Abstract
ovarialcancer (EOC) er den mest dødelige av alle gynekologiske krefttyper, og omfatter distinkte histologiske subtyper som har spesifikke genetiske og vev-of-opprinnelse forskjeller. Ovarian klarcellet karsinom (OCCC) utgjør ca 10% av tilfellene, og er blitt kalt en stress responsive kreft. OCCC er karakterisert ved øket ekspresjon av oksidativt stress og glykolyse-relaterte gener. I denne studien hypotese vi at bioenergetisk profilering kan entydig skille OCCC fra andre EOC histologiske subtyper. Ved hjelp av et ekstracellulært fluks analysator, OCCC linjer (ES-2, TOV-21-G) ble vist å være meget metabolsk aktive, med høyt oksygenforbruksrate (OCR) og høy ekstracellulær surgjøring rate (ECAR), en indikasjon på forbedret mitokondriell oksidativ fosforylering og glycolytic rate, henholdsvis. En høy bioenergi profilen ble assosiert med cellelinjene evne til å danne forankrings uavhengige kuler. På grunn av deres høye glykolytisk og mitokondrielle aktivitet, OCCC-celler viste sterk følsomhet for 2-deoksy-D-glukose og rotenon veksthemming, selv om dette kjemosensitivitet profilen ikke er spesifikke for bare OCCC celler. Bioenergetisk profilering også identifisert en ikke-OCCC cellelinje, OVCA420, for å ha alvorlig kompromittert mitokondrienes funksjon, basert på lav OCR og mangel på stimulering av maksimal respirasjon etter påføring av uncoupler FCCP. Dette ble fulgt av mitokondrielle morfologi forandringer som indikerer forbedret fisjon, økt ekspresjon av mitokondriell fisjons protein Drp1, et tap av mitokondriemembranpotensialet og avhengighet av glykolyse. Viktigere var dette tapet av mitokondriefunksjon ledsages av den manglende evne av OVCA420 celler til å takle hypoksisk stress, og en svekket evne til å stabilisere HIF-1α i respons til 1% O
2 hypoksi. Denne kunnskapen kan være avgjørende for forskere planlegger å utnytte denne cellelinjen for videre studier av metabolisme og hypoksi, og antyder at endrede mitokondrielle fisjons dynamikk representerer en fenotype av en undergruppe EOCs
Citation. Dier U, Shin DH , Hemachandra LPMP, Uusitalo LM, Hempel N (2014) bioenergetikk av eggstokkreft cellelinjer: Profilering av Histologiske Subtyper og Identifisering av en Mitokondrier-Defekt Cell line. PLoS ONE 9 (5): e98479. doi: 10,1371 /journal.pone.0098479
Redaktør: Jianhua Zhang, University of Alabama i Birmingham, USA
mottatt: 07.01.2014; Godkjent: 02.05.2014; Publisert: May 23, 2014
Copyright: © 2014 Dier et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health (NIH) gi R00CA143229 fra National Cancer Institute. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Eggstokkreft er fortsatt en av de dødeligste kreft hos kvinner, med liten forbedring i total overlevelse rapportert i løpet av de siste tre tiårene. Det er blitt klart at eggstokkreft er et vidt begrep som brukes for en rekke forskjellige sykdommer, som deler det samme anatomisk sted inne i intraperitoneal (IP) hulrom. De fem undergrupper av ovarialcancer (EOC) varierer betydelig i deres vev av opprinnelse, genomiske markører og avhengighet av forskjellige pro-tumorigent cellesignalveier [1] – [3]. Høy grad serøs eggstokkreft (SOC) er den mest vanlige histologisk subtype og kjennetegnes av høy frekvens i TP53 mutasjoner, genomisk instabilitet og for å være av egglederen opprinnelse [3], [4]. Eggstokk klare cellekreft (OCCC) utgjør ca 10% av EOC tilfeller i vestlige populasjoner (opp til 25% i asiatiske populasjoner) [5]. OCCCs ser ut til å bestå av heterogene subpopulasjoner som viser forskjellige grader av genomiske aberrasjoner [6]. Den vanligste er forbundet med den AT-rike samspill domene som inneholder protein 1A (ARID1A mutasjon ~ 50%) [7], [8] og PI3K pathway (PTEN tap ~40% [9], PIK3CA mutasjon [10]; akt2 amplifikasjon [5]). ARID1A mutasjoner har tillatt forskere å knytte tidlige OCCC lesjoner med endometrioid vev og endometriose cyster [8], [11].
