Abstract
Mål
Formålet med denne studien var å undersøke nanobubbles bærer androgen reseptor (AR) siRNA og deres
in vitro Hotell og
in vivo
anti-tumor-effekter, når de kombineres med ultrasonisk bestråling, på androgen-uavhengig prostatacancer (aipc).
Materialer og metoder
Nanobubbles bærer AR siRNA ble fremstilt under anvendelse av poly-L-lysin og elektro adsorpsjon metoder. Bruke c4-2 celle aktivitet som en testing indeks, ble de optimale bestråling parametere (inkludert nanobubble nummer /celle nummer ratio, mekanisk indeks [MI], og bestråling tid) bestemt og brukt for transfeksjon av tre menneskelige prostata kreft cellelinjer (C4 -2, LNCaP, og PC-3-celler). De AR uttrykk nivåer ble undersøkt med RT-PCR og Western blot analyse. I tillegg ble effekten av nanobubbles og kontrollmikrobobler navngitte SonoVue vurdert gjennom bildebehandling i en c4-2 xenograft modell. Til slutt ble det vekst og AR uttrykk for syv grupper av tumorvev vurdert ved hjelp av c4-2 xenograft mus modell.
Resultater
nanobubbles hadde en gjennomsnittlig diameter på 609,5 ± 15,6 nm og kunne effektivt binder seg til AR siRNA. Under optimaliserte betingelser for et nanobubble tall /celle nummer forhold på 100:1, en MI på 1,2, og en bestrålingstid på 2 min, den høyeste transfeksjonsandeler i c4-2, LNCaP, og PC-3-celler var 67,4%, 74,0%, og 63,96%, henholdsvis. I de c4-2 og LNCaP-celler, behandling med disse bindings nanobubbles pluss ultrasonisk bestråling i betydelig grad hemmet cellevekst og resulterte i undertrykkelse av AR mRNA og protein ekspresjon. I tillegg kontrastforsterket ultralyd viste at nanobubbles oppnådd sterkere signaler enn SonoVue kontroll i det sentrale hypovascular området av svulstene. Til slutt, det anti-tumor effekten av disse nanobubbles pluss ultrasonisk bestråling var størst i de xenograft tumormodell sammenlignet med de andre gruppene.
Konklusjon
Nanobubbles bærer AR siRNA kan potensielt benyttes som gen vektorer i kombinasjon med ultralyd bestråling for behandling av aipc
Citation:. Wang L, Zhang M, Tan K, Guo Y, Tong H, Vifte X, et al. (2014) Fremstilling av Nanobubbles Bære androgen Receptor siRNA og deres hemmende effekt på androgen uavhengig prostatakreft når Kombinert med Ultrasonic bestråling. PLoS ONE 9 (5): e96586. doi: 10,1371 /journal.pone.0096586
Redaktør: Zoran Culig, Innsbruck Medical University, Østerrike
mottatt: 23 februar 2014; Godkjent: 09.04.2014; Publisert: 05.05.2014
Copyright: © 2014 Wang et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble støttet av Natural Science Foundation National of China (nr 30970830) og Key Prosjekt of Science Foundation of Chongqing City Natural (cstc2012jjB0072). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Det er vel etablert at prostatakreft er avhengig av androgener [1]. Derfor har androgen deprivasjon vært den viktigste behandling for avansert prostatakreft. Med denne behandlingen, men sykdommen utvikler seg raskt til androgen-uavhengig prostatacancer (aipc) hos de fleste pasienter [2], [3]. For tiden er det ingen effektive langsiktige terapi for aipc. Utvikling av nye behandlingsstrategier for aipc fortsatt attraktiv, men er en utfordrende problem i klinisk onkologi. Tidligere studier har vist at veksten av aipc er avhengig av androgenreseptoren (AR). Således blokkerer AR uttrykk har et stort potensial for behandling av aipc [4].
