Abstract
Høyverdig serøs eggstokkreft (HGSOC) er den mest aggressive histologisk type epitelial eggstokkreft, som er preget av en høy frekvens av somatiske
TP53
mutasjoner. Vi utførte exome analyser av svulster og matchet normalt vev av 34 japanske pasienter med HGSOC og observert et betydelig antall pasienter uten
TP53
mutasjon (24%, 8/34). Kombinert med resultatene av kopiantall variasjon analyser, inndelt vi de 34 pasientene med HGSOC inn subtyper utpekt ST1 og ST2. ST1 viste intakt p53 sti og var preget av færre somatiske mutasjoner og kopi nummer endringer. I motsetning til dette ble det p53 pathway svekket i ST2, som er karakterisert ved tallrike somatiske mutasjoner og kopitall endringer. Genekspresjonsprofiler kombinert med analyser ved å bruke Gene Ontologi ressursen indikerer involveringen av spesifikke biologiske prosesser (mitose og DNA helicase) som er relevante for genomisk stabilitet og kreft etiologi. Spesielt viser vi tilstedeværelsen av en roman subtype av pasienter med HGSOC som er preget av et intakt p53 vei, med begrensede genomiske forandringer og spesifikke genuttrykk profiler
Citation. Hayano T, Yokota Y, Hosomichi K, Nakaoka H, Yoshihara K, Adachi S, et al. (2014) Molekylær karakterisering av en intakt p53 Pathway Undergruppe i High-Grade Serous eggstokkreft. PLoS ONE 9 (12): e114491. doi: 10,1371 /journal.pone.0114491
Redaktør: Michael Baudis, Universitetet i Zürich, Sveits institutt for Bioinformatikk, Sveits
mottatt: May 16, 2014; Godkjent: 10 november 2014; Publisert: 02.12.2014
Copyright: © 2014 Hayano et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. Den forfatterne bekrefter at for godkjente grunner, noen tilgangsbegrensninger gjelder datagrunnlaget funnene. Dataene inneholder opplysninger som kan identifisere og kan ikke gjøres tilgjengelig. En avidentifisert minimal datasettet er tilgjengelig på Figshare: https://dx.doi.org/10.6084/m9.figshare.1235612. Ytterligere data er tilgjengelig ved forespørsel til Prof. Ituro Inoue ([email protected])
Finansiering: Dette arbeidet ble støttet delvis av en Grant-in-Aid for Unge Forskere (B) (gi No . 23791816) fra Japan Society for Promotion of Science (https://www.jsps.go.jp/) (KY). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
De aldersjusterte priser ovarier og andre livmor øyets omgivelser kreft i 2002 var 10,6 per 100 000, og 5,2 per 100.000 årsverk i USA og Japan, henholdsvis [1]. Epitelial eggstokkreft er en heterogen enhet bestående av flere histologiske typer som høyverdig serøs, lavgradig serøs, klarcellet, endometrioid, og mucinkjertler kreft [2], [3]. Eggstokk-kreft er delt inn i type I og type II svulstene, [2], [4]; Type I svulster inkluderer lavgradig serøs, lavgradig endometrioid, klar celle, og mucinkjertler karsinomer. Disse tumorene dårlig svare på platinabasert terapi, havn en høy frekvens av mutasjoner i gener som koder for komponenter av RAS signalveien, og er relativt stabile i genomisk struktur. Type II svulster inkluderer høyverdig serøs og høyverdig endometrioid karsinomer og er svært aggressive. En storstilt studie av høyverdig serøs eggstokkreft (HGSOC) ved Kreft Genome Atlas (TCGA) gruppe preget HGSOC som
TP53
-mutation beriket (96%) med avvik av genom-wide somatiske genet kopi tall. Denne studien identifiserte ofte endret trasé som RB1, PI3K /RAS, HAKK, homolog rekombinasjon, og FOXM1 trasé [5]. Mutasjonen status for
TP53
er assosiert med etapper, genuttrykksmønster, og overlevelse av pasienter med serøs eggstokkreft [6].