Selv om det er betydelige forskjeller i genomiske avvik mellom enkelt OCCC prøven, Yamaguchi og kolleger har nylig rapportert en genuttrykk signatur som er unikt assosiert med OCCC [12]. Spesielt denne studien bekreftet andre rapporter som OCCC er karakterisert som en stress responsive kreft [12] – [14]. Høy ekspresjon av antioksidantenzymer og gener assosiert med glukosemetabolisme er også utbredt [12], [15]. Dette uttrykket profilen antas å representere tilpasninger av OCCC mot stressfaktorer av svulsten mikromiljøet, inkludert gratis-jern indusert Redox stress og inflammasjon [16]. Noen av disse uttrykk endringer er likeledes observert i endometriet cyster, som videre antyder at dette representerer den forløper vev av OCCC [12].
tidlig stadium OCCC pasienter generelt har et bedre overlevelse enn trinn SOC Pasienter med tidlig stadium III og IV OCCC er assosiert med dårlig overlevelse. I tillegg er mindre enn 10% av tilbakevendende OCCC svare på behandlingen, og denne histologisk subtype er blitt assosiert med høy cisplatin-motstand [5]. Gitt at det er betydelige forskjeller i OCCC genomet og ekspresjon profil i forhold til SOC, er det et behov for ytterligere å forstå de molekylære mekanismer som driver OCCC tumorigenesis og progresjon å skreddersy terapeutika for denne bestemte histologisk subtype. Gitt at OCCCs er preget av høy uttrykk for meklere i glykolysen, er målet med denne studien var å undersøke om OCCC cellelinjer også signifikant forskjellig i sin bioenergi profil i forhold til andre EOC celler i kultur. Ved hjelp av levende celle målinger av oksygenforbruk og ekstracellulære forsuring, kunne vi fastslå at OCCC cellelinjer er svært metabolsk. I tillegg har denne analysen avslørte en SOC cellelinje med defekt mitokondrienes funksjon, som manifestert i et tap i hypoksisk respons av disse cellene.
Materialer og metoder
Cellelinjer
OVCA420, OVCA429, OVCA433, DOV-13 og NOSE007 celler ble generøst tilveiebragt av dr Susan K. Murphy (Duke University) og dyrkes i RPMI 1640 inneholdende 10% føtalt bovint serum (FBS). OVCA420, OVCA429, OVCA433, DOV-13 celler ble opprinnelig isolert fra eggstokkreft pasient ascites [17], [18]. NIHOVCAR3 celler (refereres her som OVCAR3) og eggstokkene klart cellekreft cellelinjer ES-2 og TOV-21-G ble kjøpt fra ATCC. ES-2-celler ble dyrket i modifisert McCoys 5a-medium med 10% FBS. TOV-21-G ble cellene dyrket i en 01:01 blanding av MCDB 105 inneholdende 1,5 g /l natriumbikarbonat og Medium 199 inneholdende 2,2 g /l natriumbikarbonat, med 15% føtalt bovint serum. OVCAR3 celler ble holdt i RPMI 1640 inneholdende 0,01 mg /ml bovint insulin og 20% FBS. Glutamin og glukose deprivasjon ble utført ved hjelp av MP Biomedicals RPMI 1640 Medium, 1X Liq., W /o L-glutamin og glukose.