Studier har vist at undertrykke AR uttrykk med RNA interferens (RNAi) teknologi er en effektiv måte til å inhibere veksten av prostata kreftceller, indikerer at denne fremgangsmåte kan ha potensial til å overvinne hindringer forbundet med aipc behandling [5]. I våre tidligere studier, ble AR dobbelttrådet RNA (dsRNA) med en høy spesifisitet for AR gener utformet for å blokkere ekspresjonen av AR i aipc celler og for å hemme cellevekst [6]. Imidlertid er denne type genterapi tilnærming vanskelig å anvende i et klinisk miljø på grunn av lav-genet transfeksjonseffektivitet. En av de viktigste årsakene til lav transfeksjon effektivitet er mangelen på en effektiv, ikke-invasiv
in vivo
målrettet genavleveringssystem. I de senere år har ultralyd-ødeleggbare mikrobobler er vist å være en lovende metode for genterapi. Faktisk kan ultralyd-mediert mikroboble ødeleggelse ikke bare forbedre transfeksjonseffektivitet gen, men kan også bli anvendt for vev-spesifikk levering av terapeutiske midler [7], [8].
Med utvikling av ultralydavbildning og molekylær nanoteknologi, på størrelse med mikrobobler fortsetter å synke, og mikro-til nano-skala størrelser er nå oppnåelig. Nanobubbles tilbyr flere fordeler i målrettet genet transfeksjon [9]. For eksempel er nanobubbles kjennetegnet ved sterk gjennomtrengende kraft og stabil ytelse, noe som tillater dem å gå inn tumorvev gjennom tumorvaskulatur [10]. Derfor, i denne studien, kombinert vi RNAi teknologi med nanoteknologi ved forbereder nanobubbles bærer AR små interfererende RNA (siRNA). De fysikalske egenskapene til disse boblene ble deretter analysert. Videre ble forberedt nanobubbles brukes for siRNA transfeksjon av aipc cellene sammen med ultralyd bestråling behandling for å indusere frigjøring av siRNA transkripsjoner.
in vitro
transfeksjonseffektivitet ble systematisk undersøkt. I tillegg ble anti-tumor effekt av de nanobubbles evaluert ved å bruke bildediagnostikk og et tumorveksthemmende analyse i en mus xenograft modell prostatakreft. Resultatene som presenteres her tilveie eksperimentell støtte for bruken av nanobubbles bærer AR siRNA i kombinasjon med ultrasonisk bestråling som en potensiell effektiv terapi for aipc.
Materialer og metoder
Syntese av AR siRNA
Basert på den tidligere fastsatte 19-bp target sekvens av AR cDNA ble AR siRNA syntetisert med Silencer siRNA Construction Kit (Ambion, Austen City, USA) [6]. Cy3-merket AR siRNA ble deretter syntetisert med Silencer siRNA Cy3 Merking Kit (Ambion) for fluorescens sporing studier. Konsentrasjonen av det syntetiserte siRNA ble bestemt ved anvendelse av et spektrofotometer, og de sirnas ble fortynnet til 50 uM for bruk i denne studien.
