Abstract
Hook microtubule-tethering protein 3 (HOOK3) er en adapter protein for microtubule avhengig intracellulær vesikkel og protein trafficking. For å vurdere hvilken rolle HOOK3 i prostatakreft analyserte vi HOOK3 uttrykk ved immunhistokjemi på en TMA som inneholder mer enn 12.400 prostatakreft. Resultatene ble sammenlignet med tumor fenotype og PSA residiv samt avvik muligens definere relevante molekylære undergrupper som ERG status og sletting av 3p13, 5q21, 6q15 og PTEN. HOOK3 farging var negativ i normale luminale epitel celler i prostata, mens 53,3% av 10,572 tolkbare kreft viste HOOK3 ekspresjon, noe som ble ansett som lav i 36,4% og høy i 16,9% av tilfellene. Høyt nivå HOOK3 uttrykk var knyttet til avansert tumor stadium, høy Gleason score, høy indeks spredning, positiv lymfeknute scenen, og PSA tilbakefall (p 0,0001 hver). Den prognostisk rolle HOOK3 uttrykk var uavhengig av etablerte klinisk-patologisk parametere både i preoperative og postoperative innstillinger. Sammenligninger med molekylære funksjoner ble utført for å trekke konklusjoner om potensielle funksjon HOOK3 i prostata. En sterk assosiasjon med alle undersøkte delesjoner er i overensstemmelse med en rolle av HOOK3 for å opprettholde genomisk integritet ved å bidra til riktig sentrosomen sammenstillingen. Finne HOOK3 uttrykk i 74% av ERG positiv, men i bare 38% av ERG negative kreft (p 0,0001) antyder ytterligere funksjonelle interaksjoner mellom disse genene. I konklusjonen, resultatene av vår studie identifisere HOOK3 som en sterk kandidat prognostisk markør med en mulig rolle i å opprettholde genomisk integritet i prostatakreft, som kan ha potensial for inkludering i kliniske rutineanalyser
Citation. Melling N, Harutyunyan L, Hube-Magg C, Kluth M, Simon R, Lebok P, et al. (2015) High-Level HOOK3 uttrykket er en uavhengig prediktor for dårlig prognose Associated med Genomisk ustabilitet i prostatakreft. PLoS ONE 10 (7): e0134614. doi: 10,1371 /journal.pone.0134614
Redaktør: Zoran Culig, Innsbruck Medical University, ØSTERRIKE
mottatt: 28 april 2015; Godkjent: 10 juli 2015; Publisert: 31.07.2015
Copyright: © 2015 Melling et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer
finansiering:.. forfatterne har ingen støtte eller finansiering for å rapportere
konkurrerende interesser:. forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Prostatakreft er den vanligste kreftsykdommen hos menn i vestlige samfunn [1]. Mens de fleste svulster har en ganske lat klinisk forløp, representerer prostatakreft fortsatt den tredje vanligste årsaken til kreft dødsfall hos menn. Etablerte prognostiske parametere er Gleason grad, tumorutbredelse på biopsier, preoperativ prostataspesifikt antigen (PSA), og klinisk stadium. Selv om statistisk kraftig, de er ikke tilstrekkelig for optimal individuell behandling beslutninger. Håpet er at en bedre forståelse av sykdomsbiologi vil til slutt føre til identifisering av klinisk relevante molekylære markører som gir en mer pålitelig prediksjon av prostatakreft aggressivitet hos enkelte pasienter.
Familien av menneskelig krok mikrotubulidynamikk-tethering proteiner (kroker) består av tre homologer, HOOK1, HOOK2, og HOOK3, som er rikelig uttrykt i humane celler. Kroker fungere som adapter proteiner involvert i smugling av membranblærer og proteinkomplekser langs mikrotubuli mellom Golgi-apparatet, centrosomes [2-5], endosomes [6] og lysosomer [7]. En kreft relevant rolle er blitt foreslått spesielt for HOOK3 fra flere studier viser gjentatte endringer av genet. For eksempel, en studie rapporterte en HOOK3: RET fusjon i en sak av papillær skjoldbruskkjertelkreft, noe som viste seg å være onkogene i en mus xenograft kreft modell [8]. En annen studie fant protein-altering mutasjoner med ukjent betydning i to av 48 små tarmen nevroendokrine svulster [9]. I tillegg er HOOK3 genet lokalisert på 8p11, en vanlig stoppunkt i mange humane krefttyper, inkludert prostata cancer [10,11]. Følgelig ble inaktivere brudd resulterer i redusert uttrykk for HOOK3 funnet i en betydelig andel (9,0%) av svulster [11] i en studie på 77 prostatakreft.