bioenergetikk av oksygenforbruk Rate (OCR) og ekstracellulære Forsuring Rate (ECAR)
The Seahorse XF24
3 ekstracellulær Flux Analyzer (Seahorse Bioscience, North Billerica, MA) ble brukt for å vurdere bioenergetisk fenotyper av eggstokkreft cellelinjer. Det ekstracellulære Flux Analyzer gir samtidig levende celle måling av oksygenforbruk rate (OCR), en indikator på mitokondrie respirasjon, og ekstracellulære forsuring rate (ECAR), en indikator på netto proton tap under glykolyse. Før starten av eksperimentet, ble cellene sådd ut jevnt (40000 celler /brønn, etter optimalisering av celle seeding nummer) i XF24 cellekulturplate og tillatt å feste i 24 timer. Cellekulturmedier ble erstattet med XF media (Seahorse Bioscience), mangler natriumbikarbonat og FBS, etter forutgående vask med XF media. Celler ble anbrakt i et ikke-CO
2 37 ° C inkubator i 1 time, før start av eksperimentet. OCR og ECAR ble målt over en 3 minutters periode, etterfulgt av 3 min å blande og re-oksygenering av media. Tre basaldosemålinger ble tatt før injeksjon av farmakologiske manipulatorer av mitokondrie respiratoriske kjeden proteiner, ellers kjent som mitokondrie stresstest. Flere Bioenergi parametre kan utledes ved å overvåke OCR som reaksjon på disse forbindelsene [19]. Etter etableringen av en basal OCR leser, blir Oligomycin A anvendes til å inhibere proton (H +) strømme gjennom ATP syntase, i det vesentlige blokkerer all ATP bundet oksygenforbruk. Maksimal åndedrett kan initieres ved å utsette cellene for å karbonyl cyanid-ptrifluoromethoxyphenyl hydrazon (FCCP), som er en ionofor som transporterer H + tvers av mitokondriemembranen som fører til kollaps av membranpotensial og hurtig forbruk av O
2. Antimycin forhindrer mitokondriell respirasjon ved å blokkere kompleks III (Ubiquinone: Cytokrom b-c kompleks). ATP-syntase inhibering ble oppnådd ved å injisere en uM Oligomycin A (Sigma), som ble etterfulgt av injeksjon av 750 nM FCCP (Sigma) for måling av maksimal OCR. Dette ble fulgt av tilsetning av 1 uM antimycin A (Sigma) for å slå av alle mitokondriell respirasjon. Tre målinger av OCR /ECAR ble oppnådd etter injeksjon av hvert legemiddel og legemiddelkonsentrasjon optimalisert på cellelinjer før eksperimenter. OCR og ECAR målinger ble normalisert til total protein nivåer (BCA protein assay, Pierce) i hver brønn. Hver cellelinje var representert i 5 brønner per eksperiment og replikere eksperimenter utført minst tre ganger. Basal respirasjon ble utledet ved å subtrahere det tredje OCR leser, følgende antimycin tillegg, fra den tredje basal OCR-leser. Åndedretts State tilsynelatende, en indikasjon på mitokondrie respiratoriske tilstand, ble beregnet ved hjelp av: 4- (Basal OCR-Oligo OCR) /(FCCP OCR-Oligo OCR) [20]. Før oppstart av disse eksperimentene doseresponskurver (100 nM-3 um) ble gjennomført for å fastslå konsentrasjonen av FCCP nødvendig for å oppnå maksimal OCR. Alle cellelinjer responderte ved å oppnå et platå av maksimal OCR på 750 nM FCCP, med hemming av OCR observert ved tre mikrometer i enkelte cellelinjer (OVCA429, Ovca433, Ovcar3, ES-2). OVCA420 cellene ikke svare på FCCP på noen av de konsentrasjonene som ble testet
Sanntids semi kvantitativ RT-PCR
Etter RNA isolasjon. (RNeasy Mini Kit, Qiagen) og revers transkripsjon ved hjelp iScript cDNA syntese (BioRad), sanntid semi-kvantitativ RT-PCR ble utført på et Applied Biosystems 7500 real Time PCR cycler, ved hjelp iTaq Universal SYBR Grønn Supermix (Bio-Rad). Følgende primerpar ble anvendt for semi-kvantitativ sanntids RT-PCR-analyse: HNF-1β sense: 5′-GCCCACACACCACTTACTTCG-3 «; HNF-1β antisense, 5»-GTCCGTCAGGTAAGCAGGGAC-3 «[21]. GLUT-en følelse 5»-CATCCTTATTGCCCAGGTGTTT-3 «; GLUT-1-antisense-5»-GAAGACGACACTGAGCAGCAGA-3 «[22]. Data ble analysert ved hjelp av sammenlignende CT-metoden med verdiene normalisert til p-Actin nivåer og uttrykt i forhold til nivåene i NOSE007 celler.