Vi forsøkte å etablere et risikoklassifiseringssystem for serøs eggstokkreft kreft ved hjelp av genuttrykk profiler anskaffet ved hjelp av microarray data [7], [8]. Vi identifiserte 88 gener relatert til progresjon overlevelse i 110 japanske pasienter med fremskreden fase serøs eggstokkreft [7], så vel som 126 gener relatert til samlet overlevelse i 260 japanske pasienter med fremskreden fase HGSOC [8]. For å gi en bedre forståelse av de molekylære mekanismene som er involvert i patogenesen av disse kreftformene, og å utvikle et risikoklassifiseringssystem, gjennomførte vi profilering av de somatiske mutasjoner stede i disse svulstene.
Vi utarbeidet genomisk informasjon for pasienter med HGSOC bruker exome sekvensering og kopi nummer variasjon (CNV) analyser. Ifølge profilene til somatiske single nucleotide varianter (SNVs), små innsettinger og slettinger (indels), og CNVs, klassifisert vi HGSOC inn subtyper utpekt ST1 og ST2 som kjennetegnes ved intakte eller svekket p53 signalveier, henholdsvis. Vi karakterisert ytterligere to undertyper ved å sammenligne deres genekspresjonsprofiler. Gene ontologi (GO) analyse viste at differensielt uttrykte gener ble betydelig anriket i mitose og DNA helicase GO grupper som kan være involvert i genomisk ustabilitet og tumorigenesis av HGSOC. Disse funnene gir ny innsikt i de molekylære egenskaper og nye biologiske prosesser som bidrar til patogenesen av HGSOC, spesielt hos pasienter med en intakt p53 sti.
Materialer og metoder
Etikk uttalelse
de etiske komiteer fra Niigata University (IRB nr 239, 428 og 455) og National Institute of Genetics (IRB No. 23-11) godkjent studieprotokoller, og hver deltaker gitt skriftlig informert samtykke til uttak av prøver og senere analyser.
Kliniske prøver
Frisk frosset prøver ble innhentet fra primær tumorvev før administrering av kjemoterapi. To patologer vurdert de histologiske kjennetegn ved formalinfiksert og parafin-embedded hematoxylin og eosin seksjoner. Fordi klart histologisk karakterisering var en kritisk komponent i studien, ble en sentral patologisk gjennomgang utført av to uavhengige gynekologiske patologer (HT og TM) uten kjennskap til pasientens kliniske status. Histologiske typer og grad av histologisk differensiering ble bestemt i henhold til WHOs klassifisering av ovarietumorer og Silver klassifisering, henholdsvis [8]. Kliniske data (PT-og FIGO-stadium) er vist i tabell S1. Vi brukte perifert blod som det samsvar normalt vev.
Exome sekvense
Genomisk DNA ble isolert fra tumorvev ved hjelp av en fenol-kloroform-metoden og fra perifert blod ved hjelp av QIAamp DNA Blood Maxi-sett (QIAGEN ) [8]. Genomisk DNA ble hybridisert med atVelg Menneskelig All Exon Kits (Agilent) for å forberede sekvense biblioteker, og bibliotekene ble sekvensert ved hjelp av Illumina HiSeq 2000 (Illumina) med 90 eller 100 basis-paret endemoduler. Sekvens leser ble justert til en referanse genom (UCSC hg19) ved hjelp av BWA [9] og SAMtools [10]. Picard (https://picard.sourceforge.net) ble anvendt for å fjerne dupliserte leser. Lokal omstilling av lyder rundt kjente indels og kalibrering av basen kvalitet ble utført ved hjelp av GATK [11]. Den heuristiske somatisk mutasjon som ringer, VarScan 2 [12], ble brukt til somatisk mutasjon ringer. Terskel kriterier for detektering av somatiske mutasjoner var som følger: normal variant frekvens på 0% og Fishers eksakte test p-verdi av 0,00001. Funksjonell informasjon av somatiske mutasjoner ble kommentert ved hjelp ANNOVAR [13] og Oncotator (https://www.broadinstitute.org/oncotator/).
