Abstract
Hensikten med denne studien var å fastslå
in vitro Hotell og
in vivo
anti-kreft aktivitet og farmakologiske egenskapene til 3,4-dimethoxy-
N
-[(2,2-dimethyl-
2H
-chromen-6-yl)methyl]-
N
-phenylbenzenesulfonamide, KCN1. I denne studien undersøkte vi
in vitro
aktivitet KCN1 på celleproliferasjon og cellesyklus distribusjon av kreft i bukspyttkjertelen celler, ved hjelp av MTT og BrdUrd analyser, og flowcytometri.
in vivo
anti-kreft effekt av KCN1 ble evaluert i to forskjellige xenograft modeller av kreft i bukspyttkjertelen. Vi har også utviklet en HPLC-metode for kvantifisering av forbindelsen, og undersøkt med dens stabilitet i museplasma, plasmaproteinbinding, og degradering av mus S9 mikrosomale enzymer. Videre undersøkte vi farmakokinetikken til KCN1 etter intravenøs eller intraperitoneal injeksjon i mus. Resultatene viste at i en doseavhengig måte, KCN1 hemmet cellevekst og indusert cellesyklus arrest i menneskelige kreft i bukspyttkjertelen celler
in vitro
, og viste
in vivo
kreft effekt hos mus med Panc -1 eller Mia Paca-2 tumorxenotransplantater. HPLC-metoden gitt lineær påvisning av KCN1 i alle matrisene i området fra 0,1 til 100 uM, og hadde en lavere deteksjonsgrense på 0,085 uM i museplasma. KCN1 var veldig stabil i mus plasma, omfattende plasma bundet, og metaboliseres av S9 mikrosomale enzymer. De farmakokinetiske studier indikerte at KCN1 kunne påvises i alle de undersøkte vev, de fleste i minst 24 timer. I konklusjonen, våre prekliniske data indikerer at KCN1 er en potensiell terapeutisk middel for kreft i bukspyttkjertelen, noe som gir et grunnlag for fremtidig utvikling
Citation. Wang W, Ao L, Rayburn ER, Xu H, Zhang X, Zhang X, et al. (2012) KCN1, en roman syntetisk sulfonamide Anticancer Agent:
In Vitro Hotell og
In Vivo
Anti-kreft i bukspyttkjertelen Aktiviteter og Preklinisk Pharmacology. PLoS ONE 7 (9): e44883. doi: 10,1371 /journal.pone.0044883
Redaktør: Aamir Ahmad, Wayne State University School of Medicine, USA
mottatt: 16 februar 2012; Godkjent: 15 august 2012; Publisert: 13.09.2012
Copyright: © Wang et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av en National Institutes of Health stipend R01 CA116804 (til EGVM). RZ ble også støttet av National Institutes of Health gir R01 CA112029 og R01 CA121211. EGVM ble også støttet av EmTechBio, Universitetet forskningsutvalg Emory University, hjernesvulst Foundation for Children, og V-stiftelsen for Cancer Research. HW ble støttet av de hundre talenter Program, Chinese Academy of Sciences, tilskudd fra National Nature Science Foundation (30870513, 31070680, 91029715 og 81025017) og departementet for vitenskap og teknologi i Kina (2007CB947100), National Science and Technology Major Prosjekt Key Nye Drug Creation and Manufacturing Program 2009ZX09102-114, 2009ZX09301-011). MW ble støttet av National Institutes of Health stipend R01 CA91980. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Kreft er fortsatt et stort folkehelseproblem over hele verden. Det er økende pre-kliniske og kliniske funn som utkonkurrerte prognosen for pasienter diagnostisert med kreft, spesielt brystkreft og prostatakreft. I motsetning til dette har det vært bare minimale forbedringer i resultat for pasienter med kreft i bukspyttkjertelen. Kreft i bukspyttkjertelen er preget av sin invasiv natur, evnen til å unngå aggressiv behandling, og ofte sent stadium diagnose [1]. Dødeligheten for kreft i bukspyttkjertelen er fortsatt høy, med en gjennomsnittlig overlevelse på bare 10 måneder etter diagnose [1] – [4]. Det er et presserende behov for utvikling av nye effektive og trygge midler for behandling av bukspyttkjertelkreft.
