Abstract
Prognosen for ovarialcancer er dårlig delvis på grunn av den høye frekvensen av chemoresistance. Nye bevis peker til Toll-like receptor-4 (TLR4), og spesielt dens adapter protein MyD88, som en potensiell formidler av denne motstanden. Denne studien tar sikte på å tilveiebringe ytterligere bevis på at MyD88 positive cancerceller er av klinisk betydning, stem-lignende og reproduserbart påvises i forbindelse med prognostisk lagdeling. Uttrykk for TLR4 og MyD88 ble vurdert immunohistochemically i 198 parafininnstøpte eggstokkreft vev og i en embryonal karsinom modell av kreft stemness. Parallelt ble uttrykk for TLR4 og MyD88 mRNA og regulatoriske microRNAs (MIR-21 og MIR-146a) vurdert, samt i en rekke kjemosensitiv og resistente kreftcellelinjer. Funksjonell analyse av veien ble vurdert i kjemoresistent Skov-3 eggstokkreft celler. TLR4 og MyD88 uttrykket kan reproduserbart vurderes via immunhistokjemi hjelp av en semi-kvantitativ scoring system. TLR4 ekspresjon var til stede i alle ovarie epitel (normalt og neoplastisk), mens MyD88 var begrenset til neoplastiske celler, uavhengig av tumor karakter og forbundet med redusert progresjon-fri og total overlevelse, i en immunhistokjemi spesifikk undergruppe av serøse karsinomer, p 0,05. MiR-21 og MIR-146a uttrykk øker betydelig hos MyD88 negative kreft (p 0,05), noe som indikerer deres deltakelse i forskrift. Det ble ikke observert signifikante endringer i MyD88 mRNA uttrykk mellom kjemosensitiv og kjemoresistent celler og vev. Knockdown av TLR4 i Skov-3 eggstokkreft celler utvunnet kjemosensitivitet. Knockdown av MyD88 alene ikke. MyD88 uttrykk ble nedregulert i differensierte embryonal karsinom (NTera2) celler, støtter MyD88 + kreftstamcelle hypotese. Våre funn viser at uttrykk for MyD88 er forbundet med betydelig redusert pasientoverlevelse og endret mikroRNA nivåer og foreslå en intakt /fungerende TLR4 /MyD88 pathway er nødvendig for kjøp av kjemoresistent fenotype. E
x vivo
manipulering av eggstokkreft stamcelle (CSC) differensiering kan redusere MyD88 uttrykk, og gir en potensielt verdifull CSC modell for eggstokkreft
Citation. D’Adhemar CJ, Spillane CD, Gallagher MF, Bates M, Costello KM, Barry-O’Crowley J et al. (2014) The MyD88 + Phenotype viser en negativ prognostisk faktor i ovarialcancer. PLoS ONE 9 (6): e100816. doi: 10,1371 /journal.pone.0100816
Redaktør: Chiara Romualdi, Universitetet i Padova, Italia
mottatt: 27 januar 2014; Godkjent: 30 mai 2014; Publisert: 30 juni 2014
Copyright: © 2014 d’Adhemar et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av Cancer Research Irland (tilskudd referansenummeret ICS CRP09OLE), Meath fundament, The Royal City of Dublin HF, BDI-2 (10 /CE /B1821), den Emer Casey foundation, den irske Cancer Society, og Marie Curie EU gi. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Eggstokkreft er en av de mest vanlige og dødelige kreftformer hos kvinner [1], [2], med forekomst og dødelighet forventes å øke i vestlige land [3]. Epitelial eggstokkreft (EOCs) utgjør det store flertallet av voksne eggstokkene maligniteter, som er mest vanlig serøs karsinom [4], [5]. Som eggstokkreft er ofte asymptomatisk i en tidlig fase eller presenterer med vage symptomer som etterligner ekstra ovariesyndrom; de fleste pasienter (70-75%) til stede med utbredt sykdom ved diagnose med en resulterende høy dødelighet [6]. Nåværende behandlingstilbud omfatter kirurgi og platina og /eller taxan-basert kjemoterapi [7]. Selv om EOC vanligvis reagerer svært godt til standard kjemoterapi, med innledende 70-80% responsrate, er dette ofte etterfulgt av tilbakefall som ofte kjemoresistent [8], [9]. Forutsi og overvinne denne chemoresistance fortsatt en viktig utfordring i behandling, men det er for øyeblikket ingen ledige biomarkører (serum eller vev) som virkelig er intelligent atferd eller chemoresponsiveness.