Prediksjon av funksjonelle konsekvenser av missense enkelt nukleotid varianter
funksjonelle effekter av de identifiserte somatiske missense mutasjoner ble evaluert ved å bruke MutationAssessor 2 [14], som forutsier effekt av aminosyresubstitusjoner i henhold til et mønster av evolusjonær konservering basert på flersekvenssammenstillinger av en proteinfamilie. Missense mutasjoner med en funksjonell innvirkning score (FIS) i 2.0 ble definert som skadelig
Påvisning av kreft driver gener
For å avdekke mulige kreft driver gener basert på de identifiserte somatiske mutasjoner, vi. brukte OncodriveFM [15], som evaluerer akkumulering av mutasjoner med høy funksjonell effekt innenfor et gen, forutsatt at kreft driver gener er svært muterte og utøve betydelige funksjonelle virkninger. Men konsekvensene av mutasjoner i passasjer genene er for det meste godartet. OncodriveFM stammer FIS fra MutationAssessor to å vurdere om muterte gener er sjåfører eller passasjerer.
Analyser av CNV og tumor renhet
enkeltnukleotidpolymorfi (SNP) array-eksperimenter med Genome-Wide Menneskelig SNP 6,0 (Affymetrix) ble tidligere gjennomført i 30 av 34 HGSOC prøver [8], [16]. På grunn av tekniske problemer og begrenset DNA mengder, kunne vi ikke få SNP array-data for gjenværende fire prøver. Affymetrix CEL filer fra SNP array-eksperimenter med 30 prøver ble behandlet ved hjelp av CNV deteksjon programvarepakken PennCNV [17]. CNVs ble kalt via et skjult Markov modell i henhold til beregninger av loggen R forholdet og B-allel frekvensverdier. Den CNV frekvens mellom tumor og normale prøver ble vurdert for hvert SNP ved hjelp av Fishers eksakte test i ParseCNV algoritmen [18]. Terskelkriterier for periodiske CNV regioner (CNVRs) var som følger: Fishers eksakte test p-verdi av 0,0005 og ingen overlapping med strukturelle variasjoner i prøver fra friske individer [19]. I tillegg ble CEL filene brukt til å anslå tumor renhet. Vi brukte ASCAT (Allele-Specific Kopier nummer Analyse av svulster) algoritme [20] i NEXUS kopiantallet programvareversjon 6.0 (BioDiscovery) [21] for å anslå omfanget av forurensninger av normale celler i kreftprøver. De MIAME-kompatible SNP array-data ble avsatt til Gene Expression Omnibus dataregister (tiltredelse antall GSE61237).
microarray eksperimenter og databehandling
Utvinning av RNA, Cy3 merking, microarray hybridisering signal skanning, og funksjonen ekstraksjon ble utført i tidligere studier [7], [8]. Data normalisering ble utført ved hjelp av GeneSpringGX11 (Agilent) innstilling av rå signal terskel på 1,0 og normalisering til 75
th persentil.
genekspresjonsanalyser
Betydningen av forskjeller i genuttrykk mellom de to undertyper ble evaluert ved hjelp av
t
-test. Etter evalueringen ble multippel testing korrigert av den falske funnraten (FDR) ved hjelp av Benjamini-Hochberg prosedyre [FDR (BH)]. Vi setter FDR (BH) til 0,1 som betydelig terskel. Disse analysene ble utført ved hjelp av ComparativeMarkerSelection modulen GenePattern [22].
GO analyse
GÅ analyse ble utført ved hjelp av Functional merknad Clustering verktøy inkludert i DAVID bioinformatikk ressursen [23]. Dette verktøyet vurderer likheten av merknader ord ved bruk kappa statistikk og tvinger grupper for å dele lignende merknads profiler ved hjelp av en uklar heuristisk multiple-linkage partisjon [24]. Innstillinger var som følger: åtte merknads kategorier (OMIM_Disease, COG_Ontology, SP_PIR_Keywords, GOterm_BP_FAT, GOterm_MF_FAT, BBID, BioCarta, og KEGG_Pathway), likhet sikt overlapping av ≧ 3, kappa statistikk terskel på 1, gruppe medlemskap i ≧ 3, og fuzzy flere -linkage skillevegg terskelen på 1, respektivt. Berikelse score ble beregnet ved hjelp av geometriske gjennomsnittet av den modifiserte Fishers eksakte test p-verdier (-log skala) for genet anrikning av hver GO sikt i hvert GO gruppe og en berikelse score på 1,3 anses betydelig [23]
.
data~~POS=TRUNC visualisering
Somatiske mutasjon data ble vist ved hjelp Gitools (versjon 1.8.4) [25]. Kopier nummer data ble vist ved hjelp av Genomics Viewer (IGV, versjon 2.3.25) [26]. Bee sverm og boksplott ble opprettet ved hjelp av beeswarm pakke i CRAN repository (https://cran.r-project.org/). Heat kartvisninger av genuttrykk data ble vist ved hjelp HeatMapViewer modul i GenePattern [22].
