoptose, kan også indusere autophagy gjennom å øke ekspresjonen av
dram
, en direkte p53 målgen [11]. Beclin 1 /Atg 6 er en del av en type III PI3 kinase kompleks som er nødvendig for dannelsen av autophagic vesiklene. Interferens med Beclin en kan hindre induksjon av autophagy. Forstyrrelse av samspillet mellom BH3 domenet Beclin 1og BCL-2 fører til økt autofagi [12] – [13].
Gambogenic syre (GNA, C38H46O8, MW 631,32) (figur 1A) er en av de viktigste aktive komponentene i Gamboge, en harpiks utstrålte fra Garcinia hanburyi treet [14]. Gamboge er en tradisjonell medisin som ble brukt som en drastisk avføringsmiddel, brekkmiddel, og vermifuge for behandling av bendelorm. Gamboge har vært brukt i behandling av kreft, inkludert brystkreft, lungekreft, lymfatisk sarkom og karsinom cutaneum [15], i en klinikk i Kina og har vist begge effekter [16]. Nylig har akkumulerende bevis vist at den viktigste aktive komponent GNA har et bredere spektrum av antitumoreffekter og lavere toksisitet [17] – [19]. De molekylære og biokjemiske virkninger av GNA omfatter induksjon av apoptose i forskjellige cancercellelinjer og dyremodeller av karsinogenese [20] – [24]. Yu et al. har funnet ut at GNA kan føre GSK3b avhengig G1 arrest i lungekreftceller og foreslo at GNA kan indusere celledød gjennom autofagi snarere enn apoptose [25]. Men de molekylære mekanismene bak effekten av GNA fortsatt uklare. De foreliggende studier viser den molekylære mekanisme og rollen til autophagy i GNA-fremkalt tumor celledød.
A, Den kjemiske strukturen til GNA. B, hemmer GNA vekst og inhiberer celledød i kreftceller. A549 og HeLa-celler ble behandlet med forskjellige konsentrasjoner av GNA for de angitte tidsperioder, og celleproliferasjon ble analysert ved MTT-assay. C, ubehandlede celler (kontroll) eller celler behandlet med 3 uM GNA i 24 timer ble observert direkte under et fasekontrastmikroskop (til venstre) og celle vacuolization ble kvantifisert (høyre); minst 600 celler ble observert. Betyr ± SEM, n = 3.
Materialer og metoder
Mus ble opprettholdt i en bestemt patogen-fritt miljø. Alle dyreforsøk ble godkjent av dyrevelferd rådgivende komité ved University of Science and Technology i Kina (Permit Number: 2010-11). Tilstrekkelige tiltak ble tatt for å redusere smerte og ubehag i samsvar med nasjonale bestemmelser.
1. Reagenser og antistoffer
Gambogenic syre (GNA) (figur 1A), isolert fra Gamboge, ble levert av Prof. Xiaoshan Wang lab. GNA renhet var 99%, noe som ble bestemt ved HPLC-DAD. MTT, monodansylcadaverine (MDC), propidiumjodid (PI), ble Annexin V, akridinorange og Hoechst 33342 innkjøpt fra Sigma. Rapamycin og trehalose var snill gaver fra Prof. Guanghui Wang. MitoTracker Rød, LysoTracker Rød og LysoSensor Grønn DND-189 ble oppnådd fra Invitrogen. LC3 antistoffer ble kjøpt fra Novus (NB100-2220), P62 antistoffer var fra Biomol (PW9860), P70S6K (1494-1), p-P70S6K (3204-1) og p-p38 (1229-1) antistoffer var fra Epitomics. GAPDH antistoff ble kjøpt fra Chemicon (MAB374). GFP (sc-9996), caspase-3 (sc-7148), p53 (sc-6243), Bax (sc-7480), Beclin 1 (SC-11427), og BCL-2 (sc-7382) antistoffer ble kjøpt fra Santa Cruz Biotechnology. Reagensene ble oppløst i fosfat-bufret saltvann (PBS), med unntak av GNA og rapamycin, som ble fremstilt i DMSO.
2. Cellekultur
Den menneskelige lunge adenokarsinom cellelinje A549 ble kjøpt fra Celle Bank of Shanghai Institute of Cell Biology. Den menneskelige epithelial karsinom cellelinje HeLa og etablerte GFP-LC3 /HeLa-celler ble levert av Prof. Guanghui Wang [26]. For etablering av en stabil cellelinje som uttrykker EGFP-kondensert LC3, ble HeLa-celler transfektert med EGFP-LC3, og individuelle kloner som stabilt uttrykker GFP-LC3 ble valgt ved bruk av 0,2 mg /ml G418. En moderat ekspresjon klon resistente overfor G418 ble valgt for videre eksperimenter. SPC-A-1, ble H460, GIC-82 og 16-HBE levert av Prof. Guang-Biao Zhou [25]. Cellene ble dyrket i Dulbeccos modifiserte Eagle-medium (DMEM) (Sigma) inneholdende 10% føtalt bovint serum (FBS) (Invitrogen), 100 U /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin ved 37 ° C under 5% CO
2.