Vi har vært interessert i å utvikle nye kreft terapeutiske midler for kreft hos mennesker uten strøm effektiv behandling, for eksempel hjernesvulst og kreft i bukspyttkjertelen. En unik funksjon i solide kreftformer er at den raske veksten ofte resulterer i redusert oksygen tilgjengelighet grunnet dannelsen av utilstrekkelig eller avvikende blodkar [5]. Hypoksisk fraksjon av faste tumorer er resistent overfor radioterapi [6] og konvensjonell kjemoterapi [7] – [10], og hypoksi korrelerer med dårlig resultat terapeutisk [7], [8], [11], [12]. På molekylært nivå, har transkripsjonsfaktor hypoksi induserbar faktor-1 (HIF-1) blitt identifisert som nøkkelen orchestrator av den biologiske respons på hypoksi på grunn av sin transaktivering av gener som er involvert i mange aspekter av ondartet tumorvekst fra celleoverlevelse og metabolisme til angiogenese og invasjon [13] – [16]. Overekspresjon av HIF-1 resultater i konstitutiv aktivering av sine mål trasé [13] – [18]. HIF-1 er en heterodimer transkripsjonsfaktor som består av to subenheter, HIF-1a, som er oksygen-regulert, og HIF-1β, som blir konstitutivt uttrykt. Flere hemmere rettet mot HIF-1α uttrykk eller dets aktiviteter har blitt utviklet for behandling av kreft; imidlertid har ingen av disse forbindelser har ennå ikke vært vellykket på grunn av forbindelsen toksisitet, begrenset aktivitet, eller dårlige farmakologiske egenskaper [18] – [25]. Vi har nylig utviklet en ny syntetisk arylsulfonamid, betegnet KCN1 (fig. 1A) som opprinnelig var tenkt å målrette HIF-1α pathway. Men i de senere studier, KCN1 har vist seg å utøve sin anti-canceraktiviteter under begge normoksisk og hypoksiske forhold i humane glioma kreftcellelinjer [26] – [31]. Våre påfølgende mekanistiske studier har indikert at KCN1 har betydelige HIF-1a-uavhengig cytostatisk aktiviteter. Denne studien er designet for å bestemme
in vitro Hotell og
in vivo
anti-kreft aktivitet av KCN1 i kreft i bukspyttkjertelen og dens farmakologiske egenskapene.
(A) Kjemisk struktur av KCN1. (B) Cell vekst hemmende aktivitet av KCN1 i menneskelige kreft i bukspyttkjertelen celler. Celler ble eksponert for forskjellige konsentrasjoner av KCN1 i 72 timer, etterfulgt av et MTT-assay. (C) cellevekst inhiberende aktivitet av KCN1 i en tidsavhengig måte. Celler ble utsatt for KCN1 for forskjellige tidspunkter, etterfulgt av et MTT-assay. (D) Hemming av forankringsuavhengig vekst av KCN1 i kreft i bukspyttkjertelen celler. Celler ble behandlet med forskjellige konsentrasjoner av KCN1 i myk agar. Kulturene ble opprettholdt i inkubator i to uker, deretter cellekolonier ble observert og avsluttet under et mikroskop. (E) Anti-proliferativ effekt av KCN1 på menneskelige kreft i bukspyttkjertelen celler. Celler ble eksponert for forskjellige konsentrasjoner av KCN1 til 24 timer, etterfulgt av måling av celleproliferasjon ved bruk av BrdUrd analysen. Indeksen spredning ble beregnet mot ubehandlede kontrollceller. (F) apoptotisk effekt av KCN1 på menneskelige kreft i bukspyttkjertelen celler. Celler ble eksponert for forskjellige konsentrasjoner av KCN1 i 48 timer, etterfulgt av måling av apoptose ved en Annexin V-analyse. Den apoptotiske indeksen ble beregnet mot ubehandlede kontrollceller. Alle analyser ble utført i tre eksemplarer. (
# p 0,05, * p 0,01).
Fordi fordeling og disponering av en agent i kroppen er avgjørende for å bestemme sin effekt og giftighet, tidlig farmakokinetiske studier er av stor betydning for legemiddelutvikling [32], [33]. Slike studier kan gi informasjon om den mest effektive ruten og hyppigheten av administrasjonen, så vel som en indikasjon på hvor effektiv agent vil være mot svulster på forskjellige steder i kroppen. De kan også indikere mulige områder for narkotika akkumulering og /eller toksisitet [32], [33]. I denne studien, forsøkte vi å karakterisere de farmakologiske egenskapene til KCN1 i preklinisk setting, med hensyn til sin plasma stabilitet, plasma protein binding, biotilgjengelighet, og fordeling etter systemisk administrasjon til mus. Disse resultatene viser at anti-tumor effekt og gunstige farmakologiske egenskapene av denne romanen agent, som støtter den videre utviklingen mot klinikkforsøk.
