Abstract
anti-kreft legemiddel camptothecin hemmer replikasjon og transkripsjon ved å fange DNA-topoisomerase I (Top1) kovalent til DNA i en «spaltbar kompleks». For å undersøke effekten av camptothecin på RNA syntese genom-wide vi brukte Bru-Seq og vise at camptothecin behandling primært berørte transkripsjon forlengelse. Vi har også observert at camptothecin økt RNA leser forbi transkripsjonsterminerings områder så vel som på forsterkerelementer. Etter fjerning av camptothecin, transkripsjon spredt som en bølge fra den 5′-ende av gener med ingen utvinning av transkripsjon fremgå av RNA polymeraser stoppet opp i kroppen av gener. Som et resultat av camptothecin fortrinnsvis hemmet ekspresjon av store gener som proto-onkogener, og anti-apoptotiske gener mens mindre ribosomale proteingener, pro-apoptotiske gener og p53 målgener viste relativ høyere ekspresjon. Cockayne syndrom gruppe B fibroblaster (CS-B), som er defekte i transkripsjon-koplede reparasjon (TCR), viste en RNA-syntese utvinning profil lik den normale fibroblaster som tyder på at TCR ikke er involvert i forbindelse med reparasjon av eller RNA-syntese utvinning fra transcription- blokkerer top1 lesjoner. Disse funnene av effektene av camptothecin på transkripsjon har viktige implikasjoner for sin anti-kreft aktiviteter og kan hjelpe i utformingen av bedre kombinatoriske behandlinger som involverer Top1 giftstoff.
Citation: Veloso A, Biewen B, Paulsen MT, Berg N, Carmo de Andrade Lima L, Prasad J et al. (2013) Genome-Wide Transkripsjon Effekter av Anti-Cancer Agent Camptothecin. PLoS ONE 8 (10): e78190. doi: 10,1371 /journal.pone.0078190
Redaktør: Didier Auboeuf, INSERM, Frankrike
mottatt: 5 juni 2013; Godkjent: 02.09.2013; Publisert: 23 oktober 2013
Copyright: © 2013 Veloso et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av midler fra National Institute of Environmental Sciences (1R21ES020946) og National human Genome Research Institute (1R01HG006786). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
DNA topoisomerase i (Top1) slapper torsjons- spenninger som genereres i DNA-heliks som en konsekvens av replikasjon, transkripsjon og kromatin remodellering [1,2]. Den Top1-medierte reaksjonen involverer kovalent binding til DNA, spalting av en kjede av DNA-heliksen, etterfulgt av passering av den andre strengen gjennom bruddet og til slutt det gjenforseglbare av DNA-tråden pause. Den anti-kreft legemiddel camptothecin hemmer spesifikt Top1 [3] ved å virke før den forsegles på nytt trinn, effektivt klem Top1 kovalent bundet til DNA i en «spaltbare komplekset.» Camptothecin og andre Top1 giftstoff anvendes for behandling av eggstokkreft, livmorhalsen, tykktarm, bukspyttkjertel, lunge, bryst, prostata og hjernen kreft [4]. Den anti-cancer aktiviteten til camptothecin er knyttet til replikasjon-formidlet toksisitet [5]. Den inhiberende virkning av camptothecin på transkripsjon er også blitt anerkjent å bidra til toksisitet i ikke-delende celler [6,7].
Vi har tidligere vist at camptothecin-stabilisert Top1-DNA komplekser forsinke forlengelse, men ikke initiering av transkripsjon [8]. Faktisk, observerte vi en økt belegg på RNA polymerase II i promoter-regionen i
DHFR
genet korrelere til en økt forekomst av initiering av transkripsjon [8]. Som svar på transkripsjon forlengelse blokkering, er Top1 målrettet for nedbrytning i en ubiquitin-avhengig måte [9] og etterfølgende gjenværende DNA-bundet aminosyrerester kan kreve virkningen av tyrosyl-DNA fosfodiesterase 1 (TDP1) for deres fjerning i rekkefølge for transkripsjon forlengelse for å fortsette [10]. Blokkering av transkripsjon maskineri ved Top1 komplekser fanget på DNA av camptothecin har vist seg å føre til induksjon av DNA-dobbeltstrengbrudd [6], og dannelsen av DNA-RNA-hybrid strukturer (R-løkker) aktivering stress-kinase-ATM [7 , 11]. Videre resulterer dette transkripsjon stress i aktivering av p53-responsen veien [12-15] og induksjon av 53BP1-mediert DNA-skade behandling [16]. Top2 og PARP1 spille overlappende roller å Top1 i ikke-delende celler som tyder på at kombinasjonen av Top1, top2 og PARP-targeting medikamenter kan være effektive i ikke-delende kreftceller [15].