spheroid Formation analysen
eggstokkreft cellelinjer ble sådd (1000 celler /brønn) i 96 brønners rundbunnede ultra-lav feste (ULA) plater (Corning) og overvåkes med hensyn til sfæroide aggregatdannelse opp til dag 9 under vanlige kulturbetingelser (fullt supplert media, 37 ° C, 21% O
2, 5 % CO
2).
celleviabilitet analyser
Like antall celler ble sådd på 96 brønners plater og celle levedyktighet i respons på kjemoterapi målt etter 72 timers behandling med angitt doser. Cellelevedyktigheten ble bestemt ved krystall-fiolett-opptak. I korthet ble cellene farget med krystallfiolett i 10 minutter, etterfulgt av vasking i PBS og H
2O. Krystallfiolett fargestoff ble løslatt fra celler ved hjelp av 30% eddiksyre og absorbans målt ved 590 nm, ved hjelp av en SpectraMax Paradigm Molecular Devices mikroplateleser. Celleviabilitet ble uttrykt som prosentvis levedyktighet i forhold til ikke-behandlede celler. Cisplatin (cis-Diamineplatinum (II) diklorid), paclitaxel og 2-deoksy-D-glukose (2-DG) ble innkjøpt fra Sigma. Rotenon ble hentet fra Seahorse biovitenskap.
Mitotracker farging
Celler dyrket på dekk ble inkubert med 250 nM Mitotracker Red CMX ROS (Life Technologies) i 15 minutter, etterfulgt av vasking i PBS og fiksering med 4% paraformaldehyde. Prøvene ble montert på lysbilder ved hjelp Forleng Gold /DAPI (Life Technologies) og avbildes ved hjelp av en eVOSfl AMG LED-basert fluorescerende mikroskop (100x oljeneddyppingsobjektivet).
mtDNA /nDNA forholdet real time RT-PCR
for å kvantifisere mitokondrier DNA (mtDNA) og nukleært DNA (nDNA) samlet DNA fra eggstokkreft celler ble ekstrahert ved bruk av AllPrep DNA /RNA /Protein Mini Kit (Qiagen), som ble fortynnet til en sluttkonsentrasjon på 10 ng /ul. For å kvantifisere den relative mtDNA: nDNA forholdet følgende primere ble brukt; 16S rRNA-genet av mitokondriell (mt) DNA (sense: 5′-CCAAACCCACTCCACCTTAC-3 «, antisense: 5′-TCATCTTTCCCTTGCGGTA-3′); 18S rRNA av kjerne (n) DNA (sense: 5»-AGAAACGGCTACCACATCCA-3 «, antisense: 5′-CACCAGACTTGCCCTCCA-3») [23], [24]. CT verdier for mt16S og n18S ble oppnådd følgende Real time PCR på 50 ng total DNA ved hjelp iTaq Universal SYBR Grønn Supermix (Bio-Rad), ved en glødetemperatur på 59 ° C.
mitokondriemembranen potensial
Mitokondriell membranpotensialet ble målt ved hjelp av JC-1 fargestoff (5 «, 6,6′-tetraklor-1,1′, 3,3»-tetraethylbenzimidazolylcarbocyanine iodide, Life Technologies), i henhold til produsentens instruksjoner. I korthet ble cellene inkubert med 10 ug /ml JC-1 fargestoff i 15 minutter og fluorescens bilder tatt med et 20x objektiv. Forholdet mellom rød fluorescens JC-1 aggregater og grønne JC-1-monomerer ble målt ved bruk av bilde J, følgende bildebakgrunnskorrigering.
