Abstract
E-cadherin er ofte tapt under epitel-mesenchymale overgang og progresjon av epitel tumorigenesis. Vi har funnet en markør av epitelial-mesenchymale overgang, CD44, oppreguleres som respons på funksjonell tap av E-cadherin i esophageal cellelinjer og kreft. Tap av E-cadherin uttrykk korrelerer med økt uttrykk av CD44 standard isoform. Ved hjelp av en organotypiske rekonstruere modell, viser vi økt CD44 uttrykk i områder av celle invasjon er assosiert med MMP-9 i forkant. Videre activin A øker celle invasjon gjennom CD44 oppregulering etter E-cadherin tap. Til sammen våre resultater gir funksjonell bevis for CD44 oppregulering i spiserørskreft invasjon
Citation. Le Bras GF, Allison GL, Richards NF, Ansari SS, Washington MK, andl CD (2011) CD44 Oppregulering i E- cadherin-Negative Esophageal kreft Resultater i Cell Invasion. PLoS ONE 6 (11): e27063. doi: 10,1371 /journal.pone.0027063
Redaktør: Adam I. Marcus, Emory University, USA
mottatt: 29 juli 2011; Godkjent: 10 oktober 2011; Publisert: 01.11.2011
Copyright: © 2011 Le Bras et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. CDA er mottakeren av en stipendiat Award fra den amerikanske gastroenterologisk Association (AGA) /Foundation for Fordøyelsen Helse og ernæring (FDHN) og støttet av National Institutes of Health (DK075379). Vi ønsker å takke immunohistologi kjernen og translasjonell Kjerne ved Vanderbilt University for seksjonering og IHC stainings, og andre kjernefasiliteter støttes gjennom fordøyelses Disease Research Center (P30-DK058404) og Vanderbilt Ingram Cancer Center Support Grant (P30-CA068485). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
CD44, eller indisk blod-gruppe, er et transmembran-glykoprotein og en reseptor for hyaluronsyre (HA), en viktig komponent av den ekstracellulære matriks [1]. CD44 spiller en viktig rolle i vev integritet og er involvert i flere funksjoner assosiert med cancer progresjon slik som cellevandring [2], resistens mot apoptose [3] og presentasjon av vekstfaktorer og proteaser [4], [5]. I tillegg har CD44 blitt identifisert som en spesifikk markør for kreft stamceller [6], [7] og av tumorceller som gjennomgår en epitelial-mesenkymale overgang (EMT) -lignende prosessen [8]. Ulike isoformer er oversatt på grunn av alternativ spleising av eksoner 6-15 [9]. Standarden form av CD44 (CD44s) antas å være allestedsnærværende uttrykt, mens noen variantformer, CD44v, har vært forbundet med spredning [10].
Et stort skritt for EMT er tap av E-cadherin. E-cadherin er en viktig del av adherens veikryss og formidler celle adhesjon ved å samhandle med cytoplasmatiske proteiner p-catenin [11] og P120 [12]. Adherens kryss er koblet til aktin cytoskjelettet gjennom cytoplasmatiske linkere som α-catenin [13]. E-cadherin kan transcriptionally trykt gjennom Snail1, Snail2, Twist, Zeb1 og Zeb2, som kan reguleres ved TGFB [14]. Stimulering av brystkreftceller med TGFp resulterer i ko-lokalisering av matriksmetalloproteinase MT1-MMP og CD44 på cellemembran og induserer CD44 spalting resulterer i høye nivåer av oppløselig CD44 [15]. Omvendt, modulerer interaksjonen mellom CD44 og hyaluronan receptor TGFfi trafikk, noe som kan regulere TGFp signalering [16].
I EMT, epitelceller uttrykke markører slik som CD44, som er kjent for å bli uttrykt i cancer stamceller [ ,,,0],8]. Aktivin A har vist seg å være en viktig regulator av stemness [17]. Aktivin A, et medlem av superfamilien TGFfi, har også blitt beskrevet for å påvirke utvikling, hematopoiese og tumorigenesis [18] – [24]. Vi ønsket derfor å finne ut om activin En induserer EMT i esophageal celler og dermed forbinder induksjon av celle invasjon til activin A og CD44 uttrykk.