Disse funnene bedt oss å studere mønstre av HOOK3 uttrykk i prostata cancer i mer detalj. Vi tok fordel av vår allerede eksisterende vev microarray (TMA) som inneholder 12 000 prostatakreft prøver koblet til en database med klinisk oppfølging og omfattende molekylære data. Våre funn viser at høye nivåer av HOOK3 protein uttrykk er sterkt knyttet til uønskede svulst fenotype og tidlig PSA tilbakefall og kan uavhengig forutsi dårlig utfall i prostatakreft.
Materialer og Metoder
Pasienter
radikal prostatektomi prøver var tilgjengelig fra 12,427 pasienter som gjennomgår kirurgi mellom 1992 og 2012 ved Institutt for Urologi og Martini klinikker ved University Medical Center Hamburg-Eppendorf. Oppfølgingsdata var tilgjengelig for totalt 12,344 pasienter med en median oppfølging på 36 måneder (spredning: 1 til 241 måneder, Tabell 1). Prostata spesifikt antigen (PSA) verdier ble målt etter operasjonen og PSA residiv ble definert som tidspunktet da postoperativ PSA var minst 0.2ng /ml og øker ved senere målinger. Alle prostata prøver ble analysert i henhold til en standard prosedyre, inkludert en fullstendig innebygging av hele prostata for histologisk analyse [12]. Den TMA produksjonsprosess er beskrevet tidligere i detalj [13]. Kort sagt, ble en 0.6mm kjerne som er tatt fra et representativt vev blokk fra hver pasient. Vev ble fordelt blant 27 TMA blokker, som hver inneholder 144 til 522 tumorprøver. For interne kontroller, hver TMA blokk inneholdt også ulike kontroll vev, inkludert normal prostata vev. Den molekylære database knyttet til denne TMA inneholdt resultatene på ERG uttrykk i 10678 [14], ERG bryte hverandre FISH analyse i 7099 (utvidet fra [15]), status sletting av 5q21 (CHD1) i 7932 (utvidet fra [16]), 6q15 (MAP3K7) i 6069 (utvidet fra [17]), PTEN (10q23) i 6704 (utvidet fra [18]), 3p13 (FOXP1) i 7081 (utvidet fra [19]) kreft og Ki67 merking indeks (Ki67LI) data i 4,426 kreft (utvidet fra [20]).
Etikk uttalelse
bruk av arkiverte diagnostiske venstre-over vev for produksjon av microarray og deres analyse for forskningsformål som samt pasientdataanalyse er godkjent av lokale lover (HmbKHG, §12,1) og av den lokale etikkutvalg (Ethics kommisjon Ärztekammer Hamburg, WF-049/09 og PV3652). Ifølge lokale lover, ble informert samtykke ikke er nødvendig for denne studien. Pasientjournaler /informasjon ble anonymisert og avidentifisert før analyse. Alt arbeid er utført i samsvar med Helsinkideklarasjonen.