Resultater
KCN1 har
in vitro
Anti- kreft aktivitet mot kreft i bukspyttkjertelen celler
Hemming av kreft cellevekst.
in vitro
anti-kreft aktivitet av KCN1 ble vurdert ved hjelp av MTT analysen. Fire humane bukspyttkjertel cancer-cellelinjer (HPAC, Panc-1, BxPC3, og Mia Paca-2) ble dyrket sammen med forbindelsen ved forskjellige konsentrasjoner i området fra 0-100 uM i 72 timer, og cellelevedyktigheten ble bestemt. De inhiberende virkninger av forbindelsene på cellevekst ble illustrert på fig. 1B. KCN1 hemmet veksten av kreft celler på en doseavhengig måte, står for 83% (P 0,01), 53% (P 0,01), 81% (P 0,01) og 61% (P 0,01) inhibering ved 100 uM i den VVS, Panc-1, BxPC3, og Mia Paca-2 celler, henholdsvis. Den Panc-1 cellelinjen er kjent for å uttrykke den flermedisinresistens tilknyttet protein 1 (MRP1) og er kjent for å vise resistens overfor mange former for kreft terapeutiske legemidler. Dette kan være årsaken til at de var mer resistente mot KCN1 behandling sammenlignet med andre celler. Fig. 1C viste tidsforløpet for vekstinhibering med KCN1 behandling i alle fire cellelinjer, noe som tyder på den respektive følsomheten til forbindelsen som BxPC3 VVS Mia Paca-2 Panc-1. Som vist på fig. 1D, HPAC og PANC-1cells ble suspendert i myk agar og kolonier ble nummerert etter 14 dagers inkubasjon av KCN1. KCN1 redusert antall kolonier dannet i HPAC og PANC-1-celler med henholdsvis 4- og 3-fold,.
Inhibering av kreftcellevekst.
Den doseavhengige effekt av KCN1 videre celle proliferasjon ble undersøkt med en BrdUrd inkorporering assay (fig. 1E). Den anti-proliferative effekter ble observert i alle de fire cellelinjer. Ved en konsentrasjon på 50 uM, KCN1 hemmet proliferasjonen av ca 80% (P 0,01), 56% (P 0,01), 88% (P 0,01) og 60% (P 0,01) i HPAC, Panc- 1, BxPC3 og Mia Paca-2-celler, respektivt. BxPC3 cellene mer følsomme for KCN1 behandling på høyeste konsentrasjon enn de andre tre cellelinjer.
Påvirkning av apoptose.
Vi har også examinedwhetherKCN1 hatt en effekt på celle apoptose i kreft i bukspyttkjertelen celler (Fig . 1F). Etter en 48 timers behandling, viste KCN1 neglisjerbare eller svake apoptotiske effekter etter eksponering til en 50 mM konsentrasjon av forbindelsen. KCN1 var i stand til å indusere apoptose bare i VVS-celler (apoptotiske Indeks: 1,4 ganger). Stoffet viste ingen påvisbar apoptotisk aktivitet i de andre tre cellelinjer. Disse resultatene indikerte at induksjon av apoptose kan ikke være de viktigste anticancer mekanismer for KCN1.
cellesyklus-stans i G1 fase.
I de fire forskjellige bukspyttkjertelcancercellelinjer, etter 24 timers behandling, KCN1 signifikant induserte cellesyklusarrest i G1 fase på en doseavhengig måte, med innledende effekter begynner ved 5 uM i HPAC (P 0,01), BxPC3 (P 0,01), og Mia Paca-2 (P 0,01 ) celler, og 12,5 pM i Panc-1 (P 0,01)-celler (tabell 1). Resultatene indikerte at induksjon av cellesyklus arrest kan være en stor anti-kreft mekanisme for KCN1.