Fremstilling av nanobubbles bærer AR siRNA og karakterisering av deres fysiske egenskaper
en suspensjon av lipid eksipienser, inkludert dipalmitoylfosfatidylkolin (DPPC), dipalmitoylphosphatidylethanolamine (DPPE), dipalmitoylfosfatidinsyre (DPPA), og dipalmitoylphosphatidylglycerol (DPPG) (i et molarforhold på 90:2:5:3), ble fremstilt i polyetylenglykol (i et molforhold på 94:6). Suspensjonen ble aliquotert i 1 ml ampuller og frysetørket. De frysetørrede suspensjonene ble rehydrert med 1 ml av hydrering oppløsning med 50% glukose, propylenglykol og glycerin ved volum på 08:01:01. Perfluorpropan (C
3F
8) ble deretter satt til ampullene for å erstatte den luft, og en ST-B-serien amalgamator (AT den utstrålende overflaten overfor vertikalt oppad og er dekket jevnt med ultrasoniske kopling gel; en 24-brønns plate med 1,5 x 10
5 c4-2 celler dyrket i hver brønn ble plassert horisontalt på den utstrålende overflate av sonden for å sikre at hver brønn ble fullstendig eksponert for den utstrålende kilden; den nanobubble suspensjonen ble tilsatt til hver brønn og blandet tilstrekkelig; og ultrasonisk bestråling ble utført med variasjoner i flere parametere, inkludert konsentrasjonen av tomme nanobubbles (målt som den nanobubble nummer /celle nummer forhold), den mekaniske indeks (MI, en refleksjon av ultralydenergien beregnet ved å dividere den topp negative akustisk trykk ved kvadratroten av frekvensen), og den bestrålingstiden. I detalj for å evaluere effekten av den tomme nanobubble konsentrasjon, ble seks grupper etablert basert på deres nanobubble nummer /celle nummer ratio, som var 0, 45:1, 90:1, 135:1, 180:1, eller styre gruppe (normale celler uten noen behandling som kontroll); svingerfrekvensen var 1,0-5,0 MHz, varigheten var 30 s, og MI var 1,0. Ytterligere fem grupper ble etablert med varierende MIS, nemlig 0,1, 0,6, 1, 1,4, eller kontrollgruppen (normale celler uten noen behandling som kontroll); svingerfrekvensen var 1,0-5,0 MHz, varigheten var 30 s, og nanobubble nummer /celle nummer forholdet var 100:1. Fem grupper ble etablert for å evaluere effekten av en periode som var 10 sek, 30 sek, 1 min, 2 min, eller kontrollgruppen (normale celler uten noen behandling som kontroll); svingerfrekvensen var 1,0-5,0 MHz, MI var 1,0, og nanobubble nummer /celle nummer forholdet var 100:1. Etter ultralyd-bestråling, cellene ble dyrket i 24 timer, og deres cellevekst ble analysert ved bruk av et blodtelleinstrument; celletall ble anvendt som test indeks for å evaluere effekten av disse parametere på celleaktivitet. Alle analysene ble gjentas minst tre ganger, og en rekke ikke-destruktiv forhold for
in vitro
ultralyd bestråling ble bestemt.
Transfeksjon effektivitet analyse i prostatakreftceller
LNCaP , c4-2 og PC-3-celler ble sådd ut i 24-brønners plater i en tetthet på 5 x 10
4 celler pr brønn og dyrket over natten. Nanobubbles bærer Cy3-merkede AR siRNA ble deretter tilsatt til brønnene i hver cellekulturplate og transfektert inn i disse tre cellelinjer i henhold til det forhåndsbestemte område av ikke-destruktive betingelser. Transfeksjonseffektiviteten ble deretter vurdert ved hjelp av fluorescens mikroskopi. Prosentandelen av fluorescerende celler (transfeksjon rate) ble bestemt ved flow-cytometri. I korthet ble cellene resuspendert etter trypsin-spaltning for å generere en enkeltcellesuspensjon. Flowcytometri (FACSCalibur, Becton Dickinson, NJ, USA) ble anvendt for å måle fluorescensintensiteten på 10.000 celler, og resultatene ble analysert ved anvendelse FlowJo 7,65 programvare. Celler ble gated for å beregne prosentandelen av transfekterte celler innenfor den totale cellepopulasjonen, som muliggjør bestemmelse av de optimale parametere for å oppnå den høyeste transfeksjonseffektiviteten. Alle analysene ble gjentas minst tre ganger.