Toll-lignende reseptorer (TLRs) funksjon som essensielle komponenter av det medfødte immunsystemet. De er membranbundne reseptorer som gjenkjenner komponenter av eksogene patogener, slik som bakteriell lipopolysakkarid (LPS) og viral RNA, som fører til en inflammatorisk respons. TLR’ene kan også aktiveres ved endogene ligander inkludert cellerester avledet fra cancer progresjon [10] – [13]. De fleste TLR’ene signal via den myeloid differensiering primærrespons-genet 88 (MyD88) og er uttrykt i både lymfoide og ikke-lymfoide vev (hovedsakelig i tidligere), med økende bevis for at de spiller viktige roller i kreft patogenesen [14], [15] . Nettoeffekten av TLR signalisering (+/- MyD88) er transkripsjonsfaktor aktivering, inkludert kjernefysiske faktor-kB (NF-kB). NF-kB er en universelt uttrykt transkripsjonsfaktor som er særlig viktig både som en del av normal inflammatorisk respons og i tumorgenesen, som regulerer ekspresjonen av forskjellige inflammatoriske, apoptotiske og onkogene gener [16]. Til syvende og sist NF-kB-aktivering fører til økt produksjon av cytokiner, kjemokiner og vekstfaktorer. Aktiviteten av denne reaksjonsvei er normalt holdes i sjakk, under normal immunrespons, dels ved mikroRNA regulering av TLR4 signalering, og eksempler på slike innbefatter mikroRNA 21 (MIR-21) og MIR-146a [17], [18], [ ,,,0],19].
TLR4 /MyD88 veien har de siste årene blitt foreslått som en risikofaktor for kreftutvikling og chemoresistance i eggstokkreft [20], [21]. Mens det har blitt observert at TLR4 uttrykk er allestedsnærværende i celler EOC, har en undergruppe differensielt uttrykte MyD88 vist økte cytokin /chemokine produksjon og cellulær proliferasjon ved aktivering av TLR4 [20]. Chen et al. [21] har brukt denne differensial uttrykk for å dele EOC inn MyD88 positive og MyD88 negative. MyD88 positive EOCs ha et fungerende TLR4 /MyD88 bane og kan representere en ovarial cancer stamcelle (CSC), som er svært motstandsdyktig mot pro-apoptotiske signalering, og som kan rekruttere leukocytter til aktivt å fremme en pro-inflammatoriske pro-proliferativ mikro [22] . MyD88 negative EOCs i kontrast mangler MyD88 og kan representere mer differensierte svulster som er mindre biologisk aggressive [20], [23]. Alvero et al. [12] har vist at cscs avledet fra eggstokk-tumorprøver har en unik CD44 + /MyD88 + fenotype, noe som lettes motstand mot både tumor nekrose faktor (TNF) indusert apoptose og kjemoterapi. Mer nylig MyD88 protein uttrykk viste seg å være en betydelig dårlig prognostisk faktor i EOC [24].
Differensial klassifisering av MyD88 positive og negative EOC har implikasjoner for nåværende terapeutiske strategier. Selv om cisplatin-resistens oppstår i et mindretall av kvinner under sin første behandling (30%), den senere utvikler seg i alle kvinner som får behandling for tilbakevendende sykdom [9], og er mest sannsynlig på grunn av motstand mot apoptotisk signalering i MyD88 positive celler [12 ], [25], [26]. I tillegg er paclitaxel (et taxan-basert middel) er en TLR4 ligand og kan aktivere TLR4 /MyD88 banen i MyD88-positive celler, faktisk å indusere deres proliferasjon [20], [27]. Slike MyD88 kompetente kreftceller er teoretisk i stand til å utnytte eksisterende kjemoterapeutiske strategier, ved ikke bare å motstå de cytotoksiske virkninger, men også ved hjelp av paclitaxel-ligering for å lette deres vekst, og som i det omkringliggende stroma via økt NF-kB produksjon. Derfor aktuelle bevis tyder på at paclitaxel kan faktisk være uheldig for pasienter med tumorer inneholde MyD88 positive EOC-celler, til tross for beholder sine cytotoksiske effekter i MyD88-negative celler [20], [27]. Det er også mulig at tilbakevendende sykdom kan representere en pool av mer aggressive kreftceller (cscs), som har effektivt blitt «valgt ut» av paclitaxel behandling.
