Abstract
Pim-en kinase, en serin /treonin protein kinase kodet av
pim
proto-onkogen, er involvert i flere signalveier, for eksempel regulering av cellesyklusprogresjon og apoptose. Mange krefttyper viser høye ekspresjonsnivåer av PIM-kinaser og spesielt Pim-1 har vært knyttet til initiering og progresjon av den ondartede fenotype. I flere kreftvevet somatiske Pim-1 mutanter har blitt identifisert. Disse naturlige varianter er nonsynonymous enkeltnukleotidpolymorfi, variasjoner av et enkelt nukleotid forekommer i det kodende område og fører til aminosyre-substitusjoner. I denne studien undersøkte vi effekten av aminosyre-substitusjon på den strukturelle stabilitet og på aktiviteten av Pim-1 kinase. Vi uttrykt og renset noen av mutanter av Pim-1 kinase som er uttrykt i kreftvevet og rapportert i den enkelt-nukleotid polymorfismer database. De punktmutasjoner i variantene i vesentlig grad påvirker konformasjonen av det native tilstand av Pim-1. Alle mutantene, uttrykt som løselige rekombinante proteiner, viser en redusert termisk og termodynamisk stabilitet og en lavere aktiveringsenergiverdier for kinaseaktivitet. Den reduserte stabiliteten ledsaget av en økt fleksibilitet antyder at Pim-1 varianter kan være involvert i et større nettverk av protein interaksjoner. Alle mutanter bundet ATP og ATP lignings-hemmere med sammenlign IC50-verdier tyder på at de studerte Pim-1 kinase mutanter kan effektivt målrettet med hemmere utviklet for villtype protein
Citation. Lori C, Lantella A, Pasquo A Alexander LT, Knapp S, Chiaraluce R, et al. (2013) Effekt av enkel aminosyresubstitusjon Observert i Cancer på Pim-1 kinase termodynamisk stabilitet og struktur. PLoS ONE 8 (6): e64824. doi: 10,1371 /journal.pone.0064824
Redaktør: Annalisa Pastore, National Institute for Medical Research, Medical Research Council, London, Storbritannia
mottatt: 23 januar 2013; Godkjent: 18 april 2013; Publisert: 05.06.2013
Copyright: © 2013 Lori et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Forfatterne har ingen støtte eller finansiering for å rapportere
konkurrerende interesser:.. forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Pim-en kinase tilhører en familie av serin /treonin proteinkinaser (EC 2.7.11.1) som er kodet av
pim
proto-onkogener [1] – [3]. Pim-1-lokuset ble opprinnelig identifisert som en felles provirale innføringsstedet i Moloney murin leukemi virus-induserte T-celle lymfomer hos mus [4]. Det kodede protein kinase er involvert i flere signalveier, for eksempel regulering av cellesyklusprogresjon og apoptose. De tre Pim familiemedlemmene Pim-1, Pim-2 og PIM-3 som er identifisert hos mennesker er blitt rapportert som aliserte proteinkinaser som spiller en viktig rolle i tumorbiologi [5], [6]. I tillegg har mange krefttyper viser høye uttrykk nivåer av Pim kinaser. For eksempel Pim-1 og Pim-2 har blitt rapportert å være sterkt uttrykt i leukemi, lymfom, prostatakreft og multippel myelom og anses for å være involvert i initiering og progresjon av den ondartede fenotypen [7]. I tillegg har Pim-1 blitt identifisert som et viktig kofaktor som regulerer ekspresjonen av den oncogene transkripsjonsfaktoren c-Myc ved fosforylering serin 10 i histon H3 i enhancer-regionen til Myc-locus og dets målgener [8].