Cell veksthemmende analyse
Hver av de tre prostatakreft cellelinjer ble delt inn i seks cellebehandlingsgruppene i henhold til de reagenser og betingelser som benyttes (Tabell 1). Alle gruppene ble transfektert ved å bruke den forannevnte ultrasoniske bestrålingsmetoden under de passende parametere: frekvens på 1,0 til 5,0 MHz, mekanisk indeks (MI) på 1,2, og varigheten av utsettelsen for B-mode ultralyd av 2 min. Celletelling leder-8 (CCK-8) ble anvendt daglig fra den første til den sjette dag etter transfeksjon for å vurdere cellevekst. Hver gruppe hadde 10 tilsvarende testbrønner og 2 negative kontrollbrønner. Absorbansverdiene verdiene ved 450 nm [D (450 nm)] ble analysert med en mikroplateavleser (modell 550, Bio-Rad, USA). En cellevekstkurve ble oppnådd ved grafisk fremstilling tiden (X-aksen) som funksjon av den respektive absorbansverdien (Y-aksen), og hemming av cellevekst hastighet (IR) ble beregnet ved anvendelse av følgende formel:
i tillegg ble celle morfologi 48 timer etter transfeksjon observert ved anvendelse av fluorescens mikroskopi.
Påvisning av AR mRNA-ekspresjon nivå ved RT-PCR
LnCap og c4-2-celler ble transfektert ved å bruke den tidligere nevnte ultralyd bestråling fremgangsmåten med de ovenfor angitte parametre. Total RNA ble ekstrahert fra alle gruppene 48 timer etter ultralyd-bestråling. En RT-PCR-analyse ble utført under anvendelse av en RNA-PCR Kit (AMV Ver. 3.0, Kyoto, Japan), og glyceraldehyd fosfat dehydrogenase (GAPDH) ble anvendt som en kontroll. Primersekvensene (5 «→ 3») for AR var AAG CCA TTG AGC CAG GTG Tags TG (oppstrøms) og AAC CAG ATG AGG GGC GAA GTA GA (nedstrøms), og primer sekvenser for GAPDH var ACC CAT CAC CAT CTT CCA GGA G (oppstrøms) og GAA GGG GCG GAG ATG ATG AC (nedstrøms). Disse primerne amplifiserte en 275-bp AR-fragment og et 159 bp-fragment GAPDH, respektivt. Revers transkripsjon Betingelsene var 50 ° C i 30 minutter, 99 ° C i 5 minutter, og 5 ° C i 5 minutter. PCR-betingelsene var 94 ° C i 2 minutter; 32 sykluser ved 94 ° C i 30 s, 57 ° C i 30 s, og 72 ° C i 1 min; og 72 ° C i 10 min. RT-PCR-produkter ble lastet på en 2% agarosegel. Etter elektroforese ble båndene visualisert ved hjelp av en Bio-Rad GelDoc 2000 gel bildesystem (Bio-Rad, CA, USA) og ble densitometrically analysert ved hjelp ImageJ programvare (NIH, https://rsb.info.nih.gov/ij/). Alle analysene ble gjentatt fem ganger.
Påvisning av AR protein uttrykk nivå ved Western blot analyse
LNCaP og c4-2 celler ble transfektert med nevnte ultralyd bestråling metode med optimaliserte parametere. Totalt cellulært protein ekstrahert fra alle grupper ved hjelp av en cellelyseringsbuffer 48 timer etter at den ultrasoniske bestråling. Proteinkonsentrasjonen ble bestemt ved anvendelse av Bradford-analysen. En 50 ug prøve av hvert cellelysat ble separert på en 12% natrium-dodecyl-sulfat-polyakrylamid-gelelektroforese (SDS-PAGE) gel og overført til en polyvinyliden fluorid (PVDF) membran. Membranene ble blokkert med 5% fettfri tørrmelk i 4 timer ved romtemperatur og inkubert med et primært antistoff (mus monoklonalt antistoff mot humant AR, Santa Cruz Biotechnology, California, USA) ved en 1:400 fortynning ved 37 ° C i 4 h. Membranene ble deretter vasket med Tris-bufret saltvann /Tween (TBST) buffer og inkubert med sekundært antistoff (geite-anti-mus IgG; Zsjqbio, Beijing, Kina) (1:1200 fortynning) ved 37 ° C i 2 timer. En forsterket kjemiluminescens (ECL) reagenset ble så brukt for å detektere proteinbånd ved å utsette blottene til autoradiografisk film. En kvantitativ billedanalyse ble utført under anvendelse av Mengde One 4,52 programvare (Bio-Rad). GAPDH ble anvendt for å normalisere prøvene. Alle analysene ble gjentatt fem ganger.