Vi har tidligere vist koordinert tap av E-cadherin og TGFB-reseptor II (TGFβRII) i spiserørskreft [25]. Andre rapporter har indikert betydningen av CD44 i esophageal plateepitel karsinom demonstrere en høyere uttrykk av CD44v6 [26], [27], men dens innvirkning på tumorinvasjon fortsatt kontroversielt. Derfor ønsket vi å studere CD44 uttrykk i esophageal plateepiteldysplasi
in vivo Hotell og
in vitro
. I denne studien viser vi at CD44 oppregulering er forbundet med E-cadherin tap i grunnskolen esophageal tumorvev og kreft cellelinjer. Funksjonelt, viser vi at aktivin En signalering i fravær av E-cadherin kan oppregulere CD44. Videre ankere CD44 MMP-9 til invasiv foran sette til økt celle invasjon. Disse resultatene har viktige implikasjoner for en ny rolle activin A i induksjon av EMT gjennom oppregulering av CD44.
Metoder
Cell kultur
Primær esophageal epitelceller (keratinocytter) fra normal human spiserøret ble etablert som tidligere beskrevet [25]. I korte trekk, ble supernatanter inneholder PFB-neo retrovirus koding enten full-lengde E-cadherin eller en dominant-negativ mutant av E-cadherin mangler cytoplasmatiske hale (betegnet som EC) som brukes for transfeksjon av hTERT-udødeliggjort, men ikke-transformert, esophageal epitelceller [28]. Tom pFBneo ble anvendt som en kontroll. I tillegg er en dominant-negativ mutant av TGFβRII (en gave fra Dr. H. Moses, Vanderbilt University, Nashville, Tennessee), subklonet inn pBABE puro, ble brukt til å generere ECdnT celler og tom pBABE puro som en kontroll. Full-lengde E-cadherin i pFBneo ble også brukt til å gjenopprette E-cadherin ekspresjon i TE-8 og FLO-1-celler. Føtale esophageal fibroblaster ble dyrket i DMEM med 10% føtalt bovint serum (FBS, Hyclone, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA), 100 enheter /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin (Gibco, Invitrogen, Carlsbad, CA). Esophageal plateepitel karsinom cellelinjer, TE celler, var en slags gave fra legene. Rustgi og Nakagawa (University of Pennsylvania, Philadelphia, PA). Esophageal adenokarsinom cellelinjer OE33, FLO-en og SK-GT-4 [29] – [31] og hode- og nakkekreft cellelinjer JHU-012 og JHU-013 ble utviklet fra primær hode og hals plateepitelkarsinom i Divisjon av Head and Neck Cancer Research ved Johns Hopkins University.
for E-cadherin hemming, celler ble sådd med en tetthet på 2 x 10
5 celler per brønn i en 6-brønners plate. Etter 24 timer ble mediet skiftet til serumfritt DMEM og cellene ble transfektert med en sluttkonsentrasjon på 10 nM siRNA ved hjelp av kalsiumfosfat-transfeksjon (400 ul RNase-fritt vann ble blandet med 50 ul 2,5 M CaCl
2, 50 pl 2 mikrometer siRNA med 500 ul HBSP2x (280 mM NaCl, 1,5 mM NA
2PO
42H
2o, 12 mM glukose, 10 mM KCL, 50 mM HEPES pH7.05 i 500 ml RNAse- fritt vann)). siRNA ble hentet fra Qiagen (Qiagen, Valencia, CA), Hs-CDH1_12 (Si1) og Hs_CDH1_13 (SI2) ble brukt mot E-cadherin og AllStars negative, ble ikke-støydempere siRNA prober brukes for kontroll (ctrl). For stimulering, 20 ng /ml activin A (R D, Minneapolis, MN) ble satt til kulturen
Tissue microarrays
Esophageal plateepitel karsinom vev ble anskaffet via kirurgi ved Okayama. universitetssykehus, Kitano Hospital og sykehuset ved University of Pennsylvania gjennom Cooperative menneskelig vev Network (CHTN). Alle ble patologisk diagnostisert som esophageal plateepitelkarsinom (ESCC) [32]. I tillegg er en kommersiell vev array for ESCC, AccuMax Array (ISU ABXIS, Co., distribuert av Accurate Chemical Scientific Corp., Westbury, NY) som inneholder 80 esophageal plateepitel kreft formalinfiksert parafin innebygd (FFPE) vev fra 40 pasienter og 4 normale kontroller ble anvendt for immunhistochemical farging. Sammen data kan være samlet for 166 plateepitel tumorprøver, 2 tilfeller med progresjon fra normal, carcinoma
in situ
til ESCC, og flere av kontrollene normalt vev.