Resultater
Genomisk endring profilering
De somatiske mutasjoner identifisert i prøver ervervet fra 34 Japanese pasienter med HGSOC ble katalogisert i henhold til analysen av exome sekvenseringsdata. Den gjennomsnittlige lese- dybde var 91 × og 84 × for tumor og normale prøver, henholdsvis. Dekning av ≧ 10 × ble oppnådd for 89% og 88% av kodebaser av tumor og normale prøver, henholdsvis (tabell S2). Vi identifiserte 1,399 somatiske nonsynonymous (missense og tull) og spleisesete mutasjoner (41 mutasjoner per prøve) ved hjelp VarScan 2 [12] med de forhåndsdefinerte kriterier beskrevet i Materialer og metoder. Av disse somatiske varianter, ble 158 tilfeldig valgt og underkastet Sanger-sekvensering, og 143 varianter ble med hell validert (143/158, 91%). Alle
TP53
somatiske nonsynonymous og spleisesete mutasjoner ble kalt og validert ved hjelp VarScan 2 og Sanger-sekvensering, hhv. For ni pasienter uten
TP53
somatiske nonsynonymous og spleisesete mutasjoner, vi videre utført Sanger-sekvensering for alle de ti
TP53
koding eksoner fordi falsk negativ kan forventes på grunn av eksisterende lav dybde leser . Vi oppdaget en ramme-shift sletting på ekson 3 for S022 (tabell S3). Somatiske SNVs og indels ble kommentert i 1405 i 1,159 gener.
TP53
ble hyppigst muterte (76%, 26/34) (figur 1A), men mutasjonsfrekvensen var lavere enn tidligere rapporter [5], [27]. Det var 24 distinkt og mangfoldig
TP53
mutasjoner (tabell S4). To pasienter (S066 og S271) delte den samme missense variant (R273H) og de to andre pasienter (S009 og S017) delte den samme tullet variant (R196 *). Av de resterende 22
TP53
varianter, fem var frame-shift slettinger (A86fs for S020, P27fs for S022, F113fs for S119, S241fs for S006, og E286fs for S118), en var en tull variant (Sp.52 * for S015), to var spleisesete varianter (Y126splice for S188 og S261splice for S008), og de resterende 14 var missense (tabell S4). FIS for
TP53 15
missense varianter var 2,0 ifølge MutationAssessor 2 [14] analyse og ble betegnet som skadelig (tabell S4)
(A) Somatisk mutasjons landskapet av 34 pasienter. med HGSOC. Somatiske mutasjoner identifisert i mer enn eller lik tre pasienter er vist. Pasienter med mutasjoner av det samme gen er vist i rødt. (B) Kopier nummer endring landskapet av 30 pasienter med HGSOC. Kopier nummer (CN) endringer indikeres som følger: CN = 0, mørk blå; CN = 1, lyseblå; CN = 3, rosa; og CN ≧ 4, rød). Blå linje i Sletting spor og røde linjen i Amplification spor showet kopiantall endring frekvens. Grå linjer i slettingen og Amplification spor viser -Logg-transformert Fishers eksakte test p-verdiene av 0,0005.
Den andre hyppigst muterte gener var
BCLAF1
,
CLCNKA
, og
MAGEC1 plakater (29%, 10/34 for hvert gen). Ifølge FIS bestemmes ved hjelp MutationAssessor 2, alle mutasjoner unntatt K911fs av
BCLAF1
ble vurdert som godartet og ble ansett som passasjer mutasjoner. Ninety-to prosent (1063/1159) av genene ble mutert i en pasient. For ytterligere å utforske kandidat kreft driver gener mutert i minst to pasienter, ble OncodriveFM brukt som beskrevet i Materialer og metoder. Bare
TP53
ble oppdaget som en kreft driver gen med høy opphopning av skadelige mutasjoner i våre HGSOC prøver (data ikke vist).