KCN1 modulerer Uttrykk av cellesyklus relaterte Proteiner
Vi har undersøkt mulige mekanismer ansvarlig for den anti-proliferative og cellesyklusregulerende virkninger av KCN1 ved å evaluere dens virkninger på ekspresjonsnivået av forskjellige proteiner involvert i regulering av celleproliferasjon og cellesyklusprogresjon (fig. 2). I alle fire cellelinjer, ved behandling med KCN1 (12 timer og 24 timer) førte til forskjellige nivåer av redusert ekspresjon av cellesyklus regulatorer E2F1, Cdk2, Cdk4, CDK6, Cdc25c, syklin D1, og syklin E. I motsetning til dette eksponering til KCN1 økt ekspresjon av p21 og p27 i alle fire cellelinjer. Disse proteinene er hovedsakelig involvert i cellesyklusprogresjon og sjekk-punkt kontroll. Disse resultatene viser videre at KCN1 utøver sin anti-kreft-aktivitet gjennom cellesyklus-stans.
HPAC, Panc-1, Mia Paca-2 og BxPC3 kreft i bukspyttkjertelen celler ble utsatt for en rekke konsentrasjoner av forbindelsen for 12 eller 24 t, og deretter målrette proteiner knyttet til cellesyklusprogresjon ble undersøkt ved Western blotting.
KCN1 hemmer veksten av xenografttumorer
for å avgjøre hvorvidt forbindelsen var effektiv mot
in vivo
svulster, vurderte vi anti-tumor effekt av systemisk levering av KCN1 mot Mia Paca-2 subkutan xenograft modeller Panc-1 og i
nu /nu
mus. Systemisk intraperitoneal (i.p.) behandling med KCN1 (30 eller 60 mg /kg i en 01:01 Cremophor: etanol formulering, 5 dager /uke) ble initiert når tumorvolumet nådde ~ 100 mm
3
. Forbindelsen betydelig redusert veksten av pankreas xenografttumorer på en doseavhengig måte. I Panc-en xenograft modell, tumorvekst inhibering av ca. 46% (P 0,01) ble observert ved /dose 30 mg kg og 61% (P 0,01) ved /kg dose 60 mg på dag 21 (figur . 3A1). Lignende resultater ble observert i Mia Paca-2 xenograft modell. Denne modellen viste seg å være nesten tilsvarende følsom for medikamentet, med lav dose (30 mg /kg) og høy dose (60 mg /kg) reduksjon av tumorvekst med ca 43% (P 0,01) og 57% (P 0,01 ), henholdsvis (fig. 3b1). I tillegg var det ingen signifikante forskjeller i kroppsvekt mellom kontroller og dyr behandlet med KCN1 i begge xenograft modeller (fig. 3A2 og B2), som indikerer ingen åpenbar vert toksisitet ved terapeutiske doser av KCN1.
KCN1 ble administrert av ip injeksjon til nakne mus med Panc-1 (A1) eller Mia Paca-2 (B1) xenografttumorer. KCN1 ble administrert ved i.p. injeksjon i doser på 30 og 60 mg /kg /d, 5 dager /uke i 3 uker for Panc-1 xenograft modell og 6 uker for Mia Paca-2 xenograft modell, henholdsvis. Kontrollgrupper fikk bare kjøretøy. Svulster volum ble målt hver tredje dag. Dyrene ble også overvåkes for endringer i kroppsvekt som en surrogatmarkør for toksisitet når det ble administrert til nakne mus med (A2) Panc-1 eller (B2) Mia Paca-2 xenografttumorer.
En HPLC metode for KCN-1 Analyse er utviklet og validert
HPLC-metoden ga en lineær kalibreringskurve i mus plasma for det undersøkte konsentrasjonsområde av 0,1-100 mikrometer. Gjennomsnittlig korrelasjonskoeffisient (
r
2) for daglige kalibreringskurver var = 1,000. Kalibreringskurver ble også produsert i homogenater av forskjellige musevev, inkludert hjerne, skjelettmuskel, nyrer, lunger, milt, hjerte og, som hadde korrelasjonskoeffisienter på minst 0,992 for de samme konsentrasjoner. Nøyaktighet, presisjon, intra-dag og inter-dagers variasjoner var akseptabelt, med variasjonskoeffisient (CV) mellom 4,25% og 12,62%, og den nedre deteksjonsgrense (LOD) i plasma var 0,085 mikrometer. Gjenvinningen av forbindelsen i de forskjellige matriser varierte fra ~96% til ~107%. Representative kromatogrammer av blank museplasma, kontroll mus plasma tilsatt 1, 5, 25, og 50 uM KCN1 er vist i fig. 4A-E. Liknende kromatogrammene ble oppnådd for de andre undersøkte vev (data ikke vist). Spesifisitet ble demonstrert ved fravær av ethvert endogent innblanding i biologiske prøver ved retensjonstid på toppene av KCN1.