Etter camptothecin reversering blir topoisomerase reaksjonen fullført og transkripsjons komplekser er tenkt å gjenoppta forlengelse. Interessant, vi tidligere observert at gjenvinningen av RNA-syntese fra
DHFR
-genet i CHO-celler etter fjerning av camptothecin gjenopptatt som en bølge i en 5′-3′-retning med ingen åpenbare bedring nedstrøms i genet [8] . Dette tyder på at transkripsjon komplekser blokkert av fangede Top1 komplekser er i stand til å gjenoppta forlengelse følgende camptothecin reversering [8]. Den Cockayne komplemente gruppe B protein (CSB) defekt i transkripsjon-koplede reparasjon (TCR) har blitt foreslått å være involvert i reparasjon av DNA kovalent-bundet Top1 [17]. Det ble foreslått at dette ble koblet til en tregere utvinning av total RNA syntese i CS-B-celler korrelere til en overfølsomhet for camptothecin eksponering [15,17,18]. Imidlertid har andre studier ikke funnet noen feil i RNA syntese restitusjon etter CSB knockdown [16].
For å analysere den direkte effekten av camptothecin på transkripsjon genome-wide og utforske transkripsjon restitusjon etter narkotika fjerning, vi brukte den nylig utviklede Bru-Seq metoden [19]. Denne teknikken er basert på den metabolske merking av RNA ved bruk av bromouridine (Bru) etterfulgt av spesifikk isolering av Bru-merkede begynnende RNA-bibliotek forberedelse og dyp-sekvensering [19]. Våre resultater viser at det Top1 inhibitoren camptothecin forårsaker en preferensiell inhibering av ekspresjon av store gener ved blokkering av transkripsjon forlengelse i kombinasjon med en mangel på utvinning av syntese fra RNA polymeraser blokkert i kroppen av genene. Videre fant vi ingen feil i RNA syntese utvinning i CS-B-celler etter camptothecin reversering, noe som tyder på at TCR ikke kan være nødvendig for restitusjon etter topo jeg hemming reversering.
Materialer og metoder
Cell linjer, camptothecin behandling og Bru-Seq
hTERT udødelig diploid menneske forhud fibroblaster (gave fra Dr. Mary Davis, Department of Radiation Oncology, University of Michigan) og CS-B-fibroblaster (GM00739, Coriell Cell Repository) var dyrket som monolag i MEM som følger med 10% føtalt bovint serum og antibiotika (Invitrogen). Cellene ble behandlet i 45 minutter med 20 uM camptothecin (Sigma) og merket i 15 minutter med 2 mM bromouridine enten under den siste 15 minutter av camptothecin behandling eller etter utvasking. De Bru-Seq og BruChase-Seq prosedyrer ble utført som tidligere beskrevet [19]. Kort sagt, ble totalt RNA isolert fra celleprøver ved bruk av TRIzol reagens (Invitrogen), etterfulgt av spesifikk isolering av Bru-merket RNA ved anvendelse av anti-BrdU-antistoff (BD Biosciences) konjugert til magnetiske kuler (Dynabeads, geit anti-mus IgG, Invitrogen) . Det isolerte RNA ble deretter omdannet til en tråd-spesifikke DNA-bibliotek ved bruk av Illumina TruSeq Kit (Illumina) som tidligere beskrevet [19].
Illumina Hi-Seq sekvensering og dataanalyse
Sekvensering av cDNA bibliotekene ble utført av personalet ved University of Michigan Sekvensekjerne hjelp av Illumina HiSeq 2000 sequencer. Base kall ble utført ved hjelp av Illumina casava v1.8.2. og lese kartlegging ble utført ved anvendelse av Hat, bare å akseptere lesninger som kunne kartlegges entydig til genomet. Vi beregnet RPKM verdier fra Bru-Seq data og plottet data ved hjelp av en spesialbygd nettleser som tidligere beskrevet [19].