Ekspresjon av Pim-1 kinase kan induseres ved en rekke vekstfaktorer. Pim-1 homeostase er viktig for normal cellefunksjon. Pim-en aktivitet er derfor strengt regulert på flere nivåer, inkludert transkripsjonen, post-transcriptional, translasjonsforskning og post-translasjonell. Flere signaltransduksjonsveier har vært forbundet med reguleringen av Pim-1-ekspresjon. For eksempel Pim-1-ekspresjonen er stimulert av aktivering av JAK /STAT sti som også regulerer dens degradering via negativ tilbakekoblingssløyfe. Pim-1 er overuttrykt i mange hematologiske maligniteter og nyere studier på Pim familie kinaser tyder på at et viktig element også utenfor hematopoetiske system, som i cellene i flere solide tumorer [6]. Spesielt, i flere cancervev somatiske Pim-1-mutanter er blitt identifisert [9] – [12]. Mange av disse varianter er nonsynonymous enkeltnukleotidpolymorfi (nsSNPs), enkelt nukleotidvariasjoner som forekommer i det kodende område og fører til en polypeptidsekvens med aminosyresubstitusjoner [13]. Viktigere, etter vekstfaktor stimulerings Pim-1 proteinnivåer er forbigående, og proteinet har en kort halveringstid i celler blir raskt nedbrutt av ubiquitin-systemet.
En rekke undersøkelser har adressert effekten av nsSNPs på protein stabilitet, protein-protein interaksjoner og protein funksjoner [14]. På samme tid har naturlige varianter blitt katalogisert med det formål å skille mellom naturlig forekommende genetiske forskjeller, antagelig uten funksjonelle konsekvenser (passasjer mutasjoner) som de som er samlet opp i den SNP databasen, og de som er assosiert med utviklingen av sykdommer (driver mutasjoner) [15], som OMIM databasen [16], human Gene Mutation database [17], og særlig de funnet å være assosiert med kreft (COSMIC) [11].
Computational analyse av identifiserte mutanter har spådd at rundt 30% av proteinvarianter som følge av nsSNPs er mindre stabile enn villtype-varianten [18] er imidlertid en eksperimentell vurdering av stabiliteten av vanlige varianter fortsatt behov for å bestemme effekten av mutasjoner på proteinstruktur og funksjon [19].
i denne studien har vi valgt nsSNPs resulterer i Pim-1-varianter som er uttrykt i kreftvevet og rapportert i SNP database [9], [11], [20]. Disse Pim-1-varianter er blitt grundig karakterisert for å undersøke effekten av enkel aminosyresubstitusjon på Pim-en termisk og termodynamisk stabilitet og struktur i oppløsning. Vår studie viste at alle mutanter studert føre til betydelig destabilisering av Pim-en kinase.
Resultater
Spektroskopiske Karakterisering av Pim-en villtype og mutanter Funnet i Cancer
I denne studien har vi valgt fire mutasjoner (Y53H, E124Q, E135K og E142D) som alle har blitt oppdaget i kreft for en detaljert protein stabilitet og strukturell analyse ved hjelp av spektroskopiske teknikker (fig. 1). Mutantene er plassert i det katalytiske domene av Pim-1 kinase (Fig. 1A). Y53 er lokalisert i den N-terminal kinase lapp i den sentrale β-ark vugge og dens amidnitrogenet danner en hydrogenbinding med I66 karbonylgruppe på beta-tråd 3 (fig. 1B). Residuet E124 ligger i den kinase hengselregionen og danner en saltbro med R122 (Fig. 1C). Hengselregionen er et sentralt element som regulerer den C-terminale lapp bevegelse som kan påvirkes av den E124Q mutasjonen. E135 ligger i helix αD danner en hydrogenbinding med Q127 som er sannsynlig å være viktig i å stabilisere dette helix (Fig. 1C). Endelig er E142 en overflate utsatt rester og den konservative substitusjon med og aspartate er ikke sannsynlig å ha en betydelig effekt på protein stabilitet, dynamikk og struktur
(A) Oppbygging av Pim-en (PDB kode. 1XWS ) vist som et bånd diagram. Muterte rester er markert og de viktigste sekundære strukturelementer vises. ATP-mimetiske inhibitor cocrystallized i denne strukturen er vist i ball og pinne representasjon. (B) Detaljert visning av den lokale strukturelle miljøet rundt det muterte rester Y53. (C) Detaljert visning av den lokale strukturelle miljøet rundt det muterte rester E135. (D) i nærheten av UV-CD-spektrene ble tatt opp i en 1,0 cm kvartskuvette på 1,4 mg /ml proteinkonsentrasjon på 20 mM Tris /HCl, pH 7,5 inneholdende 0,2 M NaCl og 2 mM DTT. (E) Intrinsic fluorescens-emisjonsspektra ble registrert ved 0,04 mg /ml proteinkonsentrasjon (295 nm eksitasjonsbølgelengde) ved 10 ° C i 20 mM Tris /HCl, pH 7,5 inneholdende 0,2 M NaCl og 200 uM DTT. (F) Far-UV-CD-spektrene ble tatt opp i en 0,1 cm kvartskuvette ved 0,2 mg /ml i 20 mM Tris /HCl, pH 7,5 inneholdende 0,2 M NaCl og 0,4 mM DTT.