(A) KCN1 i kontroll (stoff-fri) mus plasma og museplasma tilsatt for å inneholde 1, 5, 25, og 50 uM KCN1; En blank plasmaprøve mus og mus plasmaprøven tilsatt 1 mM (B), 5 um (C), 25 pM (D), og 50 uM (E) KCN1.
KCN1 er stabil i Plasma mus ved forskjellige temperaturer for lengre varigheter
KCN1 var stabil i museplasma ved 37 ° C, med mer enn 80% av forbindelsen som blir igjen etter en 8 timers inkubasjon for både lav (1 uM) og høy ( 10 mm) konsentrasjoner. Vi fant også at KCN1 kan lagres ved 4 ° C i minst 24 timer med mer enn 90% av forbindelsen gjenværende (fig. 5A1), eller ved 37 ° C i minst 8 timer med mer enn 85% av forbindelsen resterende (fig. 5A2), eller ved -80 ° C i opp til 4 uker med mer enn 92% av forbindelsen resterende (fig. 5a3).
Stabilitet av KCN1 i museplasma ved 37 ° C ( A1), 4 ° C (A2), og -80 ° C (A3). (B) Nedbrytning av KCN1 av isolerte musen S9 leverfraksjoner.
KCN1 bindes til plasmaproteiner Utstrakt
KCN1 bundet omfattende til proteiner i mus plasma, med lav (1,0 mm) og høy (10,0 mm) konsentrasjoner demonstrere 90,96% og 99,32% av forbindelsen binding til plasmaproteiner, henholdsvis.
KCN-en metaboliseres av S9 Enzymer (fase i)
Fordi KCN1 dukket å være omfattende metabolisert eller degradert i mus plasma, utførte vi en forstudie av potensialet mekanismen (e) der KCN1 metaboliseres hjelp av S9-analysen. Denne analysen kan brukes til å bestemme hvorvidt forbindelsen metaboliseres
via
fase I (NADPH-regenererende systemer) eller fase II (UDPGA og PAPS) enzymer utvunnet fra mus mikrosomer. S9 studier indikerte at KCN1 har en relativt lang halveringstid i nærvær av fase II (konjugasjon) mikrosomale enzymer. Det var imidlertid en mer enn 60% reduksjon i mengden av KCN1 observert når det ble inkubert med mus fase I (oksidasjon) enzymer (fig. 5B), noe som tyder på at det sannsynligvis er metabolisert av fase I enzym (er).
KCN1 har en lang halveringstid og Wide Tissue distribusjon i mus etter intravenøs og Intraperitoneal administrasjonene
Analyse av plasmaprøver innsamlet fra mus dosert med KCN1 (35 mg /kg) viste at plasmakonsentrasjonen av forbindelsen var fremdeles detekterbare for begge stammer i minst 6 timer etter intravenøs (IV) injeksjon, og var detekterbare etter enda 24 timer etter intraperitoneal (IP) administrering (fig. 6A og 6B). Etter bolus I.V. administrering er plasmakonsentrasjonen var større enn 5 pg /mL i 5 minutter for både CD-1 (9,98 mg /ml) og nakne mus (5,19 ug /ml). Disse nivåene gikk ned til 0,3 mg /ml ved 6 timer etter dosering i begge stammer. Etter I.P. dosering var plasmanivået nådde sitt maksimum ved 30 minutter i CD-1 mus og ved 2 timer i nakne mus. Overall, I.V. administrasjon ga høyere plasma AUC og C
max verdier, men lavere T
1/2 verdier i forhold til I.P. administreringsmåte (Tabell 2).
plasmakonsentrasjon-tidskurver for KCN1 følgende (A) IV og (b) IP-injeksjon av 35 mg /kg i CD-1 og nakne (nu /nu) mus. Tidsavhengig fordeling av KCN1 i forskjellige vev følgende (C) IV-administrering eller (D) IP administrasjon av 35 mg /kg av forbindelsen. Kolonnene representerer nakne mus, mens pyramidene representerer CD-1 mus.