CNV profilering for 30 av de 34 HGSOC prøvene er vist i figur 1B og File S1. De genomkopiantall på 30 HGSOC prøver ble endret. ParseCNV identifisert ni ganger slettet CNVRs (1p36.11, 4q24, 5q13.1, 5q13.2, 6q22.33-23.1, 15q24.2-24.3, 17q12, 18q21.31, og 22q12.3) og fire forsterket CNVRs (1p34 0,1 til 33, 3q27.2, 6p24.2, og 10p12.31-12.2) med identifiserte gener, henholdsvis (Bord S5 og S6).
Utelukkelse av p53 pathway synte pasienter fra nonmutated TP53 HGSOC
TP53
mutasjonsfrekvensen var betydelig lavere i våre prøver sammenlignet med de som er rapportert i tidligere studier som følger: 26/34 vs 301/316; Fishers eksakte test p-verdi på 0,0060 [5] og 26/34 vs. 118/126; Fishers eksakte test p-verdi på 0,0069 [27]. Blant de åtte prøvene med nonmutated
TP53 plakater (figur 2A), CNV analyse viste heterozygot kopi antall tap av
TP53
for prøve S004 (figur 2B). MDM2 er en E3 ubiquitin protein ligase som er rettet mot p53 for proteasomal nedbrytning og regnes som en negativ effektor av p53 [28]. Det er en sammenheng mellom forsterkning av
MDM2 Hotell og tap av p53-funksjon i visse svulster [27]. For de åtte prøvene med intakt
TP53
, nei
MDM2
kopiantall forsterkning ble observert (Figur 2A). For ytterligere å undersøke om en alternativ mekanisme står for p53 dysfunksjon, evaluert vi en liste over direkte p53 målgener (Tabell S7) hentet fra Pathway Interaksjon Database (PID) [29]. Vi identifiserte en
IRF5 plakater (Interferon Regulatory Factor 5) spleisesete mutasjon (W181splice) av prøven S018. Totalt har vi identifisert seks p53 pathway intakte pasienter fra de åtte pasientene med HGSOC med nonmutated
TP53 plakater (Figur 2A). Vi tildelt seks pasienter til ST1 og de resterende til ST2.
(A) Oppsummering av pasienter med
TP53
mutasjoner er vist i rosa i
TP53
_mut spor.
TP53
heterozygot kopitall slettinger er vist i blått i
TP53
_Del spor.
MDM2
kopiantall forsterkning vises i rødt i
MDM2
_amp spor. Mutasjoner i gener som er direkte mål av p53 er vist i grønt i p53_Target_mut sporet. (B) Dot tomt på log R ratio (LRR) av Chr17 for prøve S004. Blå prikker indikerer LRR verdier. Posisjonen til linjen av LRR = 0 er angitt som 0 på høyre side av hver graf.
TP53 plakater (17p13.1) er angitt med blå stjerne på den vertikale linjen.
Genomisk endringer i ST1 og ST2
Vi har ikke oppdager mutasjoner i gener som er spesifikke for lavgradig serøs type, for eksempel
BRAF
,
CTNNB1
,
KRAS
, og
PIK3CA product: [27], blant 1159 gener mutert i 34 HGSOC prøver (data ikke vist).
for å karakterforskjeller genomiske forandringer mellom ST1 og ST2, sammenlignet vi antall somatiske nonsynonymous og spleisesete mutasjoner og fant antall somatiske ST1 mutasjoner var signifikant lavere sammenlignet med ST2 (Wilcoxon rank sum test p-verdi på 0,00070) (Figur 3A).
(A) sammenligning av det antall av somatiske nonsynonymous og spleisesete mutasjoner. (B) Sammenligning av antall CNV segmenter (øvre panel) og CNV profiler (nederste panel) på kromosom 17 og 12 mellom ST1 og ST2. Kopi antall endringer er som følger: CN = 0, mørkt blå; CN = 1, lyseblå; CN = 3, rosa; og CN ≧ 4, rød). ST1 er omgitt av det grønne rektangelet. (C) Kreft renhet av ST1 og ST2.
I tillegg sammenlignet vi ST1 og ST2 med hensyn til antall CNV segmenter identifisert av PennCNV [17] i hvert autosomal kromosom (tabell S8). Resultatene av Wilcoxon rank sum test og multippel forsøks korrigering for 22 autosomal kromosomer i henhold til falsk oppdagelse hastighet (FDR) [30] viste signifikant færre CNV segmenter på kromosom 17 og 12 (FDR q verdi på 0,040 og 0,047, respektivt) for ST1 (Figur 3B). Disse resultatene indikerer at ST1 opprettholdt normal karyotype og ST2 næret genom-wide kopi nummer endringer spesielt anriket i kromosomene 17 og 12 (figur 3B).