Vi hypoteser som MyD88 + kreftceller representerer en undergruppe av celler i EOC som konferere mer aggressiv biologisk atferd og chemoresistance. Hittil relativt lite antall eggstokkreft prøver, eller isolerte kreftcellelinjer, er kontrollert med hensyn til TLR4 /MyD88 uttrykk [20], [23], [27], [28]. Målet med denne studien var å grundig karakterisere distribusjon og kliniske betydningen av TLR4 og MyD88 uttrykk i en kohort av eggstokkene svulster, som omfatter alle vanlige histologiske subtyper og representerer den største slik serie studert hittil [20], [23], [ ,,,0],24], [27], [28]. Uttrykket av to microRNAs kjent for å regulere TLR4 /MyD88 sti ble også undersøkt i en undergruppe av maligne tumorprøver for å utforske sin rolle som epigenetiske modulatorer av denne veien. Knockdown av TLR4 /MyD88 ble vurdert å dissekere den funksjonelle rollen til disse genene. Parallelt med ovennevnte forsøkene ble TLR4 /MyD88 uttrykk vurderes i udifferensierte og differensierte embryonal karsinom celler for å gi ytterligere bevis for kreftstamcelle hypotese i eggstokkreft.
Resultater
TLR4 og MyD88 uttrykk i test Series
den primære test serie av ondartede ovarietumorer omfattet 20 pasienter med serøse adenokarsinomer som ble matchet for Karakter (høyverdig) og scene (FIGO III), og som hadde fått platinum-basert adjuvant kjemoterapi. TLR4 uttrykk var universelt stede og scoret som positive (immunoscore 4) i alle svulster (20/20). I motsetning til dette ble positiv farging for MyD88 observert i kun 12/20 tilfeller, og resten (8/20), ble klassifisert som MyD88 negativ. Klinisk oppfølging data var tilgjengelig for alle pasienter, hvorav 12 hadde dødd på tidspunktet for denne studien, og retrospektiv analyse ble utført for å bestemme hvorvidt MyD88-ekspresjon ble forbundet med pasientens overlevelse. Progresjonsfri overlevelse (PFS) og total overlevelse (OS) ble vurdert. Figur 1 viser at MyD88 uttrykket var forbundet med betydelig kortere PFS og OS (p 0,05). Median tid til tilbakefall (fra tidspunktet for kirurgi) hos pasienter med MyD88 positive svulster var 16 måneder, mens MyD88 negative svulster dukket ved en median tid på 42 måneder (p = 0,018). MyD88 positive svulster ble også assosiert med en betydelig kortere OS. Median OS for pasienter med MyD88 positive svulster var 43 måneder, sammenlignet med 108 måneder for MyD88 negative tumorer (p = 0,008).
MyD88 positive tumorer (n = 12) hadde betydelig redusert progresjonsfri overlevelse ( A) og total overlevelse (B) (p = 0,018 og p = 0,008, henholdsvis).
TLR4 og MyD88 under Validering Series
uttrykk for TLR4 og MyD88 ble deretter vurdert i 178 pasientprøver for å validere test serien funn og å undersøke uttrykk i ikke-ondartet eggstokkvev og ulike histologiske undergrupper av EOC. Disse prøvene tatt normale eggstokker (n = 50), godartede cyster (n = 15), borderline tumorer (n = 28) og ondartede svulster (n = 85). Gjennomsnittlig pasientens alder på tidspunktet for operasjonen var 51 år for borderline tumorer (range, 20-81) og 59 år for alle ondartede svulster (spredning, 23-94). Flertallet av ondartede svulster var høy klasse, med 62% tildelt karakteren 3 (hovedsakelig serøs karsinomer), og høy scene (51,3% FIGO stadium IIIC, 8,1% stadium IV). Alle svulster som ble iscenesatt IIB og høyere var serøs karsinomer. Den immunfenotypen av hver vevstype er oppsummert i tabell 1.