3. Cellelevedyktigheten Assay
MTT-analyse.
Celler ble sådd ut i 96-brønners plater i en tetthet på 1 x 10
4 celler i 100 ul medium per brønn i 24 timer før eksperiment. Deretter ble cellene deretter inkubert med forskjellige konsentrasjoner av GNA ved 37 ° C i den angitte tidsvarighet. MTT-løsning ble tilsatt til kulturmediet (500 ug /ml endelig konsentrasjon) ved 4 timer før slutten av behandlingen. Reaksjonen ble stoppet ved tilsetning av 10% SDS surgjort (100 pl) til hver brønn. Absorbansverdien (A) ved 490 nm ble målt ved hjelp av en automatisk mikroplateleser (Bio-Tek ELX 800uv, Bio-Tek Instrument Inc, Winooski, VT, USA). Celleviabilitet ble uttrykt som (Asample – Ablank) /(Acontrol – Ablank) × 100%, hvor A er absorbans. For celler behandlet med reagenser, ble bærer-behandlede celler anvendt som kontroll. Det tomme representert MTT tilsatt til mediet.
PI eller Annexin V /PI strømningscytometri-analyse.
Celler ble behandlet med de angitte konsentrasjoner av GNA i 24 timer, høstet ved trypsinering, deretter vasket to ganger med PBS, inkubert med PI alene eller sammen med annexin V-fluorescein-isotiocyanat i 10 min i fravær av lys og evaluert ved flow-cytometri (Becton rapamycin ble anvendt som en positiv kontroll.
A, Representative bilder av MDC farging. A549-celler ble behandlet med 3 uM GNA i 24 timer, deretter farget med 10 uM monodansylcadaverine (MDC) og observert under et fasekontrastmikroskop. B og C, akridin orange farging. Celler ble utsatt for de angitte konsentrasjoner av GNA i 24 timer, deretter farget med 1 pg /ml akridinorange (B, C) og observert under et fasekontrastmikroskop (B) eller analysert ved strømningscytometri (C). Celler som ble behandlet med 50 ug /ml av rapamycin ble anvendt som en positiv kontroll. Resultatene som er vist er representative for minst 2 uavhengige eksperimenter. D, Representasjonselektronmikroskopi bilder av GNA-behandlede A549 celler. Cellene ble behandlet med 3 uM GNA for de angitte tidsperioder og analysert ved elektronmikroskopi. Pilene viser vakuoler i kontakt med blemmer som var tett fylt med multi-lameller.
Tilstedeværelsen av autophagosomes, som viser dobbel-membran vesikkel strukturer, anses å være kjennetegnet av autophagy. Vi har undersøkt om denne konstruksjon utformet i GNA-behandlede A549-celler under et elektronmikroskop (EM). Som vist i figur 2D, vises GNA-behandlede celler økt dannelse av autophagosomes i forhold til kontrollceller.
3. GNA utløser dannelsen av autophagic markører i A549 og HeLa-celler
For å bekrefte GNA-mediert induksjon av autofagi, undersøkte vi uttrykket av autofagi markører, inkludert LC3. Under autofagi, er LC3 konvertert fra den frie formen (LC3-1) til en proteolytisk behandlet mindre form (LC3-II). GFP-LC3 /HeLa-celler, som stabilt uttrykker GFP-LC3, ble behandlet med de angitte konsentrasjoner av GNA i 24 timer; Disse GNA-behandlede celler viste en dramatisk økning i punctata fordelingen av GFP-LC3 på en konsentrasjonsavhengig måte, mens det ubehandlede celler viste en diffus GFP-LC3 utseende. Kvantitering indikerte at det antall celler som inneholdt minst 5 GFP-LC3 avbryte prikker også økte på en konsentrasjonsavhengig måte (figur 3A). Western blotting-analyse av GNA-behandlede A549-celler viste en bemerkelsesverdig økning i nivået av LC3-II i et treringstrinnet og tidsavhengig måte (figur 3B). Lignende resultater ble oppnådd i H460, SPA-C-1 og Glc-82 lungekreft cellelinjer, mens den normale lunge cellelinje 16-HBE var mindre følsom for GNA (figur S1B).