Imaging av nanobubbles bærer AR siRNA i en mus xenograft modell
Denne dyrestudie ble godkjent av Laboratory Animal Welfare og etikkutvalg av den tredje Military Medical University , Kina. Fem mannlige SCID-mus som veide 22-25 g (5-7 uker gamle) ble xenopodet med 3 x 10
6 c4-2 prostatakreftceller i 100 ul av Matrigel (BD Biosciences, Basel, Sveits). Svulster fikk lov til å etablere seg og vokse til en diameter på 10-15 mm. Dyrene ble så bedøvet med en intraperitoneal injeksjon av 100 ul av 1% natrium-pentobarbital-løsning og deretter festes i en liggende stilling. To-dimensjonale ultralydbilder av xenopodet svulster ble anskaffet ved hjelp av en PHILIPS iU22 ultralydsystem. Nanobubbles bærer AR siRNA ble deretter administrert til mus via haleveneinjeksjon i en dose på 5 ml /kg kroppsvekt. De som brukes for å oppnå de ultralydbilder parametrene var som følger: probe frekvens = 5-12 MHz; MI = 0,4; og gevinst = 70%. Sonden ble løst, og kontrast forbedret dynamisk bildene ble tatt ved hjelp av ultralyd arbeidsstasjon programvare. Mikron størrelse mircrobubbles heter SonoVue kontrastmiddel (Bracco, Milano, Italia) ble anvendt som en kontroll under de samme betingelser. En kvantitativ analyse ble utført ved hjelp av Philips QLAB 8.1 programvare (Royal Dutch Philips Electronics Ltd, Nederland).
In vivo
tumorvekstinhibitering analysen
Denne dyrestudie ble godkjent ved Laboratory Animal Welfare og etikkutvalg av den tredje Military Medical University, Kina. Femtiseks hann SCID-mus som veide 22-25 g (5-7 uker gamle) ble xenopodet med 3 x 10
6 c4-2 celler i 100 ul av Matrigel. Den dyrestudie ble godkjent av dyreetikk komité Kina Pharmaceutical University. Tumorene fikk etablere seg og vokse til en diameter på 7-10 mm. Dyrene peiling tumorxenotransplantater ble deretter tilfeldig delt inn i syv grupper (åtte dyr per gruppe). Behandlinger som brukes for grupper 1-6 er oppført i Tabell 1. Gruppe 7 ble administrert nanobubbles bærer tull siRNA + ultralyd bestråling. I detalj dosene av nanobubbles bærer AR siRNA (ca. 1,6 x 10
6 /il), tomme nanobubbles, og saltløsning var 5 ml /kg kroppsvekt. Den nakne AR siRNA dose var 100 mikrogram per mus. Alle nanobubbles, bare AR siRNA og saltløsning ble administrert som en intravenøs bolusdose via en halevene. Musene i gruppene 3-7 ble deretter bedøvd med isofluran, og sikret i en liggende stilling. Umiddelbart etter injeksjon ble tumorxenografter ble behandlet med en Philips iU22 ultralydsystem. Perfusjon av nanobubbles inn i svulsten ble visualisert i sanntid ved hjelp av ultralyd (5-12 MHz) ved lav akustisk effekt (MI 0.4) for å minimere nanobubble ødeleggelse. Ved visualisering av nanobubbles i en tumor, ble nanobubbles brast ved å øke MI til 1,2 med en frekvens på 1-5 MHz. En ultralyd eksponering varighet på 30 min ble brukt for å sikre at alle nanobubbles ble ødelagt. Under behandlingen ble transduseren påført med en sirkulær bevegelse for å sikre at hele tumor xenograft mottatte ultralydeksponering. For alle dyrene, ble behandlingen utført tre ganger, en gang hver 3 d (på dag 0, dag 3, og dag 6). Den maksimale diameter (a, mm) og den korteste diameter (b, mm) av hver tumor ble målt hver 3. d begynner på den første behandlingsdag (dag 0) og slutter 21 dager etter den første behandling (dag 21). Tumorvolumet (TV) ble beregnet i henhold til følgende formel: TV = 1/2 x en x b