Data tilgjengelighet
Den primære data som brukes i analysene er deponert på NCBI Gene Expression Omnibus og er fritt tilgjengelig. Vi har lastet opp de opprinnelige genom kartlegging BAM filene og avledet syntese listene som seng filer. Sjonsnummer er GSE48678 og hele koblingen er https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE48678.
Resultater
Camptothecin fortrinnsvis hemmer RNA syntese av store gener
Vi utfordret humane fibroblaster i 45 min med 20 mikrometer camptothecin og merket RNA med 2 mM Bru for siste 15 min i nærvær av camptothecin. Den sekvense leser fra den gryende Bru inneholder RNA kartlagt gjennom gener som dekker både eksoner og introner og relative priser av transkripsjon ble bestemt for alle gener ved å summere opp antall leser gjennom genene, og dele det med lengden av genet. Lese tetthet ble uttrykt som «leser per tusen basepar per million leser» (RPKM). Eksempel på statistikk kan finnes i tabell S1. Kamptotecin behandling hemmet transkripsjonshastigheter på 1142 gener med mer enn 2-ganger og samtidig øke transkripsjon av gener 919 med mer enn 2 ganger (Figurene 1 A og B, fig S1, S2 i File S1 og S2 tabell). Enten genene funnet å ha økt relativ forekomst av transkripsjon er virkelig blir syntetisert på et absolutt høyere rente er ikke bestemt, siden data generert fra Bru-Seq representerer fordelingen av lyder enn absolutte uttrykk verdier. Derfor, når syntesen er redusert i legemet av store gener, leser sekvensering må samle et annet sted (dvs i små gener og ved begynnelsen av store gener).
Menneskelige fibroblaster ble behandlet med 20 uM camptothecin i 45 min med 2 mM Bru lagt i løpet av de siste 15 min av camptothecin behandling å merke begynnende RNA etterfulgt av Bru-sekv. (A), lange gener, for eksempel
TRIO
, utstillings forlengelse feil, men ikke transkripsjonsstart, etter camptothecin behandling. (B), Short gener, for eksempel
Bambi
, viser en relativ økning av RNA-syntese etter camptothecin behandling. (C) Effekt av camptothecin på relativ transkripsjon som en funksjon av genet størrelse. Forhold av Bru-sekv signal av individuelle gener i camptothecin-behandlede enn kontrollcellene som funksjon av genet størrelse. Lengre gener er hemmet fortrinnsvis over kortere gener. (D), Median lengde av gener indusert 2 ganger ved camptothecin (919 gener) er 8927 bp, mens genene nedregulert 2 ganger (1145 gener) har en median lengde på 136 355 bp. Genet kartene er fra RefSeq Genes (UCSC genom nettleser).
Dataene viser en tydelig negativ korrelasjon mellom lese intensitet og genet størrelse etter camptothecin behandling (figur 1C). Den midlere størrelse av de gener med mer enn en to ganger nedsatt relative transkripsjonsprisene var 107 089 bp. (Figur 1D). Median genomisk størrelse på 919 gener som viser økte relative transkripsjonspriser følgende camptothecin behandling var 7748 bp. Disse funn er i overensstemmelse med en virkningsmekanisme hvorved camptothecin hemmer transkripsjon forlengelsen uten å inhibere transkripsjonsstart [8].