A, Effekter av GNA på fordelingen av GFP-LC3 punctuates. GFP-LC3 /HeLa-celler ble behandlet med forskjellige konsentrasjoner av GNA eller 50 ug /ml av rapamycin i 24 timer, deretter påvist ved fluorescens mikroskopi. Prosentandelen av celler med minst 5 GFP-LC3 Punktum prikker ble beregnet; minst 600 celler ble observert, middelverdier ± SEM, n = 3, ** betyr p 0,01, en-veis ANOVA. B, Effekter av GNA på LC3 protein. A549-celler ble behandlet med forskjellige konsentrasjoner av GNA i 24 timer eller 3 uM GNA for de angitte tidsperioder, og deretter analysert ved western blotting under anvendelse av anti-LC3 antistoffer. GAPDH protein ble anvendt som kontroll lasting. Baren Grafen viser bandet intensiteter av LC3-II i forhold til de av GAPDH. Gjennomsnitt ± SEM, n = 3, * betyr p 0,05, ** p 0,01, enveis ANOVA. C, Effekter av GNA på Beclin1 protein. A549-celler ble behandlet med 3 uM GNA for de angitte tidsperioder, og deretter analysert ved western blotting under anvendelse av anti-Beclin1 antistoffer. GAPDH protein ble anvendt som kontroll lasting. Baren Grafen viser bandet intensiteter av Beclin en i forhold til de av GAPDH. Gjennomsnitt ± SEM, n = 3, * betyr p 0,05, ** p 0,01, enveis ANOVA. D, Effekter av GNA på P70S6K fosforylering. A549-celler ble behandlet med 3 uM GNA for de angitte tidsperioder, og deretter analysert ved western blotting ved anvendelse av anti-P70S6K og anti-p-P70S6K antistoffer. GAPDH protein ble anvendt som kontroll lasting. Baren Grafen viser bandet intensiteter av p-P70S6K forhold til de av GAPDH. Gjennomsnitt ± SEM, n = 3, * betyr p 0,05, ** p 0,01, enveis ANOVA
Nivåene av Beclin en, en ATG genprodukt som er avgjørende for autofagi [. ,,,0],28], tydelig økt over tid i GNA-behandlede A549 celler (Figur 3C). Det ser /thr-kinase mTOR fungerer som en gatekeeper i autophagy prosessen og reduserte mTOR-aktivitet har vært forbundet med forhøyede nivåer av autophagy. P70S6K er et substrat av mTOR og dets fosforylering er avhengig av mTOR-aktivitet. Vi fant ut at P70S6K fosforylering tydelig redusert over tid etter GNA behandling (figur 3D), som indikerer redusert mTOR-aktivitet. Sammen utgjør disse resultatene sterkeste at GNA utløser oppstart av autophagic markører i A549 og HeLa celler.
4. GNA hemmer fusjon mellom autophagosomes og autolysosomes
Fordi GNA utløste initiering av autophagic markører, lurte vi på om GNA kan utløse autophagic forandring. For å løse dette spørsmålet, vurderte vi om endringer skjedd i GFP-LC3, som også har blitt brukt til å overvåke autophagic forandring. Når GFP-LC3 leveres til en lysosomet, den LC3 delen av kimærene er følsomme for degradering, mens GFP-proteinet er forholdsvis motstandsdyktig mot hydrolyse. Derfor måle nivåene av spaltet GFP ved western-blotting kan overvåke strømmen av autophagy. Som vist i figur 4A, er nivået av frie GFP noe endret ved GNA behandling, mens GFP-LC3-II tydelig økt over tid. Meget forskjellige resultater ble observert ved behandling med trehalose (en normal autophagy induser), som ble anvendt som en positiv kontroll. Vi overvåket ytterligere nivået av endogent p62 /SQSTM1, en autophagy-lysosomet substrat som er forbundet med autofagi-lysosomal degradering protein. Oppbyggingen av p62 er ansett for å være en markør for inhibering av autophagy eller avbrudd av autophagic degradering. GNA blokkeres nedbrytningen av p62 i en treringstrinnet og tidsavhengig måte (figur 4B), som antyder at GNA hemmer autophagic degradering. Lignende resultater ble oppnådd i H460, SPA-C-1 og Glc-82 lungekreft cellelinjer, mens den normale lunge cellelinje 16-HBE var mindre følsom for GNA (figur S1B).