uttrykk for både TLR4 og MyD88 var mest enhetlige og sterkest i serøs svulster, særlig borderline og ondartede serøs svulster. Eksempler på TLR4 og MyD88 IHC ekspresjon er vist i figurene 2 3. Normal eggstokkene overflaten epitel (nese) viste variabel uttrykk for TLR4 (7/50), men var jevnt negativ for MyD88 (0/50). Omtrent halvparten av godartede cyster var TLR4 positive (7/15, blandet undergrupper), men bare et mindretall var MyD88 positive (3/15, alle serøs). Flertallet av border serøse svulster var både TLR4 og MyD88 positive (12/15), med sterk farging observert i 7/12. I motsetning alle grense mucinkjertler svulster var MyD88 negative. Mens 73% (62/85) av ondartede svulster var TLR4 positive (blandet subtyper), ble co-uttrykk for MyD88 observert i bare 47% tilfeller, som var alt serøs karsinomer. Alle ikke-serøs karsinom (mucinous, klare celle og endometrioid) var MyD88 negative. Denne informasjonen genereres 40 MyD88 positive og 45 MyD88 negative kreft. MyD88 uttrykk ble observert i begge poorly- og godt differensierte kreftceller, og var sterke i nærheten områder av nekrose. Som vist i tabell 2 var det ingen sammenheng mellom pasientens alder eller samlet karakter for differensiering og TLR4 eller MyD88 uttrykk. Samlet ble det TLR4 + /MyD88- fenotype knyttet til alle typer vev, inkludert ikke-dysplastisk epitel, mens TLR4 + /MyD88 + (co-uttrykk) ble forbundet bare med eggstokkene svulster
A:. Focal svak farging i normal eggstokk overflaten epitel (40x); B: diffuse moderat farging i en godartet serøs cystadenoma (20x); C: diffuse sterk farging i et grense serøs tumor (10x); D:. Diffus sterk farging i en (klasse 2) serøs karsinom (40x)
En negativ godartet mucinous cystadenoma, med positive stromal betennelsesceller (20x). B, positive border serøs tumor (20x). C, positiv lavgradig serøs karsinom (40x). D, positiv høyverdig serøs karsinom (40x). E, negativ endometrioid karsinom (20x). F, positiv serøs karsinom (lang pil) med komponent av negativ klar cellekreft (kort pil) (40x).
Retrospektiv analyse ble utført for å bestemme hvorvidt TLR4 /MyD88 uttrykk påvirket pasientens overlevelse dette større serie. Klinisk oppfølging data var tilgjengelig for 39 pasienter med maligne svulster, 33 av dem hadde dødd på tidspunktet for denne studien. Tilfeller ekskludert fra oppfølging inkludert ikke-serøs karsinom (alle MyD88 negativ), de med tilbakevendende sykdom (n = 2), pasienter som døde av postoperative komplikasjoner eller urelaterte årsaker (n = 2) og pasienter tapt for oppfølging (videre behandling og oppfølging på en annen institusjon). Utvalgte saker ble klassifisert i 2 grupper basert på MyD88 protein uttrykk: Gruppe 0 (MyD88 negativ); Gruppe 1 (MyD88 positive). Alle tilfellene var klasse og scene-matchet (grad 3, FIGO III /IV), ble optimalt debulked og pasientene hadde fått adjuvant platina-basert kjemoterapi med (n = 28) eller uten (n = 11) paclitaxel. Som illustrert på figurene 4 5, TLR4 og MyD88 uttrykk ble begge assosiert med betydelig forkortet progresjonsfri overlevelse (PFS), og MyD88 uttrykk var assosiert med redusert total overlevelse (p 0,05). Median tid til tilbakefall for pasienter med svulster som uttrykte TLR4 var 12 måneder (n = 20), mens TLR4 negative svulster gikk igjen i en median tid på 27 måneder (n = 19); p = 0,016. Tilsvarende median tid til tilbakefall for MyD88 positive svulster var 13 måneder (n = 21), sammenlignet med 31 måneder hvis MyD88 negative (n = 18); p = 0,02. Forskjellen i OS mellom TLR4 positiv (n = 19) og TLR4 negative tumorer (n = 14) var ikke statistisk signifikant (p = 0,312). Median OS tid for pasienter med MyD88 positiv EOC var 28 måneder (n = 21), mens pasienter med MyD88 negative tumorer (n = 12) hadde signifikant lengre total overlevelse (47 måneder, p = 0,029). MyD88 positive maligniteter derfor ble assosiert med redusert pasient overlevelse og sykdomsfrie intervaller
TLR4 (A) eller MyD88 (B) negative saker, hadde signifikant bedre PFS (15 18 måneder lengre; p 0,05)..