For å utelukke at det lave antall mutasjoner og få CNV segmenter av ST1 var på grunn av en høy grad av forurensning med normale celler, ble svulsten renhet evaluert som beskrevet i Materialer og metoder. De gjennomsnittlige tumor renhet var 79% og 73% for henholdsvis ST1 og ST2, og det var ingen signifikant forskjell i tumor renhet mellom subtyper (Wilcoxon rank sum test p-verdi på 0,48) (figur 3C og tabell S9).
genekspresjonsanalyser til funksjonelt karakter ST1 og ST2
genuttrykket profiler av ST1 og ST2 ble bestemt ved hjelp av en mRNA microarray [7], [8]. Åtti-ni sonder som representerer 70 gener avdekket forskjeller i uttrykket nivåer mellom ST1 og ST2 på en FDR (BH) av 0,1 (Tabell S10 og S11). Uttrykket nivåer av 33 og 37 gener var høyere (tabell S10) og nedre (tabell S11), henholdsvis for ST1 sammenlignet med den for ST2. De 70 gener viste relativt homogene og heterogene uttrykk i ST1 og ST2, henholdsvis (figur 4)
Sytti gener (89 prober) som viser forskjeller på FDR (BH) av. 0,1 vises. ST1 er omgitt av det grønne rektangelet. Høy og lav indikerer uttrykk nivåer av ST1 sammenlignet med ST2.
For å evaluere de biologiske og funksjonelle konsekvenser av uttrykket av disse 70 genene, GO analyse ble brukt ved hjelp DAVID. Trettifem gener ble klassifisert i 18 GO grupper som deler lignende GO vilkår (Tabell S12). To av de 18 GO grupper (mitose og DNA helicase) viste signifikant berikelse av gener (Enrichment score på 1,3) (figur 5 og tabell S12).
NEK1 Hotell og
NEK9
i mitose gruppen ble oppregulert og
ASPM
,
BIRC5
,
CDCA2
, og
SKA3
ble nedregulert i ST1 sammenlignet med det i ST2.
BLM
,
PIF1
, og
RECQL4
, som koder for DNA heli, ble uttrykt ved relativt lave nivåer i ST1. Forskjeller i uttrykket av disse mitose og DNA helicase gener ble undersøkt ved hjelp av Kolmogorov-Smirnov test, F-test, og
t
-test med R versjon 3.0.2 (figur 6 og tabell S13).
Heat-kartvisning av genet ontologi (GO) grupper. To GO grupper (mitose og DNA helicase) med betydelig genet for selvrealisering er angitt som GO grupper 1 og 2, henholdsvis. ST1 er omgitt av det grønne rektangelet.
Bee sverm og boksplott viser genuttrykk mønster av ST1 og ST2 pasienter. Y-aksen viser normaliserte genuttrykk signaler behandles av GeneSpring. Stjerne (*) eller plusstegn (+) viser
t
-test p-verdiene som følger: * p 0,05, ** p 0,01, og ***
(+++) p 0,001.
Diskusjoner
analysene av somatiske mutasjoner av HGSOC viste anrikning av
TP53
mutasjoner (figur 1A). Den CNV Analysen viste en endret profil av genom-wide kopitall (figur 1B). Disse funnene er i tråd med de av en tidligere studie [5]. Men vi har oppdaget en signifikant forskjell i frekvens av
TP53
mutasjoner sammenlignet med det som er rapportert i tidligere rapporter [5], [27]. Spesielt gjorde åtte HGSOC prøvene ikke båtplass
TP53
mutasjoner, og mutasjon av en p53 target gen
IRF5
ble identifisert i en prøve. Videre hadde
TP53
kopiere nummer sletting. Til sammen tildelt vi seks HGSOC prøver som ST1 og de resterende 28 prøvene som ST2.
Alle pasienter med HGSOC i denne studien var japansk, mens pasienter i tidligere studier [5], [27] var hovedsakelig kommer fra europeisk underordnede populasjoner. Avviket fra
TP53
mutasjonsfrekvenser kan komme fra befolknings forskjeller som observeres i tilfelle av epidermal vekstfaktor reseptor (
EGFR
) mutasjoner for ikke-småcellet lungekreft [31], [ ,,,0],32].