nær-UV-CD-spektret av villtype Pim-1 viser den spektrale bidrag fra alle aromatiske rester, og er karakterisert ved to sterke negative topper sentrert ved 290 nm og ved 269 nm fulgt av fin struktur trekk ved 275-280 nm (fig. 1D) . Den E124Q mutant viser en nær-UV-CD-spektrum tett lik den til villtypen, bortsett fra en liten reduksjon av den fine strukturen ved 275-280 nm. E142D viser en nær-UV-CD-spektrum som overraskende er forskjellig fra villtype-spektrum i 275-280 nm området. Den nesten-UV CD spekteret av Y53H er dramatisk forskjellig fra villtypen spekteret og de andre mutanter: den fine strukturen på 275-280 nm er tapt, bidrag på 290 nm er betydelig redusert og den negative ellipticity på rundt 269 nm er markert endret. E135K nær-UV CD spekteret minner om Y53H med en markert redusert dichroic aktivitet i 290-275 nm region og med et positivt bidrag i regionen under 275 nm. Fluorescens-emisjonsspektra av vill type og mutanter blir alle sentrert ved samme maksimale emisjonsbølgelengden rundt 345 nm og viser forskjeller i utslipps fluorescensintensiteter (fig. 1E). Far-UV-CD-spektra av alle mutanter er tilnærmet superimposable med den i Pim-en villtype og som er typisk for en alfa- og beta-protein, som viser et lokalt minimum på rundt 208 nm, 200 nm null skjærings og en 1,52 forholdet mellom 208 /222 bånd (fig. 1F).
temperatur~~POS=TRUNC avhengighet~~POS=HEADCOMP av kinaseaktivitet
temperaturavhengigheten av kinaseaktiviteten Pim-en villtype og dets mutanter ble undersøkt over temperaturområdet 10- 42 ° C (fig. 2A). De optimale temperaturer for katalyse ved konstant ATP-konsentrasjon ble anslått til å være ved 37 ° C for villtypen og E142D, ved rundt 35 ° C i E124Q og Y53H, og ved rundt 30 ° C i E135K (tabell 1 og fig. 2A). Spesielt, er den kinase-aktivitet ved 37 ° C på alle Pim-1-mutanter betydelig redusert og svarer til 57, 37, 16 og 3% av den til villtypeproteinet for E142D, E124Q, Y53H og E135K, respektivt. Aktiveringsenergien,
E
a
‡, bestemt ved Arrhenius ligning (1) i temperaturområdet mellom 10 ° C og den optimale temperatur for hvert protein er lavere enn for vill typen (tabell 1 og 2B fig.). Dette resultat tyder på en øket fleksibilitet i alle variantene i forhold til villtype, spesielt tydelig for E135K. Sammenligningen av temperaturavhengigheten av kinaseaktivitet med den strukturelle varme utfolding overvåket ved 209 nm (fig. 3A) indikerer klart at alle variantene er betydelig mindre varmemotstandsdyktige og mer fleksibelt enn villtypen.
(A) temperaturavhengigheten av kinaseaktiviteten Pim-en vill-type og mutanter. (B) Ikke-lineær tilpasning av temperaturavhengigheten av kinaseaktivitet til Arrhenius ligning (eqn 1.); det innfelte viser lineær Arrhenius tomten for de samme dataene. Analysene ble utført under de betingelser som er beskrevet i materialer og metoder, ved hjelp av 2,7 mikrometer enzymet.
(A) Pim-en villtype og mutanter ble oppvarmet fra 10 ° C til 72 ° C i en 0.1- cm kvartskuvette ved 0,2 mg /ml i 20 mM Tris /HCl, pH 7,5 inneholdende 0,2 M NaCl og 0,4 mM DTT. Dichroic aktivitet ved 209 nm ble overvåket kontinuerlig hver 0,5 ° C. (B) Første derivat av de samme dataene som i (A). (C) PMTV data registrert i de samme eksperimentene er vist i (A).