Immunohistochemistry
nyklipt TMA snitt ble immunostained på en dag, og i ett eksperiment. Objektglassene ble deparaffinized og utsettes for varme-induserte antigen gjenfinning i 5 minutter i en autoklav ved 121 ° C i pH 7,8 Tris-EDTA-Citrat buffer. Affinitetsrenset primære antistoff HPA024756 dannet mot proteinet HOOK homolog 3 rekombinant protein epitop signatursignal (KEEIAQRCHELDMQVAALQEEKSSLLAENQVLMERLNQSDSIEDPNSPAGRRHLQLQTQLEQLQEETFRLEA) (kanin-polyklonalt antistoff, Sigma, St. Louis, MO, USA; fortynning 1: 150) ble påført ved 37 ° C i 60 minutter. Spesifisiteten av antistoffet ble bekreftet av produsenten, som viste et enkelt bånd på den forutsagte størrelse (83,1 kD) i en western blot. Bundet antistoff ble deretter visualisert ved hjelp av Envision Kit (Dako, Glostrup, Danmark) i henhold til produsentens anvisninger retninger [15]. Antistoffet vanligvis farget tumorcelle cytoplasma i alle celler (100%) av et gitt vev sted. Farging intensitet av alle tilfeller ble dermed semikvantitativt vurdert i tre kategorier:. Negative, lave (svak til moderat) og høye (sterk fargeintensitet)
statistikker
Statistiske beregninger ble utført med JMP 10.0. 2 programvare (SAS Institute Inc., NC, USA). Beredskaps tabeller og chi²-testen ble utført for å søke etter sammenhenger mellom molekylære parametere og tumor fenotype. Overlevelseskurver ble beregnet i henhold til Kaplan-Meier. Den log-rank test ble brukt for å påvise signifikante forskjeller mellom gruppene. Analyse av varians (ANOVA) test ble brukt for å søke etter assosiasjoner mellom celleproliferasjon og HOOK3 farging. Cox regresjonsanalyse ble utført for å teste statistisk uavhengighet og betydning mellom patologiske, molekylære og kliniske variabler. Separate analyser ble utført ved hjelp av ulike sett av parametere tilgjengelige enten før eller etter prostatektomi.
Resultater
Tekniske aspekter
I alt 10 572 (85,0%) av tumorprøver var interpretable i vår TMA analyse. Grunner for ikke-informative tilfeller (1,855 flekker; 15,0%) inkludert mangel på vev flekker i TMA delen eller fraværet av entydig kreftvev i TMA sted
HOOK3 uttrykk i normale og kreftprostataceller
.
Representative bilder av negative og positive HOOK3 immunostainings er vist i figur 1. HOOK3 immunfarging ble lokalisert i cytoplasma i celler (fig 1c innsats). Normalt vev, avledet fra pasienter med prostatakreft, viste ingen farging av stromale og luminal celler, mens basalceller farget positive (** i figur 1d). Positiv HOOK3 farging ble sett i 5636 av våre 10 572 (53,3%) tolkes prostatakreft og ble ansett som lav i 36,4% (Fig 1b) og høy i 16,9% av kreft (fig 1c).
(a) negativ , (b) lav intensitet, (c) høy intensitet farging ved 10x, innfellinger på 300x forstørrelse og (d) negative normale luminal celler og positive basal celler (*) sammen med høy-nivå positive kreftvev (**) på samme kjerne på 150x forstørrelse
Association med TMPRSS2. ERG fusjon status og ERG protein uttrykk
For å vurdere om HOOK3 uttrykk er knyttet til TMPRSS2: ERG fusjon i prostatakreft, brukte vi data fra tidligere studier (utvidet fra [14,15] data på TMPRSS2. ERG fusjon status innhentet av FISH var tilgjengelig fra 6302 og ved immunhistokjemi fra 9,370 svulster med evaluerbare HOOK3 farging data på både ERG FISH og IHC var tilgjengelig fra 6076 kreft. og en identisk resultat (ERG IHC positiv og pause ved FISH eller ERG IHC negativ og manglende pause ved FISH) ble funnet i 5811 av 6076 (95,6%) kreft. Positiv HOOK3 farging var knyttet til TMPRSS2: ERG omorganisering og ERG positivitet i prostatakreft. HOOK3 farging ble sett i 74,3% og 76,1% av krefttilfellene med TMPRSS2: ERG fusjon oppdaget av IHC og FISH, men fant i bare 38,2% av kreft uten ERG farging og 44,1% av kreft uten ERG rearrangements oppdaget av fisk (p 0,0001 hver fig 2)
IHC = immunhistokjemi.; FISH = fluorescens in situ hybridisering.