2. Den relative tumorvolum (RTV) ble deretter beregnet ved anvendelse av følgende formel: RTV = tv
n /TV
0 x 100%, hvor TV
n er tumorvolumet målt på dag n og TV
0 er tumorvolumet på dag 0. tumorvekstkurve ble plottet basert på RTV. På dag 21 ble alle dyrene avlivet, og svulstene ble utøvd og veid. Den tumorvekstinhibering (TGIR) ble beregnet ved hjelp av følgende formel:. TGIR = (1-VBR /TWC) x 100%, hvor TWT og TWC er de midlere tumorvekt i de behandlede og kontrollgruppene, henholdsvis
Påvisning av AR mRNA uttrykk i prostatakreft ved QRT-PCR
Total RNA ble isolert fra tumorvev følge instruksjonene som følger med Super VILO RT-PCR Synthesis Kit (Invitrogen). Konsentrasjonen og integritet av RNA ble bestemt ved spektrofotometrisk analyse ved A260 og A280. Omtrent 500 ng av total RNA ble revers-transkribert med Superscript III (Invitrogen) ved anvendelse av N6 tilfeldig primere. Omtrent 2 pl av cDNA ble amplifisert ved hjelp av en-trinns real-time PCR på en Applied Biosystems 7500 FAST maskin med et standardprogram. De relative uttrykk nivåer av AR mRNA ble beregnet ved hjelp av formelen, hvor.
Påvisning av AR protein uttrykk nivå i prostatakreft ved Western blot analyse
Xenotransplantat svulstvev ble homogenisert med 1 ml radioimmunpresipitasjonsmålinger assay (RIPA) buffer inneholdende protease inhibitor og sentrifugert ved 12.000 g i 10 min ved 4 ° C, og supernatanten ble lagret ved -80 ° C. Totalt protein ble separert på en 10% SDS-PAGE-gel og overført til en PVDF-membran ved 100 V i 50 min. Western Blot trinn var de samme som beskrevet for
in vitro
eksperiment.
Statistisk analyse
Den statistiske analysen ble utført med SPSS 13.0 programvare (SPSS Inc., Chicago, IL, USA). Kvantitative data er presentert som gjennomsnitt ± standard avvik (± SD). En en-veis analyse av varians (ANOVA) ble anvendt for å sammenligne hjelp av flere grupper (n 2). Uavhengige-samples t-test ble brukt for å sammenligne hjelp av hver behandlingsgruppe og dens relative kontrollgruppe. En P-verdi (P) 0,05 ble ansett som statistisk signifikant
Resultater
Fysiske egenskaper nanobubbles bærer AR siRNA
Bilder oppnådd under lyse felt mikroskopi viste at. de nanobubbles var homogene i størrelse og jevnt fordelt med ingen signifikant aggregering (fig. 1A). De vanlige nanobubbles ble observert under et optisk mikroskop (1000 x) (fig. 1C). Fluorescens mikroskopi bekreftet at vår siRNA merking tilnærming var effektiv; bare nanobubbles konjugert med Cy3-merket AR siRNA oppviste rød fluorescens (Fig. 1B), og ingen fluorescens ble observert med de vanlige nanobubbles (Fig. 1D). De oppnådde med en partikkelstørrelse analysator resultater indikerte at nanobubbles hadde en gjennomsnittlig diameter på 609,5 ± 15,6 nm (område, 269-1030 nm), og deres zeta-potensialet var -29,9 ± 6,6 mV. De tomme nanobubbles hadde en gjennomsnittlig diameter på 509,3 ± 45,19 nm (område, 324-930 nm), og zeta-potensialet av disse boblene var -27,3 ± 6,4 mV. Som vist på fig. 2, er mengden av siRNA lastet økte på en doseavhengig måte. Den gjennomsnittlige AR siRNA lasting evne til nanobubbles var (18,94 ± 0,35) × 10
-9 nmol /nanobubble.