Thermal Unfolding
Den termiske stabilitet Y53H, E124Q, E135K og E142D ble undersøkt av å overvåke kontinuerlig elliptisitet endringer ved 209 nm i temperaturområdet mellom 10 og 72 ° C. Data for mutantene ble sammenlignet med den til villtypeproteinet (fig. 3A). Parameteren velges til å sammenligne overgangskurvene til Pim-en vill type og mutanter er smeltetemperaturen (T
m) definert som midtpunktet av denaturering prosess som beregnet ved å plotte den første deriverte av de molare elliptisiteten verdier som en funksjon av temperaturen (fig. 3B). De temperaturinduserte elliptisitet endringer på 209 nm, hvor hoved amplituden ble observert, forekommer i en tilsynelatende kooperativ overgang for E124Q og E142D, med T
m verdier fra 40,0 til E124Q og 44,0 ° C for E142D. For E135K overgangen vises mindre samvirke med et T
m verdi på 45,0 ° C, og ingen påvisbar akkumulering av utfolding mellomprodukt (er), hvilket antyder at substitusjon av E135 med en lysinrest kan indusere en delvis lokal utfolding og /eller at denne varianten kan eksistere som en heterogen befolkning på brettet stater. For villtype og Y53H, den tilsynelatende tre-statlige termiske overganger foreslår opphopning av utfoldelsen mellom med to T
m verdier. Den første overgangen skjer med T
m verdier (T
M1) på 40,5 og 40,0 ° C, den andre (T
m2) på 54,0, 52,0 ° C for villtype og Y53H henholdsvis (Tabell 2 ). De temperaturinduserte elliptisitet endringer for vill type og mutanter er alle sammenfallende med den varmeinduserte økningen av fotomultiplikatorrøret spenning (PMTV) over 370 V (fig. 3C), noe som tyder på at den temperaturinduserte utfolding er ledsaget av proteinaggregering [ ,,,0],21]. Aggregering oppsto også når termiske skanninger ble utført ved en lavere oppvarmingshastighet med en forskyvning av den tilsynelatende T
m til lavere temperaturer; forskjellene mellom den tilsynelatende T
m av villtype og varianter var de samme som de som er målt ved høyere oppvarmingshastighet (data ikke vist). De observerte overganger er irreversible, som antydet med spektrene målt ved slutten av avkjølingsfasen som skiller seg fra de native proteiner, målt ved begynnelsen av den termiske overganger. Videre undersøkelse av kyvetten ved slutten av avkjølingsfasen viste nærvær av en stor mengde bunnfall i alle prøvene.
Effekter av Pim-1 Mutasjoner på ATP og binding av inhibitor
identifiserte mutasjoner i kreft er en hyppig årsak til medikamentresistens. Vi var derfor interessert hvis hemmer binding ville bli påvirket av de studerte mutasjoner. For å løse dette vi vist flere kjente Pim-1 hemmere av beta-karbolin og imidazopyridazole klasse [22], [23] av temperaturskift analyser [24]. Screening mot en rekke hemmer derivater viste ingen signifikante forskjeller i temperaturskiftverdier som tyder på at alle mutanter binder disse hemmere med lignende binding konstant (tabell S1 og tabell S2). For å bekrefte dette vi målte enzymkinetiske data på en undergruppe av inhibitorer. IC50-verdiene til Pim-1-inhibitorer K00487, K018444a og K00207a var 0,048, 0,010 og 0,007 mM, respektivt, for Pim-en villtype. Disse verdiene var tett lik for de Pim-1 varianter med unntak av IC50 verdiene for K00487 og K00207a som var 1.8- og 1.4 ganger økt for Y53H. Vi konkluderte derfor med at spesifikk hemmer binding er ikke signifikant påvirket av de studerte mutasjoner.