Av interesse, KCN1 kunne påvises i de fleste av de samplede vev (hjerte, lunger, lever, milt, nyrer og skjelettmuskel fig. 6C og 6D) i begge stammer i minst 24 timer etter administrasjon av en rute. Imidlertid forbindelsen kunne ikke oppdages etter 6 timer i hjernen av enten stamme av mus etter enten administrasjonsmåte. Farmakokinetiske parametre ble beregnet for plasma og de forskjellige vev (tabell 2). De høyeste AUC-verdier i både naken og CD-1 mus etter I.V. injeksjon var i lunger, lever og milt, og vev med lavest AUC-verdiene etter I.V. injeksjon var plasma, hjerne og skjelettmuskulatur. Den høye konsentrasjon observert i lungene etter I.V. injeksjon var sannsynligvis på grunn av opphopning av utfelt stoff, selv om dette ikke ble verifisert eksperimentelt. I begge stammer av mus, milten hadde den høyeste AUC følgende I.P. injeksjon, etterfulgt av leveren. Plasma og hjernen hadde lavest AUC-verdier for begge stammer følgende I.P. injeksjon.
Av 35 mg /kg av KCN1 administrert intravenøst, mindre enn 1% av den totale KCN1 dosen ble utvunnet som foreldre KCN1 fra urinen til både CD-1 og nakne mus i løpet av den første 24-timers med mindre enn 0,5% som utvinnes fra begge stammer følgende IP injeksjon. Omtrent 1% av den første dosen av foreldre forbindelse ble gjenfunnet i feces av mus etter I.P. injeksjon, og mindre enn 1% ble gjenvunnet etter I.V. injeksjon (data ikke vist).
Diskusjoner
HIF pathway hemmere representerer en roman målrettet terapeutisk middel. Selv om suksessen har vært sett ved hjelp av midler rettet mot enkeltmolekyler (f.eks Herceptin, Glivec), er disse agentene vanligvis begrenset med hensyn til hvilke typer kreft, og for å underklasser innenfor typer kreft, som kan behandles. Fordi KCN1 hemmer en fysiologisk prosess (hypoksi) som er iboende i dannelsen av tumorer, i stedet for en krefttype-bestemt mål, kan midlet potensielt brukes til å behandle en rekke forskjellige krefttyper, inkludert de som det er for tiden ingen effektiv behandlinger, særlig kreft i bukspyttkjertelen.
test~~POS=TRUNC forbindelsen~~POS=HEADCOMP KCN1 ble opprinnelig designet som en HIF-1α-hemmer, men dens hemmende effekt på celledeling og vekst førte oss til å spekulere i om det kan ha en effekt under normoksiske tilstand. HIF-1α spiller også en viktig rolle i regulering av cellesyklusen. Under hypoksiske forhold, blir det stabilisert fører til svulst overlevelse
via
økt angiogenese og anaerob glykolyse. Overraskende, HIF-1α også up-regulerer gener som fremmer cellesyklus og apoptose, slik som p21, p27, p53 [34], [35]. I lys av dette, fordelene ved HIF-1α inhibering i cancerterapi synes tvilsom som det kan oppheve cellesyklus-stans i henhold hypoksiske betingelser og forhindre celledød. Disse motstridende effekter kan begrense den anti-kreft effekt av HIF-1α inhibitorer [34], [35]. Men hvis HIF-1α-hemmere har den ekstra effekten av å indusere cellesyklus arrest eller celledød, kan de være bedre forslag som anti-kreft agenter. Dermed er det viktig samtidig utvikle HIF-1α hemmere som anti-kreft agenter for å vurdere deres effekter på cellesyklus og celledød.