Survival var lenger i MyD88 (B) negative saker (av 19 måneder, p 0,05). Forskjellen i overlevelse assosiert med TLR4 (A) er ikke signifikant (p 0,5).
mikroRNA uttrykk på Test Series
EOC prøver fra den første testserien ble delt inn i to grupper basert på tidligere immunhistokjemiske resultater (MyD88 positive, n = 11; MyD88 negative, n = 9). Som vist i figur 6, ble den gjennomsnittlige uttrykk for MIR-21 og MIR-146a i MyD88 negative kreft økt i forhold til gjennomsnittet av MyD88 positive gruppen (p 0,001).
Spredningsplott som viser relative mikroRNA uttrykk med standardavvik (fold endringer beregnes via to
-ΔΔCt metoden). 20 EOC tilfeller (serøs karsinomer) gruppert som MyD88 + eller MyD88- basert på protein uttrykk; data vist i forhold til hver gruppe. Gjennomsnittlig uttrykk for MIR-21 MIR-146a økt i MyD88 negativ EOC (p 0,05).
Gene og mikroRNA Expression under Validering Series
Valgte ondartet pasienttumorprøver ble delt inn i to grupper basert på tidligere resultater IHC (MyD88 positiv, n = 10; MyD88 negative, n = 12). Uttrykk av MIR-21 og MIR-146a ble analysert parallelt med TLR4 og MyD88 genekspresjonsanalyse. Figur 7 viser at, i likhet med forsøksserie, ble ekspresjonen av begge microRNAs signifikant økt i MyD88 negative kreftformer i forhold til den MyD88 positive gruppe (MIR-21, p = 0,0046; MIR-146a, p = 0,0191), med mer biologisk heterogenitet observert med MIR-146a nivåer. De tilhørende nivåer av TLR4 MyD88 mRNA var statistisk uforandret mellom de MyD88 positive og negative kreftformer (p = 0.8777 og 0.1348, henholdsvis). Derfor MIR-21 og MIR-146a synes å være omvendt knyttet til MyD88 i eggstokkreft. Fraværet av MyD88 mRNA endring i MyD88 negative Gruppen foreslår at både MIR-21 og MIR-146a er målgruppe MyD88 på post-transkripsjonsnivået.
Spredningsplott som viser relative gen og mikroRNA uttrykk med standardavvik (fold endringer kalkulert via to
-ΔΔCt metoden). 22 EOC tilfeller (serøs karsinomer) gruppert som MyD88 + eller MyD88- basert på protein uttrykk; data vist i forhold til hver gruppe. A B, TLR4 MyD88 mRNA statistisk uendret mellom MyD88 positiv MyD88 negative gruppene (p 0,05); C D, nivåer av både Mir-21 MIR-146a oppregulert i MyD88 negativ EOC (p 0,05).
TLR4 og MyD88 uttrykk i en kohort av respondere og non-respondere
MyD88 mRNA ble oppregulert 4,9 ganger i en kohort av ikke-respondere i forhold til respondere (p 0,05). Tilsvarende ble TLR4 mRNA oppregulert 3,4 ganger i denne kohorten (p 0,05). Alle pasienter analysert her hadde avansert serøs papillær adenokarsinomer og fikk carboplatin og paclitaxel som første linje kjemoterapi etter optimal debulking kirurgi.
Gene og miRNA uttrykket i cellelinjer
Det ble observert betydelige endringer i TLR4 mRNA uttrykk mellom kjemosensitiv og kjemoresistent celler, selv om graden av endring var variabel (figur 8A). A2780cis celler viste en 24,1 ganger økning i TLR4 forhold til A2780. I motsetning var det en 18,8 ganger reduksjon i TLR4 i kjemoresistent IGROV-1CDDP celler i forhold til IGROV-en. KB-8-5-11 celler viste den minste endring fra sine foreldre tråd med kun en 1,6 ganger økning i TLR4.