Urea-indusert Equilibrium Unfolding Transitions
Pim-en villtype og varianter reversibelt utfolde seg i urea ved 10 ° C i 20 mM Tris-HCl, pH 7,5, inneholdende 200 uM ditiotreitol (DTT) og 0,2 M NaCl. Effekten av økende konsentrasjoner urea (0-8 M) på strukturen av PIM-1- mutanter ble analysert ved hjelp av UV-langt-CD og fluorescens-spektroskopi og sammenlignet med den virkning som utøves på den ville type. Den iboende fluorescensemisjon intensitet ved 345 nm på Pim-en villtype og varianter endringer etter 30 minutters inkubasjon ved 10 ° C, i tilstrekkelig tid til å nå likevekt (fig. 4). Handlingen i de relative fluorescens intensitet endringer versus økende denaturant konsentrasjonen viser komplekse profiler for villtypen og alle mutanter (Fig. 4), noe som tyder en ikke to-stats Utbrettingsprosessen og befolkningen i denaturering mellom (e). Kompleksiteten av den etterfølgende profilene kan tilskrives den multi-domene arkitektur av Pim-1 inneholdende tryptofanrester i både de N-terminale og C-terminale fliker av proteinet. Ved slutten av overgangen, over 7 M urea, er den indre fluorescensemisjonen intensitet ved 345 nm sank omtrent 1,3 ganger (fig. 4) og emisjonsbølgelengden skift maksimal fluorescens til rundt 357 nm enten for villtype og alle variantene (data ikke vist). De samme prøver som benyttes til å overvåke fluorescensemisjonen forandringer (fig. 4) i løpet av utfoldelsen overgang ble anvendt for å overvåke fjernt UV-sirkulærdikroisme elliptisitet (fig. 5) for å tillate en direkte sammenligning med fluorescens-data. De urea-induserte forandringer i 222 nm elliptisitet til alle mutanter er lik som villtypen, viser en sigmoidal avhengighet av urea konsentrasjon og følger en tilsynelatende to-tilstandsovergang uten noen påvisbar mellomproduktet (fig. 5). Utbrettingsprosessen er fullstendig reversibel ved fortynning av denaturant enten for villtype eller for alle mutanter (fig. 5) med overgangspunktene mellom 4,23 og 5,34 M urea (tabell 2). Tabell 2 viser termodynamiske parametere verdiene oppnådd for villtype og mutante former av Pim-en fra de vidt UV CD overgangs data. Pim-en villtype er betydelig mer stabil enn alle de varianter, som angitt ved sammenligning av Δ
G
verdier som i tilfelle av E135K er omtrent 3,5 ganger lavere enn den til villtype (tabell 2) . Nedgangen i Δ
G
kan i hovedsak henvist til de lavere
m
målte verdiene for alle varianter med hensyn til villtypen. Disse resultatene indikerer at endringen i løsningsmidlet eksponerte overflatearealet ved utfolding er mindre for alle Pim-1-varianter enn for villtype-proteinet. Spesielt,
m
verdiene bestemt for Pim-en villtype og dens varianter (tabell 2) er fem ganger lavere enn spådd for en monomere protein av 272 aminosyreresidier utfoldet i urea [25]. De lave verdier av
m
kan være knyttet til multi-state likevekt utspiller seg, i tråd med resultatene oppnådd overvåking utbrettingsprosessen av iboende fluorescens utslippsintensiteten (Fig. 4).
Normalisert relative fluorescensstyrkene på 345 nm; de heltrukne linjer representerer ikke-lineær regresjon tilpasning av de relative intensiteter fluorescens ved 345 nm for å eqn. 5 beregnet som beskrevet i materialer og metoder. Reversibiliteten punktene er vist som tomme sirkler, og ble ikke inkludert i den ikke-lineære regresjonsanalyser. Alle spektra ble registrert ved 10 ° C som beskrevet i Materialer og Metoder. (A-C) brøkdel av de innfødte (
f
N), første mellomtid (
f
I1), andre mellom (
f
I2) og utfoldet (
f
U) tilstander, beregnet som beskrevet i materialer og metoder ved hjelp av termodynamiske parametere hentet fra anfall av likevekt utfoldelsen overganger til eqn. 5, er vist for villtype (A), E124Q (grønn) (B) og E135K (rosa) (C).