Association med svulst fenotype
Når alle karsinom ble i fellesskap analysert, høyt nivå HOOK3 uttrykk ble betydelig knyttet til avansert patologisk tumorstadium, høy Gleason grad, lymfeknutemetastaser (p 0,0001 hver) og kirurgisk margin positivitet (p = 0,0003). Ingen sammenheng ble funnet med høy preoperativ PSA-nivå (p = 0,7594, tabell 2). Subgruppeanalyse for ERG-negative og positive kreft viste lignende resultater (S1 og S2 Tables).
Association med andre sentrale genomiske strykninger
Tidligere studier har gitt bevis for forskjellige molekylære undergrupper av prostata kreft er definert av TMPRSS2: ERG fusjoner og flere genomiske slettinger. Andre og oss har tidligere beskrevet en sterk kobling av PTEN og 3p13 slettinger i ERG positivitet og av 5q21 og 6q15 slettinger til ERG negativitet [16-19]. Slik som å undersøke, om HOOK3 uttrykk kan være spesielt knyttet til en av disse genomiske slettinger, ble HOOK3 data i forhold til allerede eksisterende funn på PTEN (10q23), 3p13 (FOXP1), 6q15 (MAP3K7) og 5q21 (CHD1) slettinger. I analysen av alle tumorer, ble HOOK3 uttrykk vesentlig knyttet til alle slettinger som er nevnt ovenfor (PTEN, 5q21 og 3p13 (p 0,0001 hver), 6q15 (p = 0,003), fig 3a). Disse foreningene variert når ble utført subgruppeanalyse for ERG negative (fig 3b) og ERG positive kreft (fig 3c). Her HOOK3 farging ble sterkt korrelert med slettinger i PTEN (p 0,0001 for både ERG negative og positive kreft), 6q15 (begge p 0,0001) og 5q21 (p 0,0001, henholdsvis p = 0,01), men ikke med 3p13 slettinger (p = 0,10 og p = 0,73 henholdsvis).
(a) alle krefttyper, (b) i ERG-negative, c) ERG-positive undergruppe.
Association med tumor celleproliferasjon ( Ki67-merkeindeksen)
Strong HOOK3 farging ble vesentlig knyttet til akselerert celleproliferasjon, målt ved Ki67LI i alle kreftformer, så vel som i undergrupper av kreft med identisk Gleason score (≤3 + 3, 3 + 4, 4+ 3, og ≥4 + 4, p. 0,0001 hver, tabell 3)
Association med PSA tilbakefall
Oppfølgings data var tilgjengelige for 9,916 pasienter med tolk HOOK3 farging på TMA. En meget signifikant sammenheng mellom høyt nivå HOOK3 ekspresjon og tidlig PSA tilbakefall ble funnet da alle tumorer ble analysert, og også i den undergruppe analyser for ERG negative og positive cancere (p 0,0001 hverandre, fig 4a-4e).
(a) alle krefttilfeller (n = 9540), (b) ERG-negative (ERG
-) kreft (n = 4732), (c) ERG-positive (ERG
+) kreft (n = 3,678 ), (d)
PTEN
ikke-slettet (PTEN
norm) kreft (n = 4349), (e)
PTEN
slettet kreft (n = 1037).