Ett-hundre-og- trettitre esophageal adenokarsinom (EAC) FFPE-prøver ble analysert etter immunhistokjemisk farging. Disse prøvene ble hentet fra arkivene til avdelingene i patologi ved Vanderbilt University (Nashville, Tennessee, USA), Otto-von-Guericke University (Magdeburg, Tyskland) og fra CHTN [33]. Histopatologisk diagnose av Barretts øsofagus, dysplasi og spiserøret adenokarsinom ble bekreftet på grunnlag av H anti-CD44-klonen 2C5 (R CD44 F10-44-2 og α-tubulin (Abcam, Cambridge, MA) ble anvendt for immunhistokjemi på FFPE og Western Blot, henholdsvis; E-cadherin kjøpt fra BD Biovitenskap (Franklin Lakes, NJ), β-aktin og αSMA klone 1A4 ble begge kjøpt fra Sigma (Saint Louis, MO), anti-MMP-9 fra Calbiochem (EMD Chemicals, Rockland, MA); S100A4 er fra Thermo Fisher Scientific (Fremont, California) og vimentin klone V9 fra Santa Cruz Biotechnology Inc. (Santa Cruz, California).
Immunohistochemistry og immunfluorescens
Immunohistochemistry ble utført med VECTA Elite kit (Vector Laboratories, Burlingame, CA) etter produsentens protokoll ved hjelp av sine reagenser. Primært antistoff ble inkubert over natten ved 4 ° C og sekundært antistoff i 30 minutter ved 37 ° C. Deretter ble signalet utviklet ved hjelp av DAB underlaget kit for peroksidase. For immunofluoresence farging, ble en biotinylert sekundært antistoff påvises ved hjelp av Texas-Red-streptavidin eller FITC-merket sekundært antistoff. Fargete snitt ble montert med DAPI-inneholdende monteringsmedium.
Zymografi og in situ zymografi
Kondisjonert media fra organotypiske kultur dyrket under serumfrie betingelser i 48 timer ble separert på en 10% akrylamidgel inneholder gelatin ved 4 ° C. Gelene ble farget med Coomassie-blått R250 i 2 timer og overskudd av farge ble fjernet med destain buffer (10% eddiksyre og 20% metanol). Bilder ble tatt med Gel Doc ™ XR (Bio Rad, Hercules, CA).
For in situ zymografi, DQ-Gelatin fluorescein konjugert (Molecular Probes, Invitrogen, Carlsbad, California) ble resuspendert i 1 ml deionisert vann ved en konsentrasjon på 1 mg /ml. 100 ug /ml DQ-gelatin ble brukt til å overlappe 5 mikron tykke frosne snitt av organotypiske kulturer i 18 timer ved 37 ° C. Fluorescein-signal på seksjonene ble fotografert ved hjelp av et fluorescens mikroskop (Zeiss, Thornwood, NY).
Western blotting
Western avsetninger ble utført som tidligere beskrevet [35]. Forsøkene ble gjentatt minst to ganger.