Den aktuelle studien er den første til å systematisk undersøke
in vitro
og
in vivo
anti-tumor effekter av KCN1 i kreft i bukspyttkjertelen celler i en HIF-1α-uavhengig måte. Vi observerte at KCN1 betydelig redusert bukspyttkjertelkreft cellevekst og spredning, og førte til cellesyklus arrest etter normoksiske (20% O
2) dyrkningsforhold. Etter å evaluere effekten av forbindelsen på
in vitro
proliferasjon, cellesyklusprogresjon og apoptose, konkluderte vi med at cellesyklus-stans var den viktigste mekanisme ved hjelp av hvilken forbindelsen utøver sin cytostatisk effekt i cellekultur. Cellesyklus-stans er en av de mest effektive strategier for å inhibere tumorvekst [36]. I denne studien fant vi at KCN1-mediert cellesyklus arrest ble oppnådd
via
en modulering av cyclin kinase inhibitor (CKI) – cyclin- cyclin-avhengig kinase (CDK) maskiner som opererer i G1 fasen av cellesyklusen. En familie av protein kinase komplekser orkestrerer cellecyklusprogresjonen i eukaryoter [37]. Hvert kompleks er sammensatt minimalt av en katalytisk subenhet, CDK, og dens vesentlige aktive partner, cyclin. Forskjellige kombinasjoner av cykliner og cdks tak i cellesyklus ved forskjellige punkter [37]. For eksempel er Cyclin E uttrykt forbigående i løpet av G1 /S overgang og er hurtig nedbrutt når cellen går inn i S-fasen [38]. Cyclin E regulerer Cdk2 mens cyclin D1 regulerer Cdk4 og CDK6 [38]. Disse kompleksene blir aktivert ved forskjellige kontrollposter etter bestemte intervaller i løpet av cellesyklusen, men kan også fremkalles og reguleres av eksogene faktorer [37] – [39]. Den CDK utsettes for inhibering av bindingen av CKI slik som CIP /KIP (p21, p27) og INK4 familier av proteiner [37] – [39]. Transkripsjon av gener som er nødvendige for G1 /S overgang for eksempel cyklin E og syklin D1 er initiert av E2F1, som er under kontroll av Rb-tumor suppressor [37] – [39]. I denne studien undersøkte vi påvirkning av KCN1 på ekspresjonen av flere proteiner kjent for å være involvert i disse prosessene. I alle fire bukspyttkjertelkreft cellelinjer som ble testet, fant vi redusert uttrykk av celle cycleproteins, inkludert E2F1, Cyclin D1, Cyclin E, Cdk2, Cdk4 og CDK6, og økt uttrykk av p21 og p27. Mens KCN1 indusert cellesyklus arrest i bukspyttkjertelen kreft cellelinjer, det hadde liten cytostatisk effekt på glioma celler og udødelig fibroblaster, noe som tyder på at dens virkninger kan være celletype avhengig [31]. For å bekrefte den terapeutiske effekten av det sammensatte, ble det også undersøkt for
in vivo
effekter. KCN1 redusert vekst av både Panc-1 og Mia Paca-2 xenografttumorer.
Siden det ikke finnes publiserte rapporter om farmakokinetikk, toksisitet, eller biotilgjengelighet av KCN1, vi foretatt en evaluering av disse farmakologiske egenskaper. Vi har utviklet en passende HPLC-metode for påvisning av KCN1 i forskjellige biologiske matriser, og viste at KCN1 er stabil i mus plasma (fig. 5A1-A3), at det er i stor utstrekning bundet til plasmaproteiner, som det er sannsynlig metaboliseres av fase I enzym (er) (fig. 5B), og at det fordeles til forskjellige musevev etter at både IV og I.P. administrasjon (Fig. 6 og tabell 2). Vår første farmakologiske studier avdekket flere interessante egenskaper om KCN1. For det første var utstrakt akkumulering av forbindelsen i lungene hos mus etter I.V. injeksjon, og i milten og leveren hos mus etter I.P. injeksjon. Fremtidige studier er nødvendig for å fastslå mekanismene for den unike distribusjon mønster av dette stoffet. Det ble administrert intraperitonealt i en dose på opptil 60 mg /kg daglig i en cremophor: etanol formulering i opp til 12 uker, og dette regimet ble godt tolerert av dyrene. Det var ingen åpenbare tegn på toksisitet i disse dyrene, og deres oppførsel og utseende var skjelnes fra kontrolldyrene. Våre foreløpige analyser viste at verdiene av blodcellepopulasjoner og blod kjemi var innenfor normale grenser (data ikke vist). I tillegg patologisk undersøkelse av de viktigste organer ved obduksjon viste ingen ultra strukturelle endringer i hjerne, nyrer, lunger eller mage-tarmkanalen (data ikke vist). Leveren er det eneste organ der en behandlingsrelatert endring ble observert. Hevelse ble observert i leveren hos dyrene på obduksjon, ble vev ødem med gallegang stasis indikert med patologisk undersøkelse, men uten noen bevis på hepatocytter død. Den observerte hevelse i leveren ble tilbakeført i mus i løpet av 2-3 uker etter avsluttet behandling, og kan har blitt forårsaket av Cremophor. Etanol formulering, som kan forstyrre leverblodstrøm [40] – [42]