(A) PLL nanobubbles henhold lyse felt mikroskopi. (B) Åpen fluorescens ble observert i PLL nanobubbles. (C) Blank nanobubbles henhold lyse felt mikroskopi. (D) Ingen fluorescens ble observert i de tomme nanobubbles. De røde pilene i bildene indikerer nanobubbles (1000 ×).
Optimale bestrålings forhold for transfeksjon
Fig. 3 viser konsekvensene av ulike parametre for ultralyd bestråling på c4-2 cellevekst. Et volum på nanobubbles større enn 6 pl (den nanobubble nummer /celle nummer forholdet var 135:1) resulterte i en signifikant reduksjon i cellevekst (P 0,05 sammenlignet med kontrollgruppen) (figur 3A.). En MI større enn 1,4 også forårsaket en signifikant inhibering av cellevekst (P 0,05 sammenlignet med kontrollgruppen) (figur 3B.). Likevel ble virkningen av bestrålingstiden på cellevekst funnet å være ganske lav; Det var praktisk talt ingen signifikante forskjeller i cellevekst mellom gruppene behandlet med forskjellige bestrålingstider (Fig. 3C). Dermed destruktiv bestrålings forholdene ble til slutt bestemt på å være en nanobubble nummer /celle nummer ratio 135:1 ( 6 ul nanobubbles), en MI. 1,4, og en bestråling tid ≤2 min
(A) virkningen av nanobubble konsentrasjon (med en MI på 1,0 og en bestrålingstid på 30 s), U: eksponert for ultralyd; (B) virkningen av MI, med et nanobubble nummer /celle nummer forhold på 100:1 og en bestrålingstid på 30 s; og (C) virkningen av bestrålingstiden, med et nanobubble nummer /celle nummer forhold på 100:1 og en MI på 1,0. Cellene ble tellet 24 timer etter bestråling med ultralyd. Alle analysene ble gjentatt tre ganger. Dataene er presentert som gjennomsnitt ± SD (n = 3). Stjerne (*) representerer nivået av betydning sammenlignet med kontrollgruppen (P 0,05)
Transfeksjon effektivitet analyse i prostatakreftceller
Red fluorescens (tegn på Cy3-merket AR. siRNA) ble observert i de fleste deler av cytoplasmaet i alle tre prostatakreft-cellelinjer, men det ble ikke påvist i kjernen (fig. 4). Disse resultatene indikerer at den Cy3-merkede AR siRNA ble vellykket transfektert. Prosentandelene av transfekterte celler i disse cellelinjene under forskjellige ultrasoniske bestrålingsbetingelser er vist i tabell 2.
Red fluorescens i cytoplasma indikerer at Cy3-merkede AR siRNA ble vellykket transfektert (400 x forstørrelse).
Som vist i tabell 2, når nanobubbles bærer AR siRNA ble gitt med en nanobubble nummer /celle nummer forhold på 100:1 (5 mL av nanobubbles), prosentandel av transfekterte celler økt sammen med økninger i MI og bestråling tid. Den høyeste transfeksjonseffektiviteten ble oppnådd med en MI på 1,2 og en bestrålingstid på 2 min. Derfor er de optimaliserte parametere for å oppnå den høyeste transfeksjonseffektiviteten var som følger: 5 ul av nanobubbles, en MI på 1,2, og en bestrålingstid på 2 min; følgende
in vitro
analyser ble utført ved anvendelse av disse parameterne.