Molar ellipticity på 222 nm ([Θ]
222 ) rapporterte etter fjernelse av høy-frekvensstøy og den lavfrekvente tilfeldige feil ved SVD. Sammenhengende linjer er ikke-lineær regresjon til eqn. 3 av data ved varierende denaturerende konsentrasjoner, som beskrevet i Materialer og Metoder. Reversibiliteten punktene (tomme symboler) er vist, for oversiktens skyld, bare for villtypen og ble ikke inkludert i den ikke-lineære regresjonsanalyser. Alle spektra ble registrert ved 10 ° C som beskrevet i materialer og metoder.
urea-indusert utfolding overganger overvåkes av relative fluorescens intensitet endringer (Fig. 4) ble analysert ved hjelp av en fire-tilstandsmodell til ligning 5, som rapportert i Materialer og Metoder. De termodynamiske parametere i forhold til den etterfølgende prosess er gjengitt i tabell 3. Dataene indikerer at den første overgang fra den opprinnelige tilstand (N) til det første mellomproduktet (I
1) inntreffer for Pim-en villtype og alle mutanter under 1 M urea med en større Δ
G
verdi for E124Q og en lavere Δ
G
verdi for E135K. Den andre overgangen fra I
1 til den andre mellom (I
2) forekommer i en svært lik urea konsentrasjonsområde for hele Pim-1 mutanter undersøkt og Δ
G
verdier for E142D og Y53H foreslår en stabilisering av mellomproduktet for disse to varianter (Tabell 3). Den Δ
G
verdi i forhold til den siste overgangen til denaturert tilstand (U) er betydelig større for villtype i forhold til variantene. I tråd med resultatene oppnådd fra fjerne UV-CD sigmoidal overganger (tabell 2), summen av Δ
G
verdier for de tre overganger er større for villtype, sammenlignet med de andre mutanter, med den unntak av E142D hvis Δ
G
tot er lik som villtypen. Spesielt den Δ
G
tot av E135K er betydelig lavere enn for alle de andre variantene. Avviket mellom de termodynamiske parametrene oppnådd langt-UV CD og fluorescens intensitet støtter sterkt nærvær av utfolder mellomprodukter. Mangelen på en påvisbar mellomprodukt ved vidt UV-CD kan tyde på at de mellomliggende tilstander som detekteres ved fluorescens representerer konformasjonsendringer som forekommer i nærhet av en hvilken som helst av de tryptofanrester, med alternative tertiære ordninger. Det er godt etablert at fluorescens-intensiteten er ekstremt følsomme for miljøet av en fluorofor, og er ansett som en av de mest direkte signaler som kan brukes til å overvåke termodynamikk glattende overganger [26]. For å evaluere fraksjonert oppsamling av de forskjellige artene ved urea-induserte utfolding likevektsfordelingen av de fire arter, N, I
1, I
2 og U som en funksjon av denaturant konsentrasjon kan rekonstitueres ved hjelp av tilpasset verdier av Δ
G
1, Δ
G
2, Δ
G
3
m
1,
m
2 og
m
3 i tabell 3. likevekts~~POS=TRUNC distribusjon av N,
1, i
2 og U er lik for villtypen (fig. 4A) og alle variantene kan imidlertid noen forskjeller observeres (fig. 4B-C). Fraksjonen av N (
f
N) er økt for E124Q (fig. 4B) og betydelig mindre for E135K (fig. 4C), og sammenlignes med villtype (fig. 4A ) for alle de andre Pim-1-varianter (data ikke vist). Fraksjonen av I
1 (
f
I1), som akkumuleres på 1,0 M urea for alle arter, er litt større for E135K og mindre for E124Q. Den fraksjonelle fordeling av den andre mellomliggende denaturering I
2 (
f
I2) som akkumulerer ved omtrent 4,0 M urea, vises beskjedent økt for Y53H, E124Q og E135K, sammenlignet med villtype (data ikke vist). Spesielt for villtypen og alle varianter unfolding mellom I
1 viser den samme maksimale emisjonsbølgelengden N sentrert på ca 345 nm, mens det av I
2 er forskjøvet til rundt 348 nm. Den detaljerte analysen av Pim-en utfolder overganger tyder på at betydelige forskjeller i domene plastisitet og utfolding oppstå i Pim-1 mutanter sammenlignet med villtype protein.