A, Effekt av GNA på fluksen av autophagy. GFP-LC3 /HeLa-celler ble dyrket i fravær (kontroll) eller nærvær av 3 uM av GNA for de angitte tidsperioder, og nivået av spaltede GFP ble analysert ved Western-blotting ved anvendelse av en anti-GFP antistoff; 100 mM trehalose ble anvendt som en positiv kontroll. GAPDH protein ble anvendt som kontroll lasting. Baren Grafen viser bandet intensiteter av GFP-LC3-II eller spaltet GFP i forhold til de av GAPDH. Gjennomsnitt ± SEM, n = 3, * betyr p 0,05, ** p 0,01, enveis ANOVA. B, dose- og tidsavhengige effekter av GNA på p62 degradering. A549-celler ble behandlet med forskjellige konsentrasjoner av GNA i 24 timer eller 3 uM GNA for de angitte tidsperioder, og de P62 proteinnivåer ble analysert ved western blotting. GAPDH protein ble anvendt som kontroll lasting. Baren Grafen viser bandet intensiteter av p62 i forhold til de av GAPDH. Gjennomsnitt ± SEM, n = 3, ** p 0,01, enveis ANOVA. C, Inhibering av sammensmeltingen mellom autophagosomes og lysosomer ved behandling med GNA. GFP-LC3 /HeLa-celler ble behandlet med 3 uM GNA for de angitte tidsperioder og deretter farget med 75 nM LysoTracker Rød (LTR) i 15 min. Representative fluorescens mikroskopi bilder vises. D, Inhibering av lysosomet surgjøring ved behandling med GNA. A549-celler ble behandlet med 3 uM GNA for de angitte tidsperioder eller 500 pM av bafilomycin A1 i 8 timer og deretter farget med 1 mM LysoSensor Grønn DND-189 i 15 min. Representative fluorescens mikroskopi bilder vises.
Samlet utgjør disse funnene sterkt at GNA kan forstyrre nedbrytning av autophagy på et sent stadium.
Vi neste avhørt som prosessen blir påvirket av GNA. Vi undersøkte effekten av GNA på colocalization av autophagosomes og lysosomer. Som vist i figur 4C, mange små, intenst farget GFP-LC3 prikker (autophagosomes) og LysoTracker Rød (LTR) -stained prikker (lysosomer) ble colocalized innen 6 timer etter GNA behandling. Men dette colocalization ble avbrutt etter 12 og 24 timer etter GNA behandling; de små, intenst farget GPF-LC3 prikker syntes å samle og ble store, intenst farget regioner, som foreslo at fusjon mellom autophagosomes og lysosomer ble blokkert. Tidligere studier har vist at noen medikamenter, for eksempel CQ og bafilomycin A1, kan heve pH i lysosomene til å inhibere fusjon med autophagosomes. Vi spurte om GNA har liknende effekter. Vi vurderte effekten av GNA på lysosome forsuring ved farging med LysoSensor Grønn DND-189, en acidotropic fluorescerende probe som kan være fanget i sure organeller. Bafilomycin A1 ble anvendt som en positiv kontroll. Som vist i figur 4D, ble lysosomet merking avbrutt innen 12 timer etter behandling, og GNA var mye mer åpenbart påvirket ved 24 og 36 timer (tilsvarende virkningene av bafilomycin A1), noe som indikerer inhibering av lysosomet forsuring. Denne observasjonen kan forklare GNA-mediert hemming av fusjonen mellom autophagosomes og lysosomer. Derfor, selv om GNA utløser dannelsen av autophagosomes, Gna også blokkerer progresjon av autophagic prosessen ved å undertrykke fusjon mellom autophagosomes og lysosomer, og dermed hemme nedbrytningen av innholdet.
5. Knockdown av Beclin en reduserer GNA-indusert kreft celledød
De tidligere data indikerer at GNA kan indusere celledød ved apoptose. For å avgjøre om celledød forårsaket av GNA korrelerer med dysfunksjonelle autofagi, vi videre ansatt små forstyrrelser RNA (siRNA) for å slå ned uttrykket av Beclin en, en viktig genet for autofagi. Transfeksjon av RNA oligonukleotider mot Beclin1 (Beclin en siRNA) på A549-celler med hell trykkes proteinnivået av endogen Beclin 1 sammenlignet med celler transfektert med kontroll siRNA, noe som indikerer at Beclin en siRNA er effektiv (figur 5A). Etter 24 eller 36 timer behandling med 3 uM GNA, Beclin en knockdown-celler viste betydelig mindre celledød sammenlignet med kontrollceller (figur 5B), noe som tyder på at GNA-indusert celledød er beslektet med dysfunksjonell autofagi.