EGFR
mutasjon priser var som følger: 11% og 32% i Vest-Europa og Øst-asiatiske pasienter, henholdsvis [31], og 2% og 26% av pasientene i USA og henholdsvis Japan, [32] . De lave antall pasienter i denne studien sammenlignet med de TCGA datasettet [5] kanskje ikke nok til å gi solid avslutning av
TP53
mutasjonsfrekvens. Tydeligvis, er mye større skala studie med japanske og andre asiatiske pasienter med HGSOC nødvendig. Den andre muligheten er at det finnes liten brøkdel av
TP53
muterte kreftceller på grunn av svulst heterogenitet i
TP53
nonmutated pasienter. Det er allment akseptert at somatiske driver mutasjoner som mutasjoner av
TP53
oppstår på et tidlig tilfelle av kreft da relativt høy frekvens av mutasjonen bør følges. I denne studien har vi faktisk observert minst 20% av tumor variant frekvenser for
TP53
. Derfor har vi antagelig ikke overse driver mutasjoner av
TP53
av exome sekvensering (figur 1).
De lave tall for somatiske mutasjoner og CNV segmenter observert i ST1 sannsynligvis gjenspeiler en funksjonelt intakt p53 sti. ST2 ble beriket for
TP53
mutasjoner, og genom-wide kopitall profiler var lik de Type II svulster. I kontrast,
TP53
ble nonmutated i ST1 og viste en normal karyotype lik som Type I svulster som foreslått i en tidligere gjennomgang [2]. Vi har imidlertid ikke påvise mutasjoner i gener som koder for komponenter av RAS signalveien i ST1 (data ikke vist). I den største datasettet fra TCGA [5], 15 av 316 prøver fra pasienter med HGSOC næret nonmutated
TP53
. Når vi søkte på
TP53
slettinger,
MDM2
forsterkning, eller p53 target-genmutasjoner i de 15 prøvene, bare én (TCGA-25-1328) ble klassifisert som ST1 (figur S1) . Hierarkisk clustering bruk av 45 overlappende gener blant de 70 differensielt uttrykte gener tildelt TCGA-25-1328 til ST1 (figur S1, nederst). Disse resultatene antyder at ST1 er en roman HGSOC subtype basert på mutasjon og CNV profiler.
For ytterligere å karakterisere de funksjonelle egenskaper ST1 og ST2, vi sammenlignet sine genuttrykk profiler (figur 4). Ved hjelp av en betydning terskel [FDR (BH) 0,1], identifiserte vi 70 gener som var homogent uttrykt i ST1 microarray og heterogent uttrykt i ST2 microarray (figur 4). Den heterogene genuttrykk av ST2 kan indikere spredning av molekylære undergrupper som sekundære hendelser som foreslått i vurderingen sitert ovenfor [2], og homogen genuttrykk av ST1 kan gjenspeile en tidlig tilfelle onkogenese før kromatin ustabilitet oppstår.
GO analyse identifiserte 18 GO grupper som deler høyt lignende biologiske betingelser, og to gruppene var signifikant anriket for gener som er involvert i mitose, og de som koder for DNA-helikaser (figurene 5 og 6). Defekter i mitose føre til unormale kromosomtall som er tilknyttet onkogenese [33]. To mitotiske gener som koder for kinaser NEK1 og NEK9 ble sterkt uttrykt i ST1, og oppregulering av disse kinaser er assosiert med genomisk stabilitet og tumorigenesis [34] – [37]. Videre andre mitotiske gener (
ASPM
,
BIRC5
,
CDCA2
, og
SKA3
) var sterkt uttrykt i ST2, og avvikende aktivering av ekspresjon av disse genene er forbundet med onkogenese [5], [38] – [42]
DNA-helikaser opprettholde genom stabilitet gjennom DNA-reparasjon, rekombinasjon, og replikasjon.. DNA heli, BML og RECQL4, er inaktivert i kreft utsatt genetiske lidelser som Bloom og Rothmund-Thomson syndrom [43], [44]. Oppregulering av DNA helicase uttrykk som vanligvis forekommer i flere kreftformer (f.eks blodkreft, prostata, og hepatocellulær) [43] – [48]. Forhøyede uttrykk av DNA helicase genene
BLM
,
PIF1
, og
RECQL4
som vanligvis observert i kreftformer kan forklare en gjenopprettingsfunksjon fra kromatin ustabilitet i ST2. I motsetning til dette, redusert ekspresjon av gener som koder for DNA-helikaser som preget ST1 indikerer at kromatin ustabilitet ikke forekommer i ST1. Videre undersøkelser er nødvendig for å avklare forholdet mellom uttrykket av disse genene og patogenesen av HGSOC.