Data er uttrykt som ganger endring i uttrykk med hensyn til A2780 kreftceller (med standardavvik) .
Økt MyD88 mRNA ekspresjon ble observert i alle kjemoresistent kreftcellelinjer; disse endringene var små, men statistisk signifikant (figur 8B). Det var en 2,6 ganger økning i MyD88 i A2780cis celler sammenlignet med MyD88-negative A2780 celler. IGROV-1CDDP celler viste en 1,6 ganger økning i MyD88 forhold til kjemosensitiv IGROV-1 celler. I likhet med dataene TLR4, endringen i MyD88-ekspresjon i KB-8-5-11 celler fra den kjemosensitiv KB-3-1 ordnede linje var den minste med bare en 1,4 ganger økning i MyD88.
Variable endringer i nivåene av MIR-21 ble observert mellom kjemosensitiv og kjemoresistent celler (figur 9A). A2780cis celler viste en 1,5 gangers reduksjon i MIR-21 sammenlignet med A2780, men denne endringen var ikke statistisk signifikant (p = 0,5958). En to gangers økning i MIR-21 ble påvist i de kjemoresistent IGROV-1CDDP celler i forhold til IGROV-1. KB-8-5-11 celler viste en 2,9 ganger reduksjon i MIR-21 i forhold til sine foreldre (kjemosensitiv) linje.
Data er uttrykt som ganger endring i uttrykk med hensyn til A2780 kreftceller (med standardavvik ).
i likhet med MIR-21, endringer i MIR-146a nivåer mellom kjemosensitiv og kjemoresistent kreftceller var variabel (figur 9B). Det var en 6,5 ganger økning i MIR-146a i A2780cis celler sammenlignet med MyD88-negative A2780 celler. IGROV-1CDDP celler viste en 1,2 gangers økning i MyD88 forhold til kjemosensitiv IGROV-1-celler, men denne endringen var ikke statistisk signifikant (p = 0,4557). En 2,5 ganger reduksjon i MIR-146a ble påvist i KB-8-5-11 celler i forhold til sin kjemosensitiv (KB-3-1) foreldre linje.
Redusert TLR4 uttrykk fører til økt kjemosensitivitet av eggstokkreft celler
for å funksjonelt vurdere rollen til den TLR4 /MyD88 sti på kjemosensitivitet av eggstokkreft celler den kjemoresistent eggstokkreft cellelinje Skov-3 ble transfektert med siRNA spesielt rettet mot MyD88 eller TLR4. Etter 72 timer MyD88 var signifikant redusert ved både mRNA (figur 10A) og protein (figur 10B) nivå i cellene transfektert med siMyD88. Imidlertid er tap av MyD88 uttrykk hadde ingen effekt på den kjemosensitivitet av cellene (figur 10C). Betydelige reduksjoner i ekspresjonen av TLR4 på mRNA (figur 10A) og protein (figur 10B) nivået ble også observert i celler 72 timer etter transfeksjon. Imidlertid er redusert nivå av TLR4 ekspresjon ble signifikant påvirket responsen til den SKOV-3 mot paclitaxel (Figur 10C). Det var en 27,1% reduksjon i celleviabilitet i siTLR4 transfekterte paclitaxel-behandlede celler sammenlignet med ikke-transfekterte paclitaxel-behandlede celler og en 19,6% reduksjon i forhold til siNeg transfekterte celler. Dermed stanse av TLR4 generert en mer kjemosensitiv fenotype i Skov-3 eggstokkreft celler.