Diskusjoner
Denne studien representerer, så vidt vi vet, den første spektroskopiske og termodynamisk karakterisering av menneskelig kinase Pim-en og noen av dens sykdoms relevante mutanter funnet i kreft. Vi undersøkte effekten av aminosyre-substitusjon på termisk og termodynamisk stabilitet av villtype Pim-1 og sammenlignet disse resultatene med fire Pim-1-varianter, Y53H, E124Q, E135K og E142D, rapportert i SNP’er database [9] – [12] , [15], [20]. Undersøkelse av Pim-en krystallstruktur viste at de fleste mutasjoner er lokalisert nær strukturelle elementer som er viktige for kinase funksjon og som danner polare interaksjoner med naborester.
De punktmutasjoner i variantene påvirke konformasjon av de innfødte state of Pim-en. Forskjellene i nær-UV CD mellom mutanter og villtype tyder på at tertiære kontakter er vesentlig endret for alle mutanter og at singelen aminosyren substitusjon påvirker Pim-en tertiær struktur og føre til dyptgripende endringer i det totale protein tertiær fold. Spesielt, substitusjon av Y53 med histidin fører til dramatiske tertiære strukturen endres, slik det er åpenbart fra tapet av den fine strukturen ved 260-280 nm (Fig. 1D). Den N-terminale lapp mutant Y53H viser de mest vesentlige endringer i tertiære kontakter, som dømt på grunnlag av nær-UV CD spekteret. Spesielt, den nære UV-CD-spekteret av E124Q mutanten synes mer lik den til villtypen, sannsynligvis fordi endringen av en ladet polar Glu rester i uladet polar Gin rest har bare en liten virkning på den tertiære strukturen og stabiliteten .
Tyr53 resten blir plassert i midten av beta-tråd 2 og dens amidnitrogenet er hydrogenbundet til I66 karbonyl på beta-tråd 3. i Y53H, substitusjon av Y53 med en polar histidin kan føre til en ny hydrogenbinding med H68 (fig. 1). I tillegg nærhet av Y53 til fosfatbindende P-bue, en region som spiller en viktig rolle i den spesifisiteten og affiniteten av inhibitorer [27], tyder på at mutasjon av denne rest kan påvirke hemmer binding.
den andre mutasjon som finnes i kreft, E124Q angår en rest som ligger i leddområdet (121-126). Den OE2 av E124 danner et salt bro med H11 av nabo R122 (Fig. 1). Substitusjon av E124 for glutamin (E124Q) ødelegger salt bro i hengsel-regionen som kan bestemme mobiliteten av den N-terminale (33-121) og C-terminale (128-305) fliker. Spesielt siden flikene ofte roter eller tett rundt hengslene på hemmere bindende mutasjon av E124 vesentlig endrer de dynamiske egenskapene til Pim-en og kan endre hemmere affinitet. Interessant nok er dette glutamat-argininsalt bro ikke til stede i den Pim-2-isoformen muligens bidra til den lavere stabilitet av dette protein [28].
Reversibiliteten av urinstoffet induserte utfolding likevekt ved lav temperatur tillater en kvantitativ bestemmelse av effekten av mutasjoner på termodynamikken for Pim-en utfolding. Alle mutantene, uttrykt som løselige rekombinante proteiner, viser en redusert termisk og termodynamisk stabilitet (tabell 2 og 3). Den destabiliserende effekt av alle de aminosyresubstitusjoner er spesielt tydelig fra den reduksjon i smeltetemperaturen overvåkes av sekundære strukturen endres som antyder en høyere fleksibilitet av variantene i forhold til villtypen. Reduksjonen i smeltetemperaturen for alle de Pim-1-varianter som studeres er parallell med en betydelig reduksjon i den Δ
G
H
2
O i forhold til den urea-induserte utfolding sammenlignet villtype. Disse resultater er overraskende siden alle mutanter er mindre stabile enn villtype og Pim-1 er et proto-onkogen, og dermed kan man konkludere med at Pim-1-varianter er mindre effektive som onkogener enn villtypen. Imidlertid er redusert stabilitet følges av økt fleksibilitet, som angitt ved de lavere aktiveringsenergiverdiene for kinase-aktivitet observert i alle varianter i forhold til den til villtypen, hvilket antyder at Pim-1-varianter kan være involvert i et større nettverk av protein interaksjoner
spesielt, overgangspunktene for de spektrale forandringer av alle mutanter er ikke vesentlig endret i forhold til villtypen.; dermed reduksjon av Δ
G
H
2
O verdiene skyldes hovedsakelig en nedgang i
m
verdier. Således kan effekten av aminosyren substitusjon på Pim-1-stabilitet kan i hovedsak refereres til en reduksjon i endring av løsningsmidlet eksponerte overflateareal på utfolding for alle Pim-1-varianter.