Vi har ikke oppdage forskjeller i total eller progresjonsfri overlevelse av pasienter som klassifiseres som enten ST1 eller ST2 (figur S2). Alle prøver ble diagnostisert som høyverdig kreft av patologer, og prøvene klassifisert som ST1 ble retrospektivt undersøkt; men manglet de unike patologiske funksjoner. ST1 var preget av et intakt p53 vei; Men var det ingen forskjeller i pasientenes patologiske funn eller kliniske konsekvenser. Disse funnene tyder på tilstedeværelse av uidentifiserte biologiske prosesser som er involvert i ST1 fenotype, noe som indikerer at en mer effektiv behandling må utvikles for disse pasientene.
I sammendraget beskriver vi identifikasjon av en roman intakt p53 pathway subtype på japansk pasienter med HGSOC. Våre funn lover å øke vår forståelse av de molekylære mekanismene for onkogenese og skal legge til rette for utvikling av terapeutiske strategier som er rettet mot nonmutated
TP53
hos pasienter med HGSOC.
Hjelpemiddel Informasjon
Figur S1.
ST1 i TCGA data. (Øvre panel) Oppsummering av mutasjoner for
TP53 Kjøpe og p53 pathway gener for 15
TP53
nonmutated pasienter med HGSOC i TCGA data.
TP53
homozygot delesjon er vist i mørk blå og heterozygote kopi nummer slettinger er vist i lyseblått i
TP53
_Del spor.
MDM2
kopiantall forsterkning vises i rødt i
MDM2
_amp spor. Mutasjoner i gener som er direkte mål av p53 er vist i grønt i p53_Target_mut sporet. (Nedre panel) Hierarkisk clustering av TCGA-25-1328 og 33 HGSOC bruk av 45 overlappende gener blant de 70 differensielt uttrykte gener
doi:. 10,1371 /journal.pone.0114491.s001 product: (PDF)
Figur S2.
Survival analyse. (Venstre panel) Totalt overlevelseskurver for ST1 og ST2. (Høyre panel) progresjonsfri overlevelse kurver for ST1 og ST2. Disse overlevelseskurver ble avbildet ved hjelp av Kaplan-Meier-metoden. p-verdiene svarer til Logrank test sammenligne overlevelseskurver
doi:. 10,1371 /journal.pone.0114491.s002 product: (PDF)
Tabell S1.
kliniske data. PT-og Figo-etapper. To undergrupper (ST1 og ST2) er vist i Undergruppe kolonne
doi:. 10,1371 /journal.pone.0114491.s003 plakater (XLSX)
Tabell S2.
Dybde og dekning av exome sekvensering. Dybde og dekning ble beregnet ved hjelp av DepthOfCoverage modul av GATK
doi:. 10,1371 /journal.pone.0114491.s004 plakater (XLS)
tabell S3.
Dybde på koding eksoner av
TP53
Dybde ti koding eksoner av
TP53 plakater (NM_001126112.2) ble beregnet ved hjelp av SAMtools
doi:.. 10,1371 /journal.pone. 0114491.s005 product: (XLSX)
Tabell S4.
Somatiske
TP53
mutasjoner. Funksjonelle konsekvenser av missense single nucleotide varianter som ble vurdert ved hjelp av MutationAssessor 2 er vist i FIS kolonne
doi:. 10,1371 /journal.pone.0114491.s006 plakater (XLS)
Tabell S5.
Kopier nummer slettet regioner. Tilbakevendende kopi nummer slettet regionene er vist i CNVR (hg18) kolonne. Gene kolonnen viser gener som ligger i disse CNVRs
doi:. 10,1371 /journal.pone.0114491.s007 product: (PDF)
Tabell S6.
Kopier nummer forsterket regioner.