Camptothecin påvirker transkripsjon oppsigelse og uttrykk for ncRNA og forsterker RNA (Erna)
For mange korte gener der ingen hemming av forlengelse var tydelig følgende camptothecin behandling, transkripsjon gjennomlesning forbi den kommenterte 3 « poly (A) stedet var fremtredende (figur 2A, Figur S3 i File S1). Disse dataene understøtter en rolle for topoisomerase I i transkripsjonsterminerings i disse genene [20]. Alternativt leser det økte antallet utover kommenterte terminerings nettstedene kan skyldes induksjon av alternative poly (A) nettsteder følgende camptothecin behandling eller stabilisering av RNA forbi 3»-cleavage stedet. Mange gener i pattedyrceller har vist seg å generere divergerende promoter oppstrøms transkripsjoner (ber) [19,21]. Uttrykket av noen ber ble dramatisk forbedret ved camptothecin behandling (figur 2B, Figur S4 A-C i File S1). Videre er mange divergently transkriberte gener viste koordinatsystem initiering forbedring, noe som tyder på at den negative superhelisitet forventes å akkumulere i kjølvannet av transkripsjon i fravær av topoisomerase I-aktivitet kan forsterke transkripsjon initiering (figur S4 D-F). Til slutt, kamptotecin behandling fører til produksjon av mer enhancer RNA (Erna) fra mange kjente og antatte forsterkerelementer, som for eksempel den 5 «
FOS
forsterker (figur 2C, Fig S5 i File S1). Den funksjonelle konsekvens av forbedret generasjon av Erna følgende camptothecin behandling er ikke klart siden den relative transkripsjonshastigheten av
FOS
gen ikke ble hevet til tross for økningen i Erna generasjon. I tillegg til å hemme forlengelse av proteinkodende gener, camptothecin hemmet transkripsjon forlengelse av primær mikroRNA transkripsjoner (figur 2D) og forbedrede eller undertrykt lange ikke-kodende RNA (lncRNAs) (figur 2E F).
Som i Figur 1, ble humane fibroblaster behandlet med 20 uM camptothecin i 45 minutter med 2 mM Bru tilsatt i løpet av de siste 15 minutter av camptothecin behandling for å merke begynnende RNA, etterfulgt av Bru-sekv. (A), transkripsjonen gjennomlesning av avviklingen området av
RHOB
gen indusert av camptothecin. (B), Enhanced initiering av
ASCC3
genet og sammenfallende oppregulering av divergerende oppstrøms PROMPT RNA. (C), Enhanced uttrykk for Erna fra 5′-oppstrøms Enhancer av
FOS
av camptothecin. (D), hemmer Camptothecin transkripsjonen av det primære transkript av miRNA138-1. (E), induserer Camptothecin transkripsjon av ncRNA MALAT1. (F), hemmer Camptothecin transkripsjon av en svært lang Umerket ncRNA på kromosom 2. gen kartene er fra RefSeq Genes (UCSC genom nettleser).
transkripsjon gjen som en bølge fra 5 «enden følgende camptothecin fjerning
fangst av topoisomerase på DNA av camptothecin er tenkt å være en delvis reversible hendelse [2]. For å undersøke om fjerning av camptothecin reverserer dens effekter på transkripsjon, brukte vi Bru-Seq å undersøke den gryende RNA transkriptomet i celler etter narkotika utvasking. For å få et samlet bilde av virkningen av camptothecin på begynnende RNA-syntese av multiple gener, velges vi høyt uttrykte gener (RPKM større enn 1), og mer enn 100 kb og justert dem av deres transkripsjonsstartsetene. Vi fant ut at camptothecin indusert et sterkt signal over kontrollen i løpet av de første 10 kb av gener etterfulgt av en kraftig nedgang i signal under kontroll lenger ned (figur 3A). Disse resultatene antyder at hemmingen og oppfanging av topoisomerase I ved camptothecin ikke inhiberer initiering av transkripsjon, men sterkt hemmer forlengelse. Når camptothecin ble vasket ut, og cellene ble merket med bromouridine i 15 minutter i fravær av medikamentet, for gjenoppretting av transkripsjon spredt fra 5′-enden i genet mens ingen bedring av signal ble observert videre nedstrøms i genet. Etter utvasking av medikamentet og inkubering i 15 minutter i legemiddelfritt medium og deretter merking av begynnende RNA for de følgende 15 minutter, beveget transkripsjons bølge videre inn i genet i 3′-retningen. Igjen ble ingen bedring av signal observert videre nedstrøms inn i genet. Interessant, den hastighet med hvilken transkripsjon bølge som brer seg fra den 5′-ende og inn i legemet av genene var ca. 1.1 til 1.3 kb /min (Figur 3, Figur S6 i File S1). Dette er lavere enn den estimerte forlengelsen hastighet på omkring 2 kb /min i celler under normale betingelser [22]. Hvis forlengelse RNA polymeraser kolliderer med fanget topoisomeraser, kan irreversible DNA-skade indusert som ville kreve ytterligere behandling [6]. Det er mulig at dette redusert tøyelighet hastighet observert etter camptothecin behandling og utvasking skyldes et krav for en Top1 /camptothecin-indusert DNA skade reparasjon skal skje før forlengelse kan fortsette.