Resultater
Primære menneskelige esophageal svulster viser inverse uttrykk for E-cadherin og CD44
For å finne ut hvilken rolle CD44 i esophageal celle invasjon og EMT, utførte vi immunhistokjemisk farging av E-cadherin og CD44 på microarray av 166 plateepitelkarsinom (SCC) og 131 adenokarsinomer. For to esophageal SCC pasienter, prøver som representerer progresjon fra normal til carcinoma
in situ plakater (CIS) og deretter ESCC (Fig. 1A til 1C), observerte vi en gradvis økning av CD44 uttrykk. Overall, E-cadherin var i stor grad begrenset til områder med lav eller fraværende CD44 uttrykk i normal epitel (Fig. 1D, E) og 20 ut av 166 svulster. For esophageal SCC, observerte vi oppregulering av CD44 i fravær av E-cadherin i 54% av tumorene (90 av 166 tumorer). Sammen 110 av 166 (66%, p 0,02) av våre kliniske prøver vises denne inverse forholdet mellom E-cadherin og CD44. Esophageal adenokarsinom prøvene viste en invers korrelasjon av E-cadherin og CD44-ekspresjon i 63 ut av 131 prøver (48%), med 41 prøver med betydelig E-cadherin, men ingen CD44 ekspresjon. Tjueto prøvene hadde økt CD44 uttrykk og er negative for E-cadherin. Tatt sammen, viser vi en statistisk signifikant (p 0,05) omvendt korrelasjon for ekspresjon av E-cadherin og CD44. Bilder av representative immunhistokjemiske stainings av tumorvev demonstrerer sammenslutning av E-cadherin og CD44 er vist i fig. 1 F-I.
IHC med anti-CD44-antistoff viser økt CD44 ekspresjon i løpet av progresjon fra normalt (A) til karsinom
in situ,
CIS (B), og tumor (C). Antistoff mot E-cadherin og CD44 viser ekspresjon av E-cadherin (D) og i fravær av CD44 (E) i den normale epitel. I EAC vev med beholdt E-cadherin uttrykket (F, stiplet svart linje) signalet for CD44 er lav (G). (H) Tap av E-cadherin er forbundet med et intenst signal for CD44 (I). Scale bar er 50 mikron.
E-cadherin-negative esophageal kreftcellelinjer viser økt CD44 uttrykk
For å undersøke omvendt korrelasjon av E-cadherin med CD44 i esophageal kreft cellelinjer analyserte vi esophageal plateepitelkarsinom cellelinjer (TE-1, -7, -8, -11 og -12), head-og-hals squamous kreftcellelinjer (JHU-012, JHU-013), samt adenokarsinom cellelinjer (FLO-en, OE33 og SK-GT-4) av Western blot for E-cadherin og CD44 uttrykk samt TGFβRII og vimentin. Mens standard form av CD44 (CD44s) uttrykkes i mesenchymalceller, noen variantformer, CD44v, uttrykt i epitelceller [36]. Vi fant at celler beholder E-cadherin ekspresjon hadde lavere nivåer av standarden (85 kDa på grunn av manglende exon 6-15) og varianten form (150 kDa) av CD44. Tapet av E-cadherin korrelerer med økt ekspresjon av CD44s og en økning i ekspresjon av EMT markør vimentin (fig. 2A). For å avgjøre om restaurering av E-cadherin kan påvirke uttrykket av CD44s og CD44v, transfektert vi TE-8 og FLO-1 cellelinjer, både uttrykker lave nivåer av E-cadherin, med full-lengde E-cadherin. Ved restaurering av E-cadherin uttrykk, var det generelle nivået av CD44 uttrykk redusert, men den varianten (epitel) form (125 kDa) økte (Fig. 2B).
(A) Western Blot analyse av esophageal plateepitel carcinoma cellelinjer (TE-1 -7, -8, -11 og -12), esophageal adenokarsinom cellelinjer (FLO-en, OE33, SK-GT-4) og hode og nakke kreft cellelinjer (JHU-012, JHU-013) viser at ekspresjon av E-cadherin og TGFβRII er forbundet med lave nivåer av CD44, mens tap av E-cadherin og TGFβRII korrelerer med oppregulering av CD44 og EMT markør vimentin. (B) Restaurering av E-cadherin, ECAD, uttrykk ved retroviral transfeksjon av TE-8 og FLO-1 celler i forhold til vektor kontroll (neo) viser en generell nedgang i CD44 uttrykk sammen med en bryter til økt CD44v løpet CD44s (CD44v: CD44variant, CD44s:. CD44 standard)
CD44 uttrykk er oppregulert i spiserøret epitelceller gjennomgår EMT
Vi har tidligere etablert en modell for å analysere virkningene av E-cadherin tap på esophageal keratinocytter av retrovirale uttrykk for dominant-negative E-cadherin (EF) eller dominant-negative E-cadherin i kombinasjon med dominant-negative TGFβRII (ECdnT) [25]. Vi utførte immunhistokjemiske stainings med antistoffer mot E-cadherin og CD44 og markører for EMT å belyse rollen til CD44 i esophageal EMT og celle invasjon. EC og ECdnT cellene har oppreguleres CD44 ekspresjon, og CD44 det positive signal i stor grad lokaliserer til områder av epitelial celle invasjon i det underliggende matrise (fig. 3). Både EU og ECdnT cellene har økte nivåer av S100A4, vimentin og αSMA indikerer at disse cellene er under EMT i organotypiske kulturer (Fig. 3D-F).