Skov-3 celler ble forlatt utransfekterte (Unt), tilført med negativ kontroll siRNA (siNeg), MyD88 målretting siRNA ( siMyD88) eller TLR4 målretting siRNA (siTLR4). De transfekterte celler ble inkubert i 72 timer før høsting enten for mRNA-analyse (A), for proteinanalyse (B) eller behandling med paklitaxel (C). (A) MyD88 og TLR4 mRNA-ekspresjonsnivåene ble evaluert ved TaqMan RT-PCR. MyD88 og TLR4 mRNA-ekspresjon ble normalisert til den av et endogent kontroll, B2M, og kalibrert med den i ubehandlede celler for å etablere den relative prosentandelen av mRNA-ekspresjon (n = 3, middel ± SD). (B) MyD88 og TLR4 mRNA-ekspresjonsnivåene ble undersøkt ved western blot-analyse. GAPDH ble anvendt som en kontroll lasting. (C) Transfekterte celler var enten ubehandlet, behandlet med DMSO (bærerkontroll) eller 3,5 nM av paclitaxel (IC25). 48 timer etter behandling, cellelevedyktigheten ble bedømt ved hjelp av CCK-8-analyse. % Cellenes levedyktighet ble beregnet ved sammenligning av absorbans-verdier for bærerkontrollen til de tilsvarende paclitaxel-behandlede prøver. Resultatene er uttrykt som middelverdi + SA, n = 3; * P 0,05, ** p 0,01 (un-paret t-test)
embryo carcinoma celler viser redusert MyD88 uttrykket etter differensiering
data fra en stor skala. microarray eksperiment (M Gallagher, upublisert data) involverer embryonale karsinom kreftstamceller (NTera2 og 2102Ep) ble avhørt for differensiell TLR4-signale genekspresjon, som indikerte at MyD88 uttrykk var høy i udifferensierte NTera2 celler falt raskt på differensiering i retinsyre ( RA). For å validere microarray data, udifferensiert og differensiert NTera2 og 2102Ep prøvene ble vurdert for MyD88 gen og protein uttrykk. Som TLR4 ble hypoteser å regulere MyD88 i disse cellene, ble uttrykket av TLR4 også vurdert tross konstituerende uttrykk i rekken studier. Nedregulering av MyD88 på differensiering av pluripotent NTera2 celler ble bekreftet over flere tids kurs (Figur 11A). TLR4 ble konstitutivt uttrykt, validering array-data. I motsetning til ekspresjonen av TLR4 og MyD88 var uforandret i nullipotent 2102Ep celler behandlet med RA (figur 11A). Disse endringene ble avspeilet på proteinnivå (figur 11B, C). MyD88 protein uttrykk ble betydelig redusert etter differensiering av NTera2 celler (MyD88-), mens ingen signifikant endring ble observert i TLR4 farging (figur 11B). I kontrast 2102Ep celler, både udifferensierte og behandlet med retinsyre, var TLR4 +, MyD88 + (figur 11C). I forhold til forbundet mikroRNA endringer, har vår gruppe tidligere vist at mens MIR-21 er uendret i begge cellelinje i respons til RA, er MIR-146a oppregulert ved differensiering av NTera2 celler, men uendret i 2102Ep celler [29]. Dette tyder på at, i likhet med EOC er MIR-146a omvendt knyttet til MyD88 i differensierte embryonale karsinom kreftstamceller
A, qPCR data. MyD88 uttrykk er nedregulert på NTera2 differensiering, med minimale endringer i TLR4 ; i motsetning 2102Ep celler unngå differensiering og opprettholde både TLR4 MyD88 uttrykk (fold endringer vist er proporsjonal med internkontroll genet GAPDH og beregnet via to
-ΔΔCt metoden). B, TLR4 og MyD88 protein uttrykk i NTera2 celler: TLR4 farging var uendret etter differensiering (venstre panel); MyD88 flekker i udifferensierte NTera2 celler viste signifikant redusert flekker etter (høyre panel) differensiering (alle 40x). C, TLR4 og MyD88 uttrykk i 2102Ep celler: Det ble observert minimale endringer i TLR4 (venstre panel) eller MyD88 (høyre panel) etter RA-behandling (alle på 40x)
Diskusjon
karakter~~POS=TRUNC her av TLR4 og MyD88-ekspresjon i epitelovarialcancer neoplasi har vist at mens TLR4 uttrykk for en viss grad er allestedsnærværende i alle typer av ovarial epitel, inkludert ikke-dysplastisk epitel, er MyD88 bare uttrykt i neoplastisk vev. En slik begrensning av MyD88 til neoplastisk ovarievev bekrefter lignende funn nylig rapportert i litteraturen [24]. Men i denne studien, TLR4 /MyD88 co-uttrykk viste en forkjærlighet for serøs svulster generelt, særlig borderline og ondartede serøs svulster, og ble uttrykt i både høy og lav grad av serøs karsinomer. I motsetning til dette TLR4 i fravær av MyD88 var assosiert med ikke-ondartet vev, ikke-serøse og benigne tumorer borderline, en undergruppe av serøse karsinomer og ikke-serøse karsinomer (MyD88 negativ EOC). Som TLR4 ekspresjon var til stede i alle typer av ovarial epitel, synes det som TLR4 signalering er koblet til enten ondartede serøse tumorer eller ikke-serøse tumorer proporsjonale til å være MyD88-avhengige eller-uavhengig.