(A), Aggregate visning av RNA syntese av gener som er større enn 100 kb i normale humane fibroblaster med genene justert av transkripsjonsstartsider (TSS). RNA-syntese gjenoppretter som en bølge i en 5′-til-3′-retningen etter camptothecin fjerning med tilsynelatende uten gjenvinning av RNA polymeraser stoppet opp i kroppen av genene. Forlengelse priser av utvinne transkripsjon bølgen ble anslått til å være ~ 1,2 kb /min. (B), kan Bølge av utvinning av RNA syntese sees marsj fra 5′-enden av
CD44
genet uten tilsynelatende bedring i kroppen av genet. Fronten av transkripsjon bølgen utvidet noen 35 kb i løpet av første 30 min utvinning resulterer i en forlengelse hastighet på ca 1,2 kb /min. (C) Lignende forlengelse priser etter camptothecin fjerning ble funnet for
MEISE1
genet. Color nøkkel:
Blå
, kontroll (30 min Bru merking);
Yellow
, Bru merking i løpet av de siste 15 min av en 45 min camptothecin behandling;
Grønn
, 45 min camptothecin behandling etterfulgt av et medikament utvasking og 15 min fra Bru merking;
Red
, 45 min camptothecin behandling etterfulgt av et medikament utvasking, 15 min inkubasjon, og til slutt 15 min Bru merking.
Ingen åpenbare feil i utvinningen av RNA syntese i CS- B-celler følgende camptothecin reversering
celler avledet fra Cockayne syndrom pasienter er overfølsomme for camptothecin [18]. Dette overfølsomhet er knyttet til en forbedret induksjon av dobbelttrådbrudd i S-fase som replikering gafler «kolliderer» med innestengte Top1 komplekser [18]. Noen studier har også vist at utvinning av RNA-syntese er tregere i CS celler [15,17,18] mens andre studier har funnet noen feil i RNA syntese utvinning [16]. Ved hjelp av Bru-Seq vi testet om utvinning av begynnende RNA syntese i CS-B fibroblaster etter camptothecin behandling og reversering skilte seg fra oppgangen i normale humane fibroblaster. Analyse av den samlede transkripsjon av gener signal på minst 100 kb eller lengre viste at CS-B-celler utvunnet RNA-syntese i en bølge fra den 5′-ende av disse genene i en lignende måte som de normale fibroblaster (figur 4A). Dette var også tydelig for de enkelte gener (Figur 4B C, figur S7 i File S1). I tillegg ingen utvinning av transkripsjon skjedde innenfor likene av de genene som tyder på at blokkerte RNA polymeraser ikke er i stand til å gjenoppta forlengelse følgende camptothecin fjerning. Den tilsynelatende normale gjenvinning av RNA-syntese i disse CS-B-celler var i skarp kontrast til den defekte utvinning av begynnende RNA-syntese i disse cellene etter UV-bestråling (upubliserte data).
(A), Aggregate riss av RNA syntese av gener som er større enn 100 kb i CS-B-celler med gener stilt opp ved transkripsjonsstartsider (TSS) som i Figur 3. Forlengelse priser av utvinne transkripsjon bølgen ble anslått til å være ~ 1,0-1,3 kb /min. Individuelle gener i fibroblaster fra en CS-B individ som viser lignende utvinningsgraden som i fibroblaster fra en normal person for (B),
CD44 Hotell og (C)
MEIS1
. Color nøkkel som i figur 3.