Immunohistochemistry av parafinsnitt med anti-E-cadherin antistoff ( A), anti-TGFβRII (B) og anti-CD44 (C) viser CD44-positive celler i EC og ECdnT celler invaderende inn i det underliggende kollagen /matrigel matrise (piler) som er negative for E-cadherin og TGFβRII. Immunhistokjemisk farging for EMT markører S100A4 (D), vimentin (E) og αSMA (F) viser økt positivt signal i invadere celler. Scale bar er 50 mikron.
CD44 co-lokaliserer med MMP-9 i forkant av invasive områder og blir oppregulert ved activin A
For å analysere mekanismen som CD44 medierer celle invasjon vi fokusert på aktivering av matriksmetalloproteinaser, fremtredende proteaser fordøye den ekstracellulære matrise. For å visualisere MMP aktivitet i områder av invasjonen vi brukte in situ zymografi. Fluorescein-positive områder oppdage MMP aktivitet ble begrenset til den ledende kanten i EF og ECdnT celler og celle invasjonen i den underliggende matrise (fig. 4A). Kondisjonerte medier fra organotypiske kulturer viste en gradvis økning av MMP-9-sekresjon og MMP-2 og MMP-9 aktivitet i invaderende celler (Fig. 4B). MMP-9 er blitt beskrevet som en bindingspartner av CD44 [37], [38]. Ved hjelp av dobbelt immunofluoresence farging med antistoffer mot CD44 og MMP-9 vi illustrere deres ko-lokalisering på celleoverflaten på den fremre kant av invasive områder (fig. 4C). For å demonstrere økt invasiv potensial i respons til aktivin A, et TGFp familiemedlem, sekresjon som er økt i invasive organotypiske kulturer (data ikke vist), stimulerte vi ECdnT celler og spiserørskreft cellelinjen TE-11 og viser forbedret celle invasjon
in vitro plakater (fig. 4D).
(A) for
in situ
zymografi, områder av MMP aktivitet er markert med en positiv fluorescein signal på frosne deler av ECAD, EC og ECdnT organotypiske kulturer. (B) Zymografi hjelp organotypiske kultur kondisjonert medium samlet inn fra ECAD, EC og ECdnT celler illustrerer økt sekresjon av MMP-2 og MMP-9. (C) Dobbel immunfluorescens farging av ECAD, EC og ECdnT viser MMP-9 (rød) colocalization med CD44 (grønn) i invasive celler. Scale bar er 50 mikron. (D) Stimulering med activin En induserer økt invasjon av ECdnT og TE-11 celler i invasjons analyser. Sammenligning mellom gruppene ble gjort av mannen og Whitney ikke- parametrisk test, * p 0,05, ** p 0,001. (E) Western Blot av cellelysater fra TE-11 transfektert med AllStars negative ikke-tie siRNA celler (Ctrl) og TE-11 celler transfektert med siRNA mot E-cadherin (Si1, SI2) demonstrerer oppregulering av CD44 etter stimulering med activin A.
aktivin A har også blitt beskrevet for å regulere stemness [17], og vi hypotese at CD44 som en stamcelle markør kan være under regulering av aktivin A. for å identifisere en potensiell signalveien ansvarlig for oppregulering av CD44, vi analyserte spiserørskreft cellelinje, TE-11, etter knockdown av E-cadherin hjelp siRNA. Vi stimulert TE-11-celler transfektert med siRNA mot E-cadherin-celler med aktivin A og analysert ekspresjon av CD44. Aktivin En behandling øket CD44-variant ekspresjon i TE-11 i fravær av E-cadherin (fig. 4E).