I konklusjonen våre resultater indikerer at effekten av mutasjonen observert i kreftvev er rettet mot lokale endringer av tertiær struktur som imidlertid ikke påvirke binding til type i kinase hemmere studert.
Materialer og metoder
seterettet mutagenese
Pim-en vill type enzym plasmid ble oppnådd ved SGC (Oxford). Hurtigskifteseterettet mutagenese Kit (Stratagene) ble anvendt for å introdusere de enkle mutasjoner på villtype Pim1 plasmid anvendt som templat. De mutagene oligonukleotider brukt, er oppført i tabell 4.
Protein Expression og rensing
Rekombinant Pim-1 proteinet er uttrykt og renset som beskrevet i [29] med mindre modifikasjoner. Pim-en
villtype og mutanter ble uttrykt i
E. coli
stammen BL21 (DE3). 10 ml over natten kultur ble dyrket ved 37 ° C i en l LB-medium inneholdende ampicillin som antibiotika ved en sluttkonsentrasjon på 50 ug /ml til optisk densitet OD
600 nådde 0,6. Kulturen ble avkjølt på is i 20 minutter, hvoretter protein-ekspresjon ble indusert over natten ved tilsetning av 0,5 mM isopropyl-β-D-tiogalaktosid (Sigma-Aldrich) og dyrket over natten ved 15 ° C med energisk rysting. Kulturen ble høstet ved sentrifugering og resuspendert i 50 ml bindingsbuffer (50 mM Hepes, 500 mM NaCl, 5 mM imidazol, 5% glyserol, pH 7,5) inneholdende 0,5 mM
tris plakater (2-karboksyetyl) fosfin- (TCEP), og lagret ved -20 ° C inntil bruk. Cellene ble tint på is supplert med proteasehemmere (Complete, Roche) og forstyrret av lydbehandling. Lysatet ble fjernet ved sentrifugering, og supernatanten ble fylt på en DE52 kolonne (GE Healthcare), på forhånd ekvilibrert med bindende buffer og 0,5 mM TCEP, for å fjerne nukleinsyrer. Gjennomstrømnings ble applisert på en Ni-NTA (Ni
2 + – nitriltriacetate) affinitetskolonne (GE Healthcare) pre-ekvilibrert med bindende buffer. Kolonnen ble vasket med bindingsbuffer for å eluere svakt bundede forurensninger. Det rekombinante protein ble eluert ved å passere over kolonnen bindingsbufferløsninger inneholdende økende konsentrasjoner imidazol (50 mM, 100 mM, 150 mM og 250 mM, respektivt). De oppsamlede eluatene ble supplert med en sluttkonsentrasjon på 10 mM DTT og testet for renhet på SDS-gel ved bruk av precasted gelsystemet (Invitrogen). De rene fraksjoner ble inkubert over natten med tobakk etse virus protease (Pro-TEV), for å fjerne den hexahistidine tag. Etter fordøyelse, ble proteinet konsentrert til 2 ml ved bruk av Millipore konsentratorer og applisert på en Superdex 200 300/10 gelfiltreringskolonne på AKTA FPLC system på forhånd ekvilibrert med 50 mM Tris /HCl, 0,25 M NaCl, 10 mM DTT, pH 7.5 ved en strømningshastighet på 1,0 ml /min. 2 ml fraksjoner ble samlet og det rene proteinet ble identifisert ved SDS-PAGE. Proteinkonsentrasjonen ble bestemt spektrofotometrisk ved hjelp av en molar absorptivity av 48930 M
-.
1 cm
-1at 280 nm basert på en molekylvekt på 35,685 kDa
Spektroskopiske