det andre punktet av interesse er at det var forskjeller i farmakokinetikken til KCN1 mellom CD-en og nakne mus. Mens noen av disse forskjellene kan ha vært på grunn av normale variasjoner mellom mus, forskjeller i den tiden av året (sesong) da studiene ble gjort, og forskjeller på grunn av kilden til mus (Harlan vs. Frederick), noen av forskjeller mellom stammer av mus ble fortsatt er verdt å merke seg. For eksempel, CD-1 mus viste en mye høyere konsentrasjon i lungene enn de nakne mus, til tross mottar den samme dose. Men i de fleste tilfeller er det nakne mus viste en høyere opptak av midlet til de forskjellige undersøkte vev (lever, nyrer, milt, hjerte, skjelettmuskel, og hjernen). Det var også forskjeller i intraperitoneal biotilgjengeligheten av KCN1, med forbindelsen absorberes mye bedre etter intraperitoneal injeksjon i nakne mus sammenlignet med CD-1 mus. Denne økte biotilgjengeligheten var trolig ansvarlig for høyere opptak vev. Ved lignende resultater er funnet i gjentatte studier, vil det være nødvendig å belyse mekanismen (e) den underliggende slike forskjeller i opptak, for å bestemme hvorvidt slike faktorer er sannsynligvis å påvirke farmakokinetikken til KCN1 i andre arter, inkludert mennesker. Videre, mens CD-1 mus blir ofte brukt for å evaluere farmakokinetikken til nye forbindelser, nakne mus er de mest brukte musestamme for anti-kreft-effektivitetsstudier. Forskjeller i farmakokinetikk mellom stammene kan føre til over- eller undervurdering av effekt eller bivirkninger av en sammensatt.
Vi har også registrert at KCN1 tilsynelatende gjennomgår enterohepatisk resirkulasjon. Ikke bare var forbindelsen fortsatt til stede i mange vev, men i noen tilfeller var det høyere ved 24 timer enn ved 4 eller 6 timer (for eksempel av lever og milt). I tillegg KCN1 var fremdeles påvisbar på et lavt nivå i minst fem dager etter intraperitoneal dosering (data ikke vist). Disse funnene tyder på at det kan være mulig å gi KCN1 forholdsvis sjelden, fordi forbindelsen kan forbli i målvevet i flere dager. Det vil imidlertid være nødvendig å sikre at forbindelsen ikke utøver toksiske effekter på lever, galleblære eller annet vev som er utsatt for høy konsentrasjon av forbindelsen i lengre perioder av gangen.
I tillegg til endringer i frekvens dosering for effektivitetsstudier, endring av formuleringen kan også forbedre aktiviteten av forbindelsen. Selv om forbindelsen var effektiv når det ble administrert I.P. i Cremophor: etanol, er preparatet ikke ideelt. Enda viktigere, mens KCN1 selv ikke synes å utøve noen vesentlig bivirkning, bilen førte til leveren hevelse etter flere uker med dosering i kontrolldyrene. Således endrer preparatet kan redusere giftigheten av forbindelsen, og det er mulig at optimalisering av formulering og administrering av forbindelsen vil også forbedre sin anti-kreft effekt.
Oppsummert har vi demonstrert at KCN1 mulig utøve potente cytotoksiske og celleproliferasjonsprosesser hemming effekter mot kreft i bukspyttkjertelen celler, og førte til nedregulering av viktige onkogene og pro-vekst /pro-spredning proteiner. Vi har presentert en gyldig fremgangsmåte for å detektere og kvantifisere KCN1 i forskjellige matriser. Vi har også presentert innledende farmakokinetiske data om forbindelsen, noe som indikerer at det er godt fordelt, stabil og detekterbar i forskjellige vev i en relativt lang tidsperiode. Informasjonen som genereres i denne studien vil være nyttig for den videre utviklingen av det sammensatte.
Materialer og metoder
Kjemikalier og reagenser
KCN1 ble syntetisert og renset som tidligere rapportert [ ,,,0],29], [43] – [44], og strukturen ble bekreftet ved hjelp av UV, IR, MS og NMR-spektroskopi. Renheten av forbindelsen ble bestemt til å være større enn 99%.
Alle kjemikalier og oppløsningsmidler som benyttes for prøvepreparering og væskekromatografi (HPLC) analyse var av analytisk kvalitet. Metanol (HPLC-kvalitet) ble kjøpt fra Fisher Chemicals (Fairlawn, NJ) og trietylamin ble kjøpt fra Sigma (St. Louis, MO).