Camptothecin berørte kreft-relevant genekspresjon
Performing DAVID genet berikelse analyse fant vi at camptothecin-indusert gener som koder for elementer av ribosom, mitokondrie og p53 og apoptose signalveier var sterkt representert (Figur 5, Bord S2-4). Settet av gener ble funnet å bli inhibert kort tid etter at camptothecin behandling ble anriket for fosfoproteiner, proto-onkogener, og gener som er involvert i den mitotiske cellesyklus, ubiquitin konjugering og anti-apoptose. Noen representative store proto-onkogener inhiberes av camptothecin er vist i figur 6A. Det er blitt vist at blokkering av transkripsjon forlengelse av camptothecin utløser en stressrespons som fører til rask akkumulering av p53 ledsaget av fosforylering av Ser15 området og acetylering av den Lys382 området [12]. Til støtte for camptothecin indusere en p53 respons i humane fibroblaster, fant vi at camptothecin indusert gener i p53 signalveien, inkludert
CDKN1A plakater (p21),
MDM2, BTG2 Hotell og
FAS product: (Figur 6B). Noen av disse genene ble indusert allerede under camptothecin behandling mens noen gener, som CDKN1A og MDM2, viste indusert uttrykk bare etter reversering av medikamentell behandling. Kamptotecin redusert de relative transkripsjons forekomst av store anti-apoptotiske gener og ekspresjon av et sett av mindre størrelse pro-apoptotiske gener (figur 6C). Pro-apoptotiske gener er generelt mer kompakt sammenlignet med anti-apoptotiske gener [23], og dermed midler fortrinnsvis reduserer ekspresjon av store gener ved å blokkere transkripsjon forlengelse er forventet å forskyve balansen av genekspresjon i favør av apoptose. Lignende mønstre av økt og redusert relativ genekspresjon følgende camptothecin behandling og tilbakeføring ble funnet for CS-B-celler (figur S8 i File S1). Det var imidlertid noen forskjeller mellom normale humane fibroblaster og CS-B-celler ble observert som en mangel på redusert
GLI2
uttrykk og ingen induksjon av p53-regulerte gener
DUSP5
,
FAS
,
MDM2 Hotell og
TRIM22
i CS-B-celler
.
(A) Pathways representert ved gener opp- regulert på minst to ganger, og (B) nedregulert på minst 2-ganger etter camptothecin behandling og gjenvinning. Humane fibroblaster ble behandlet med 20 uM camptothecin i 45 minutter og inkubert i de siste 15 minutter med 2 mM Bru ( «0 min»), inkubert i 15 min med Bru etter fjerning av camptothecin ( «15 min») og inkuberes i 15 min med Bru etter en 45 min behandling, en vask og en 15 min recovery ( «30 min»). Berikelse analyse ble utført ved hjelp av DAVID (david.abcc.ncifcrf.gov) og tallene som vises representerer p-verdier for berikelse.
(A), Eksempler på store proto-onkogener hemmet av camptothecin og viser ingen bedring (eller langsom bedring) etter narkotika fjerning. (B) Eksempler på p53 målgener indusert etter camptothecin behandling. (C), Eksempler på store anti-apoptotiske gener som viser redusert relativ transkripsjon (til venstre) og eksempler på små pro-apoptotiske gener som viser forbedret i forhold transkripsjon følgende camptothecin behandling (til høyre). (D), Model av mekanismer som camptothecin indusere celledød eller hemmer cellevekst. Camptothecin utløser en p53 transkripsjonen respons og selektivt hemmer stor proto-onkogener og overlevelsesgener. Dataene er fargekodet hvor blå representerer kontroll (C), gul representerer 15 min Bru-merking i enden av en 45 min camptothecin behandling med ingen utvinning ( «0 min»), representerer grønn medikament utvasking og 15 min Bru-merking umiddelbart etter utvasking ( «15 min») og til slutt rødt representerer merking 15-30 minutter etter utvasking ( «30 min»).