Til sammen utgjør disse data viser reguleringen av CD44-ekspresjon av E-cadherin gjennom aktivin A og tilveie funksjonelle bevis for en kausal rolle i induksjon av celle invasjon.
diskusjon
Vi viser den gradvise tapet av E-cadherin er forbundet med en progressiv økning av CD44
in vitro
og
in vivo
. I fravær av E-cadherin, kan aktivin A indusere CD44 ekspresjon. Aktivin A ble vist å være en viktig regulator for stemness [17], og som andre medlemmer av superfamilien TGFfi, har også blitt rapportert å påvirke utviklingen og tumorigenesis [20], [22] – [24]. Overekspresjon av aktivin A er blitt beskrevet i esophageal squamous cell carcinoma og er assosiert med dårlig prognose. Aktivin En fremmer tumorcelle aggressivitet ved øket ekspresjon av MMP-7 og N-cadherin [22] – [24]. Her viser vi at aktivin A kan oppregulere CD44, som i sin tur forankrer MMP-9 til den fremre kant og induserer celle invasjon. Foreningen av E-cadherin, CD44 og MMP med EMT antyder en stor rolle for activin A i EMT.
Vi fant ut at E-cadherin tap er ledsaget av en endring av CD44 isoform uttrykk. Selv om det tidligere studier har vist at alternativ spleising av CD44 kan styres via Ras-signalreaksjonsveiinhibitor for å fremme ekspresjon av variantformer [39], Warzecha et al. nylig har identifisert epitelceller spleise faktorer (ESRP1 og ESRP2) fremme uttrykk for CD44v å opprettholde epithelial fenotype [40]. Disse faktorer er tapt under EMT [41] – [43]. Muligens er ekspresjon av CD44 standard avhengig av tap av ESRP1 og 2 i spiserøret karsinom. ESRP1 og to uttrykk har blitt ytterligere anerkjent for å være innblandet i EMT-forbundet skjøting programmer i brystkreft [44]. Det er interessant å stanse all ESPR1 /2 i epitel-celler indusert ekspresjon av mesenchymale cadherin, N-cadherin, uten endringer i E-cadherin uttrykk. Omvendt kan uttrykk for ESPR1 reversere Twist-indusert EMT i mammary epitelceller. I tillegg transkripsjonsfaktor Twist2 bidrar til utvidelsen av stilk-lignende cellepopulasjoner ved nedregulering av E-cadherin og økt ekspresjon av stamcelle markører slik som CD44 [45].
Til sammen finnes det flere mekanismer der CD44-isoformene, alle har samme cytoplasmaområde, kan indusere EMT, hvorav mange involverer samspillet av den ekstracellulære domene med mikromiljøet. CD44 kan fungere som en co-reseptor for c-Met, og er den bona fide reseptoren for hyaluronsyre, som kan fremme EMT [9]. E-cadherin regulerer negativt interaksjonen av CD44 med hyaluronsyre som resulterer i en hemming av tumorinvasjon og celle forgrening morfogenese [46]. Vi viser her at tapet av E-cadherin uttrykk korrelerer med CD44s form og induksjon av en invasiv fenotype.
Vi har tidligere vist at invasjonen av esophageal keratinocytter mangler funksjonell E-cadherin og TGFβRII ble formidlet av cathepsin B [35]. Cathepsin B kan aktiveres i et surt miljø initiert av interaksjonen av CD44 med et Na + -H + leren [37]. Mens økt cathepsin B aktivitet resulterer i TGFB aktivering [35], kan MMP-9 også aktivere TGFB [47] knytte data som presenteres her med vår forrige undersøkelse. Parakrin TGFp signale aktiverer fibroblaster, og også induserer kapillær formasjon [48]. Disse observasjonene markere betydningen av epitel-mesenkymale crosstalk i tumorigenesis.
I konklusjonen, viser vi at CD44 oppregulering er forbundet med tap av E-cadherin i esophageal carcinoma og at CD44 fremmer MMP-9 mediert tumorinvasjon .
takk
Vi vil også gjerne takke medlemmene av Beauchamp laboratoriet, Drs. Deane og Beauchamp, og Dr. Anil K. Rustgi og Vanderbilt Avdeling for biostatistikk for nyttige diskusjoner.