Cellevekst-hemming
CCK-8-analyse fra den første til den sjette dag etter transfeksjon indikerte at cellevekst ble inhibert i gruppene 3, 5 og 6 av de c4-2 og LNCaP-celler (fig. 5A og 5B). På den sjette dagen etter transfeksjon, de c4-2 cellene i gruppe 6 vises den høyeste veksthemming hastigheten 64,7%. Imidlertid, ingen vesentlig hemming av cellevekst ble observert i PC-3-celler, og den veksthemming hastigheten i gruppe 6 bare var 0,9% (tabell 3).
signifikant inhibering av cellevekst ble observert i gruppene 3, 5 og 6 for begge cellelinjer. Dataene er presentert som gjennomsnitt ± SD (n = 10). Grupper 1-6 representerer bare AR siRNA + tomme nanobubbles, nanobubbles bærer AR siRNA, bart AR siRNA + ultralyd bestråling, tomme nanobubbles + ultralyd bestråling, bart AR siRNA + blank nanobubbles + ultralyd bestråling, og nanobubbles bærer AR siRNA + ultralyd bestråling, henholdsvis .
AR mRNA uttrykk nivåer analysert ved RT-PCR
agarosegelelektroforese resultater etter RT-PCR er vist i fig. 6A. Striper med 275 bp (AR) og 159 bp (GAPDH) ble observert i alle grupper av både c4-2 og LNCaP celler. AR band ble ikke observert i noen av PC-3 grupper fordi PC-3 celler ikke uttrykker AR. Resultatene av den kvantitative analyse (Fig. 6B) viste at i begge cellelinjene, ble AR mRNA-ekspresjon betydelig undertrykt i gruppene 3, 5 og 6 sammenlignet med kontrollgruppen (gruppe 1). Den høyeste undertrykkelse ble oppnådd i gruppe 6.
Lanes 1-6 representerer grupper 1-6, henholdsvis (group1: siRNA + NB, Gruppe 2: siRNA-NB, Group3: siRNA + USA, Group4: NB + US , GRUPPE 5: siRNA + NB + US, GRUPPE 6: siRNA-NB + US). Størrelsene på markørene (M kjørefelt, fra bunn til topp) er 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, og 450 bp. GAPDH tjente som en intern referanse. Den høyeste undertrykkelse av AR mRNA-ekspresjon ble observert i gruppe 6. (A) og (B): Bånd av RT-PCR produktene og resultatene av bilde kvantifisering; dataene i histogrammene representerer middel ± SD av fem uavhengige eksperimenter. (* P 0,05 og ** P 0,01 vs. Gruppe 1 c4-2 legemer, # P 0,05 og ## P 0,01 vs. Gruppe 1 LNCaP celler).
Post-transfeksjon AR-protein ekspresjonsnivåer analysert ved Western blot-analyse
Western blot resultatene er vist i fig. 7. AR-protein-ekspresjon ble undertrykket i gruppene 3, 5 og 6 av de c4-2 og LNCaP-celler. Den høyeste undertrykkelse ble observert i gruppe 6, som var i samsvar med RT-PCR resultater
Lanes 1-6 representerer grupper 1-6, henholdsvis (group1. SiRNA + NB, Gruppe 2: siRNA-NB, Group3 : siRNA + USA, Group4: NB + USA, GRUPPE 5: siRNA + NB + US, GRUPPE 6: siRNA-NB + US). GAPDH protein tjente som en intern referanse. Den høyeste suppresjon ble observert i gruppe 6. (A) og (B): Immuno-bånd, og resultatene av bilde kvantifisering; dataene i histogrammene representerer middel ± SD av fem uavhengige eksperimenter. (* P 0,05 og ** P 0,01 vs. Gruppe 1 c4-2 legemer, # P 0,05 og ## P 0,01 vs. Gruppe 1 LNCaP celler).
Imaging av nanobubbles bærer AR siRNA i c4-2 prostatakreft xenograft modell
kontrastforsterket dynamiske bilder av nanobubbles bærer AR siRNA er vist i fig. 8. Resultatene indikerte at nanobubbles oppnås sterkere signaler enn SonoVue i det sentrale området hypovascular av tumorene. Den bildedataanalyse (tabell 4) viste at disse nanobubbles hadde betydelige økninger i toppintensitet og bilde varighet sammenlignet med SonoVue kontroll (P 0,05). I rundt svulsten området, nanobubbles viste også signifikant lengre bildebehandling varighet enn SonoVue (P 0,05).
(A) A xenograft tumor prøven;