Diskusjoner
Camptothecin og dets derivater er FDA godkjent anti -cancer legemidler som brukes til å behandle en rekke svulster [4]. De virker ved å fange topoisomerase komplekser på DNA snarere enn hemme enzymatisk funksjon, siden RNAi knockdown av Top1 ikke reduserer celle overlevelse i samme grad som camptothecin behandling [4,24]. I denne studien vi brukte Bru-Seq for å utforske de akutte virkninger av camptothecin på ulike aspekter av transkripsjon og fant at camptothecin (i) hemmet forlengelse av transkripsjon, (ii) stimulerte transkripsjonen gjennomlesning forbi 3′-enden av små gener , (iii) ekspresjon av Erna fra visse forsterkerelementer (iv) indusert p53-responsen og (v) forskjøvet balansen av ekspresjon av apoptose-regulatoriske gener i favør av apoptose. Viktigere, transkripsjon utvinnes med en redusert forlengelse hastighet som en bølge fra den 5′-enden av genet uten noen tilsynelatende bedring av syntesen av RNA polymeraser blokkert i kroppen av genene. Vi fant ingen bevis på at gjenvinning av RNA-syntese var forskjellig i CS-B-fibroblaster som er i skarp kontrast til gjenvinning av RNA-syntese i disse cellene etter UV-lys (upubliserte data). Således er de mekanismer som er ansvarlig for gjenvinning av RNA-syntese følgende camptothecin fjerning er fundamentalt forskjellig fra de som kreves etter UV-bestråling som tyder på at transkripsjonen koplet reparasjon har ingen større rolle i den gjenstart av transkripsjon følgende camptothecin fjerning. Det er derfor tenkelig at den observerte hypersensitivitet av CS-B-celler til camptothecin er knyttet til noen rolle av CSB-proteinet under utvinning av replikering heller at ved utvinning av transkripsjon [18].
manglende evne av celler til restart transkripsjon fra inne i legemet av gener tyder på at blokkerte RNA polymeraser blir forkastet snarere enn resirkuleres. Dette vil fortrinnsvis satt tilbake ekspresjon av store gener selv etter en begrenset eksponering av celler til camptothecin. Interessant nok mange proto-onkogener og anti-apoptotiske gener som tilhører klassen av genene fortrinnsvis inhiberes av camptothecin. Modellen som fremkommer er at forgiftning av Top1 av camptothecin resulterer i hemming av store proto-onkogener, forsterket ekspresjon av små pro-apoptotiske gener og aktivering av p53-reaksjonsveien (figur 6D). Kunnskap om størrelsen på onkogener som driver karsinogenese og er viktige for overlevelse av kreftceller i en gitt tumor kan anvendes for å velge pasienter som spesifikt ville ha nytte av camptothecin behandling og for å kombinere rasjonelt camptothecin med andre behandlingsmetoder. For eksempel, ble ekspresjon av store BRCA1-assosierte RING domain protein 1-genet (BARD1) redusert med camptothecin. En slik undertrykkelse ville forventes å undertrykke homolog rekombinasjon og således bør føre til økt mottakelighet for PARP-inhibitorer eller strålebehandling. Faktisk har det blitt vist at kombinasjon av camptothecin med PARP-inhibitorer eller strålebehandling forbedrer tumorkontroll [4,25-27].
Hjelpemiddel Informasjon
Fil S1.
Støtte Tall.
Figur S1. Store gener hemmet av camptothecin. (A),
SULF1
, (B),
NAV2
, (C),
SH3BP4
, (D),
KCNN2
, (E ),
PLCB4 Hotell og (F),
TLE4
gener viser hemming av transkripsjon forlengelse etter en 45 min behandling på 20 mikrometer camptothecin. Menneske fibroblast celler ble inkubert med 2 mM Bru i løpet av de siste 15 min av camptothecin behandling å merke begynnende RNA etterfulgt av Bru-sekv. Genet kartene er fra RefSeq Genes (UCSC genom nettleser). Figur S2. Eksempler på små gener som viser relative høyere transkripsjon leser følgende camptothecin behandling. (A),
RGS2
, (B),
HSPB3
, (C),
FUS
, (D),
TSPYL2
, (E ),
CHCHD7 Hotell og (F),
TP53