multivariatanalyse
Fire forskjellige typer multivariate analysene ble utført evaluere den kliniske relevansen av HOOK3 uttrykk i ulike scenarier (tabell 4). Scenario 1 evaluert alle postoperativt tilgjengelige parametere inkludert patologisk tumorstadium, patologisk lymfeknute status (PN), kirurgisk margin status, preoperativ PSA verdi og patologisk Gleason grad oppnås etter den morfologiske evaluering av hele resected prostata. I scenario 2, ble alle postoperativt tilgjengelige parametre med unntak av lymfeknutestatus inkludert. Den rasjonelle for denne tilnærmingen var at indikasjon og omfanget av lymfeknute disseksjon ikke er standardisert i den kirurgiske behandlingen av prostatakreft, og at unntak pN i multivariat analyse kan markant øke saksnummer. Ytterligere to scenarier hatt til hensikt å modellere den preoperative situasjonen så mye som mulig. Scenario 3 inkludert HOOK3 uttrykk, preoperativ PSA, klinisk tumorstadium (CT scenen) og Gleason grad innhentet på prostatektomi prøven. Siden postoperativ bestemmelse av en svulster Gleason grad er «bedre» enn preoperativt bestemt Gleason grad (utsatt for utvalgsfeil og følgelig under-gradering i mer enn en tredjedel av tilfellene [21]), en annen multivariat analyse ble lagt. I scenario 4, ble det preoperative Gleason grad oppnås på en original biopsi kombinert med preoperative PSA, cT scene og HOOK3 uttrykk. HOOK3 viste seg å være en uavhengig prognostisk parameter i alle scenarier når alle svulster og også undergrupper av ERG negative og ERG positive tumorer ble analysert (tabell 4). HOOK3 viste seg å være en uavhengig prognosticator uansett testet scenario eller undergruppe (alle kreft: p = 0,0003 i scenario 1, p 0,0001 i scenario 2-4, ERG negative kreft: p = 0,0002 i scenario 1, p 0,0001 i scenario 2-4, ERG positive kreft: p = 0,0381 i scenario 1, p = 0,0433 i scenario 2, p = 0,0006 i scenario 3, p 0,0001 i scenario 4)
diskusjon
.
resultatene fra denne studien viser at høyt nivå HOOK3 uttrykk er en uavhengig prediktor for tidlig PSA tilbakefall i prostatakreft.
Vår immunhistokjemisk analyse viste cytoplasma HOOK3 flekker i 85,0% av 10,572 analyser prostatakreft. Normal prostata epitel viste typisk negativ eller svak farging i luminal celler, mens basal og stromale celler ikke flekker for HOOK3. At økende nivåer av HOOK3 parallelt kreft aggressivitet er forenlig med en relevant rolle HOOK3 opp regulering for prostatakreft utvikling og progresjon. Data fra The Human Protein Atlas (www.proteinatlas.org) synes å antyde at HOOK3 kan også være opp regulert i andre krefttyper, inkludert tykktarmskreft, livmorkreft, gliom, lungekreft, lymfekreft, og skjoldbrusk kreft [22].
Den sterke tilknytningen høyt nivå HOOK3 uttrykk med negative tumor funksjoner, inkludert avansert stadium, høy Gleason grad, nodal metastaser og PSA tilbakefall argumenterer for en praktisk relevans HOOK3 måling for prognosen vurdering. Det sterke HOOK3 uttrykk gjaldt prognostisk betydning selv i undergruppe av kreft husing PTEN slettinger-en av de sterkeste kjente prognostiske markører i prostatakreft [18,23,24] -further streker en klinisk relevant rolle HOOK3 testing. Dette er desto mer sant som prognostisk virkningen av HOOK3 var også uavhengig av kliniske og patologiske parametere. Vår omfattende multivariat modellering foreslår videre at HOOK3 kan være klinisk nyttig prognostisk markør i både pre- og postoperative scenarier. Tatt i betraktning at en klinisk biomarkør må analyseres på biopsimateriale og før behandling beslutninger er tatt, er det verdt å merke at vår tilnærming med å analysere molekylære funksjoner på ett minutt TMA vevsprøve som måler 0,6 mm i diameter nøye modeller de molekylære analyser av kjerne nålbiopsier hvor sammenlignbare mengder vev er evaluert. Som våre TMA prøvene ikke ble nøyaktig tatt fra «verste» område av hver tumor, men tilfeldig fra innenfor et representativt kreft område, kan vår TMA flekk være så representativ som mulig av det «verste» område av et klinisk kreft identifisert i et sett av kreft biopsier.