Chen et al. [21] opprinnelig hevdet at forholdet mellom MyD88 positive og negative EOC celler kan bestemme tumor egenskaper i form av progresjon, chemoresistance og gjentakelse. Dette er helt i tråd med våre resultater viser fordelingen av MyD88 uttrykk i eggstokkene neoplasi og foreninger med pasienten survivial. MyD88 positive kreft analysert i denne studien dukket 18 måneder tidligere enn MyD88 negative kreft, med en tilsvarende reduksjon i total overlevelse på 19 måneder (p 0,05). Resultatene av denne analysen er i nøyaktig samsvar med de siste rapportene indikerer reduksjon i sykdomsfrie intervaller og pasient overlevelse med MyD88 positive kreft, som strekker seg fra 11-35 måneders reduksjoner i progresjonsfri overlevelse [20], [24], [27] [28] og 26-36 måneders reduksjon i total overlevelse [24], [27]. Den svært store forskjeller i overlevelse som ble observert i testserien i forhold til MyD88 uttrykk er trolig på grunn av den lille størrelsen på utvalget i denne kohorten, som det er markert uharmoniske med alle tidligere studier og validering serien undersøkt her.
Videre endringene observert i MyD88-ekspresjon i embryonalt karsinom (EC) kreft stamceller, en av de best karakteriserte CSC-modeller i bruk i dag [30] – [32], tyder også på at MyD88 positive cancercellene er mer biologisk aggressiv enn MyD88 negativ celler. Udifferensierte stamcelleliknende populasjoner fra malignitet er ofte tilstrekkelig til effektivt å regenerere svulster. NTera2 EC cellene differensieres
in vivo
å danne teratocarcinomas, tre bakterie lag svulster som kan oppstå i eggstokkene [33]. NTera2 celler er svært tumorigen i udifferensiert tilstand, en eiendom som er sterkt redusert eller eliminert ved differensiering [32], [33]. I kontrast, kan 2102Ep EC-celler unngå differensiering
in vivo
å generere svært aggressive rene embryonalt karsinom [31]. Vi har vist at mens TLR4 er konstitutivt uttrykt i EC-celler, er tap av MyD88 uttrykk i forbindelse med en «bryter differensiering «: overgang fra NTera2 EC-celler fra deres høyt-tumorer (udifferensiert) til mindre-tumorer (differensiert) tilstander. Denne endringen i uttrykket på differensiering er subtil, men svært reproduserbare, og viser at
ex vivo
manipulering av eggstokkene CSC differensiering kan redusere MyD88 uttrykk. Vi tror at den støtter den hypotese at EOC MyD88-positive celler kan være stamme lignende på grunn av deres MyD88 uttrykksmønster [12], [21] og også viser en praktisk og lett manipuleres kreft stilk modell som har relevans til eggstokkreft.
det har nylig blitt rapportert at Mir-21 regulerer TLR4 ved å målrette den tumor suppressor protein PDCD4 [19], mens MIR-146a er NF-kB-avhengige [34] og mål og reduserer uttrykk for IRAK-1, IRAK -2 og Traf-6, som er nøkkel MyD88 sti komponenter [18], [35]. Til syvende og sist MIR-21 og MIR-146a delta gjensidig i reguleringen av TLR4 /MyD88 uttrykk, fungerer som negative regulatorer av MyD88 avhengige TLR4 signalering. Romanen analyse av MIR-21 og MIR-146a uttrykk i denne studien, basert på kategorisering av EOC inn MyD88 positive og MyD88 negativ, viser at uttrykk for både MyD88 og disse microRNAs er knyttet til eggstokkreft. Det ble observert små men viktige endringer i MyD88 mRNA uttrykk mellom kjemosensitiv og kjemoresistent eggstokkreft og livmorhalskreftceller.