representerer gener som er oppregulert etter en 45 min behandling med 20 mikrometer camptothecin. Menneske fibroblast celler ble inkubert med 2 mM Bru i løpet av de siste 15 min av camptothecin behandling å merke begynnende RNA etterfulgt av Bru-sekv. Genet kartene er fra RefSeq Genes (UCSC genom nettleser). Figur S3. Økt transkripsjonen gjennomlesning forbi 3′-enden av korte gener. (A),
FZD7
, (B),
MYC
, (C),
CYR61
, (D),
DKK1
, (E ),
SSTR1- Hotell og (F),
IER5
. Humane fibroblast-celler ble behandlet med 20 uM camptothecin i 45 min, og inkubert med 2 mM Bru i løpet av den siste 15 minutter av camptothecin behandling for å merke begynnende RNA, etterfulgt av Bru-sekv. Genet kartene er fra RefSeq Genes (UCSC genom nettleser). Figur S4. Effekt av camptothecin på avvikende oppstrøms transkripsjon. Camptothecin induserer divergerende oppstrøms promoter transkripsjon ved (A),
CEP78
, (B),
FER Hotell og (C),
RAB33B
gener og øker divergerende gentranskripsjon for (D),
PLAG1 Hotell og
CHCHD7
, (E),
CCDC58 Hotell og
FAM162A Hotell og (F),
IMMP1L
og
ELP4
gener. Humane fibroblast-celler ble behandlet med 20 uM camptothecin i 45 min, og inkubert med 2 mM Bru i løpet av den siste 15 minutter av camptothecin behandling for å merke begynnende RNA, etterfulgt av Bru-sekv. Genet kartene er fra RefSeq Genes (UCSC genom nettleser). Figur S5. Effekt av camptothecin på mulige forbedrings definert som områder med høy H3K4m1 og H3K27ac mens lav H3K4m3 histonmodifikasjonene. Humane fibroblast-celler ble behandlet med 20 uM camptothecin i 45 min, og inkubert med 2 mM Bru i løpet av den siste 15 minutter av camptothecin behandling for å merke begynnende RNA, etterfulgt av Bru-sekv. Genet kart, histon mark og DNase overfølsomhets sporene er fra kode og RefSeq Genes (UCSC genom nettleser). Figur S6. Effekt av camptothecin reversering på RNA-syntese i normale humane fibroblaster. Gjenvinning av RNA-syntese er observert som en bølge i en 5 «til 3» retning etter camptothecin fjerning med tilsynelatende uten gjenvinning av RNA polymeraser fast i legemet av genene for (A)
Top1
, (B)
SMAD3 Hotell og (C)
TLE4
gener. Color nøkkel:
Blå
leser transkripsjon i kontrollceller;
Yellow
, leser transkripsjon fra celler merket med Bru i løpet av de siste 15 min av en 45 min behandling med camptothecin;
Grønn
, transkripsjon leser fra celler merket i 15 min med Bru etter en utvaskings av camptothecin etter en 45 min behandling;
Red
, leser transkripsjon fra celler merket med Bru 15 minutter etter narkotika utvasking etter en 45 min behandling. Figur S7. Effekt av camptothecin reversering på RNA-syntese i CS-B fibroblaster. Gjenvinning av RNA-syntese er observert som en bølge i en 5 «til 3» retning etter camptothecin fjerning med tilsynelatende uten gjenvinning av RNA polymeraser fast i legemet av genene for (A)
Top1
, (B)
SMAD3 Hotell og (C)
TLE4
gener. Color nøkkel:
Blå
leser transkripsjon i kontrollceller;
Yellow
, leser transkripsjon fra celler merket med Bru i løpet av de siste 15 min av en 45 min behandling med camptothecin;
Grønn
, transkripsjon leser fra celler merket i 15 min med Bru etter en utvaskings av camptothecin etter en 45 min behandling;
Red
, leser transkripsjon fra celler merket med Bru 15 minutter etter narkotika utvasking etter en 45 min behandling. Figur S8. Effekt av camptothecin på ekspresjonen av gener som er vist i figur 7 i CS-B-celler. (A), store proto-onkogener hemmet av camptothecin og viser ingen /langsom bedring etter narkotika fjerning.
GLI2
genet var upåvirket av camptothecin behandling i CS-B-celler. (B), p53 målgener der bare noen ble indusert i CS-B-celler etter camptothecin behandling. (C), eksempler på store anti-apoptotiske gener som viser redusert relativ transkripsjon (leftt) og eksempler på små pro-apoptotiske gener som viser forbedret relativ transkripsjon i CS-B-celler etter behandling camptothecin (til høyre).