, RNA oligonukleotider mot Beclin 1 (Beclin en siRNA) effektivt undertrykke Beclin 1 uttrykk. A549-celler ble transfektert med sirnas mot Beclin en eller negativ kontroll, og proteinnivået av Beclin1 ble analysert ved western blotting. GAPDH protein ble anvendt som kontroll lasting. Baren Grafen viser bandet intensiteter av Beclin1 i forhold til de av GAPDH. Gjennomsnitt ± SEM, n = 3, ** p 0,01, enveis ANOVA. B, A549-celler ble transfektert med sirnas mot Beclin en eller negativ kontroll. Cellene ble deretter behandlet med 3 uM GNA for de angitte tidsperioder, farget med 2 uM Hoechst 33342 og observert under et fluorescerende mikroskop; prosentandelen av døde celler ble kvantifisert ved Trypan blå farging. Gjennomsnitt ± SEM, n = 3, * betyr p 0,05, ** p 0,01, enveis ANOVA
6.. GNA induserer endringer i nivåene av apoptose relaterte proteiner
Deretter undersøkte vi veien der dysfunksjonell autofagi indusert celledød skjer ved GNA behandling. Økende bevis har indikert at krysstale mellom autofagi og apoptose er spesielt komplisert av det faktum at disse prosessene har mange felles regulatoriske molekyler, slik som p53 og BCL-2 familiemedlemmer [29] – [30]. GNA forårsaket en økning i proteinnivåer Bax og spaltet caspase-3, og en reduksjon i nivåene av Bcl-2 og LC3-II over tid, noe som tyder på at GNA behandling aktiverer Bax. Fordi Bax er en av de mest fremtredende nedstrøms mål for p53, vurderte vi effekten av GNA på p53. Som vist i figur 6A, GNA førte til en bemerkelsesverdig økning i nivået av p53. Fordi p38 MAPK bidrar til aktivering av p53, vi overvåket også nivåene av p38. GNA førte til en bemerkelsesverdig økning i nivået av fosforylert p38 (figur 6A). Videre flow cytometri analyse ved hjelp av annexin V /propidiumjodidfarging indikerte at GNA behandling tydelig øket fraksjon av døde celler og sene apoptotiske celler sammenlignet med NC. De konkluderer dermed med at GNA kan indusere apoptose i A549-celler i det minste delvis gjennom denne reaksjonsveien.
A, A549-celler ble transfektert med sirnas mot Beclin en eller negativ kontroll. Cellene ble deretter behandlet med 3 uM GNA for de angitte tidsperioder. Den relative Proteininnholdet ble analysert ved western blotting. GAPDH protein ble anvendt som kontroll lasting. Baren Grafen viser bandet intensiteter av angitte protein i forhold til de av GAPDH. Gjennomsnitt ± SEM, n = 3, * betyr p 0,05, ** p 0,01, enveis ANOVA. B, A549-celler ble transfektert med sirnas mot Beclin en eller negativ kontroll. Cellene ble deretter behandlet med 3 uM GNA for de angitte tidsperioder, og cellene ble farget med annexin V /propidiumjodid og underkastet strømningscytometri-analyse. Prosentandelen i øvre venstre kvadrant viser andelen av celler merket med propidiumjodid (døde celler), mens andelen i øvre høyre kvadrant indikerer populasjon av celler merket med både annexin V og propidiumjodid (sene apoptotiske og døde celler).
7. GNA hemmer autofagi in vivo
GNA har vist effekt ved svulster vokser i nakne mus. Vårt laboratorium har tidligere vist at de relative tumorvolumer (RTV) i mus behandlet med 16 og 32 mg /kg GNA var 12,16 ± 7,39 og 7,65 ± 2,84, henholdsvis, mens den RTV i vehikkelbehandlede negative kontroller var 26,36 ± 14,10; de relative tumorvekst-forhold (T /C,%) var 46,1% og 29,0%. For å bestemme den mekanismen som GNA svekker tumorvekst
in vivo
, vi etablert en xenograft mus lunge svulst modell. Som vist i figur 7, GNA induserte akkumulering av autophagic vesikler (figur 7A), økte nivåene av LC3-II (figur 7B), og blokkert p62 degradering (figur 7B) i tumorer. Disse resultatene tyder sterkt på at den mekanismen som GNA fungerer
in vivo
også autofagi-relatert.
A549 celler ble injisert subkutant (2 × 10
6 /mus) i 30-40 dager gamle BALB /CA mannlige nakne mus. Etter etablerte tumorer var dannet (~ 50 mm
3), mus var i.v. injisert med eller uten 16 mg /kg Gna to ganger i uken i tre uker. Ved 24 timer etter den siste i.v.