Det er ukjent hvordan HOOK3 kan bidra til kreftutvikling og progresjon. Vi gjorde ikke utføre egne funksjonelle eksperimenter, men det store antallet prostatakreft som inngår i vårt prosjekt sammen med omfattende molekylær informasjon om våre svulster gjorde oss i stand til å trekke noen konklusjoner om mulige kreftrelevante roller HOOK3 «i silico». Denne tilnærmingen av «funksjonell molekylær epidemiologi» første gang påvist at HOOK3 uttrykket er sterkt knyttet til klassiske parametere av genomisk ustabilitet, for eksempel forekomst av kromosomslettinger, og til forhøyet celleproliferasjon. Sletting av visse små og store kromosomale regioner er et kjennetegn på prostatakreft. Data fra neste generasjons sekvense studier viser at slike slettinger er mer utbredt enn noen mutasjoner av bestemte gener og mange av disse slettinger har vært knyttet til enten ERG positive (dvs. PTEN og 3p13) eller ERG negative kreft (dvs. 6q15 og 5q23). At høy HOOK3 uttrykk er knyttet til en høyere forekomst av alle analyserte slettinger fremhever en mulig involvering av HOOK3 på mekanismene som regulerer genomisk integritet. Dette er i overensstemmelse med tidligere arbeider som viser at HOOK3 er relevant for riktig funksjon av centrosomes, som det er nødvendig for transport og dynamisk sammenstilling av centrosomal proteiner [3,4]. Både slå ned og ektopisk overekspresjon av HOOK3 i cellelinje-modeller resulterte i nedsatt centrosomal funksjoner [3], et fragmentert Golgi-apparatet, forstyrret dårlig organisert mikrotubulus-nettverket, og en øket andel av celler med to eller flere kjerner [5]. I tillegg har sentrosomen abnormiteter vært knyttet til Aneuploidy i prostatakreft før [25].
Vår i silico tilnærming videre vist at HOOK3 overekspresjon er sterkt knyttet til ERG aktivering. Mer enn halvparten av all prostatakreft, spesielt de unge pasientene, bære Genfusjonene knytter androgen-regulert TMPRSS2 genet med transkripsjonsfaktor ERG [14,26]. Disse genomiske rearrangementer resultere i en androgen-drevet overekspresjon av ERG i rammede celler [27], og dermed endret ekspresjon av mer enn 1600 gener i prostata epitelceller [28]. Det er lite sannsynlig, men at høye nivåer i HOOK3 ERG-positiv kreft drives ved hjelp av direkte aktivering, fordi den HOOK3 promoter-regionen mangler ERG bindingsseter. Alternative forklaringer på den positive sammenslutning av HOOK3 og ERG uttrykk ville inkludere en direkte eller indirekte samspillet mellom disse to proteiner. Det kan for eksempel være mulig at HOOK3 -responsible for transport av centrosomal protein-vekselvirker med centrosomal proteiner, slik som integrin-bundet kinase (ILK), som er en relevant funksjonell partner av ERG [29,30]. ILK og ERG har vist seg å samarbeide kjøre malign transformasjon og epitelial-mesenchymale overgang i prostata kreft [31].
I sammendraget, gir vår studie tyder på at HOOK3 er en uavhengig prognosticator i prostatakreft. Vi foreslår derfor, at HOOK3 uttrykk analyse har potensial for klinisk rutinemessig anvendelse, enten alene, eller mer sannsynlig, i kombinasjon med andre biomarkører. Vår store vev microarray tilnærming vil fortsette å bevise svært instrumental for kontinuerlig å identifisere egnede prognostiske biomarkører. Storskala molekylære databaser knyttet til store TMA også aktivere begrenset funksjonsanalyser «i silico».
Hjelpemiddel Informasjon
S1 Table. Klinisk-patologisk sammenslutning av HOOK3 farging i ERG negative undergruppe
doi:. 10,1371 /journal.pone.0134614.s001 plakater (DOC)
S2 Table. Klinisk-patologisk sammenslutning av HOOK3 farging i ERG positive undergruppe
doi:. 10,1371 /journal.pone.0134614.s002 plakater (DOC)
Takk
Vi takker Janett Lüttgens , Sünje Seekamp og Inge Brandt for utmerket teknisk assistanse.