Clonogenicity
Cellene ble utsådd (100 celler /brønn) i en 6 brønn plate og dyrket i 10 dager under normale kultur forhold (21% O
2) eller hypoksi (1% O
2, Biospherix hypoksisk kammer). Clonogenicity ble vurdert ved farging kolonier med krystallfiolett og antall kolonier telles ved hjelp av Image J og data uttrykt som cellular overlevelse brøk.
Immunoblotting
Cellelinjer ble dyrket i 10 cm retter til sub-konfluens og lysert i RIPA-buffer (+ proteasehemmere), etterfulgt av elektroforese på 4-12% SDS-PAGE-geler (Bio-Rad). Etter vestlig overføring, ble membraner undersøkt med primær Anti-Drp1 antistoff (Millipore) eller GAPDH (Applied Biosystems-Life Technologies) over natten i 5% fettfri melk /TBS, 0,1% Tween 20. Følgende sekundær antistoffruge blotter ble visualisert ved hjelp av Femto eller Pico chemiluminescence substrat (Thermo Scientific). For HIF-1α-analyse ble celler dyrket under hypoksiske betingelser (1% O
2) i to timer. Cellene ble umiddelbart lysert i 2x SDS-prøvebuffer og like mengder lastet på SDS-PAGE (4-12%, Bio-Rad), etterfulgt av western transfer og immunoblotting for HIF-1α og β-aktin lasting kontroll. Anti-HIF-1α antistoff ble kjøpt fra BD Transduction Laboratories og β-actin antistoff fra Applied Biosystems-Life Technologies.
Data- og statistisk analyse
Alle data som presenteres er representative for minst tre replikere eksperimenter. Bilde J ble anvendt for å kvantifisere relative fluorescens og måle sfæroide område størrelse. Alle data er vist som gjennomsnitt ± standardavvik av gjennomsnittet. Statistiske data analyse (ANOVA med Tukey innlegg test, eller T-test) ble utført ved hjelp av GraphPad Prism programvare (v6), og data anses signifikant ved p . 0,05
Resultater
Åndedretts Profile for eggstokkreft cellelinjer
for å karakterisere bioenergi profilen til eggstokkreft cellelinjer vi benyttet et ekstracellulært flux analysator for å bestemme levende celle oksygenforbruk rate (OCR) og ekstracellulære forsuring rate (ECAR; Seahorse Bioscience). To OCCC cellelinjer, ES-2 og TOV-21-G ble sammenlignet med ikke-OCCC EOC cellelinjer (OVCA420, OVCA429, OVCA433, Dov-13, OVCAR3) og en normal eggstokk overflaten epithelial cellelinje (NOSE007).
Figur 1A viser OCR av cellelinjer som reaksjon på forbindelser anvendt i den mitokondrielle stresstesten over tid. Basal og ATP-avhengige OCR målinger indikerte at det meste av cancercellelinjene som ble testet, med unntak av OVCA420 celler, hadde signifikant høyere OCR sammenlignet med en normal ovarie overflate epitelcellelinje (NOSE007, figur 1B 0,05, ** p 0,01, *** p 0,001, **** p 0,0001 statistisk signifikant sammenlignet NOSE007; # p 0,05, ## p 0,01, ### p 0,001, #### p 0,0001 statistisk signifikant sammenlignet OVCA420). OCCC cellelinjer er markert med svart og en normal epitel cellelinje i hvitt. G. Gjennomsnittlig Åndedretts State
Tilsynelatende ble beregnet fra 3-4 replikative eksperimenter ved hjelp av:. 4- (Basal OCR-Oligo OCR) /(FCCP OCR-Oligo OCR)
Selv om alle kreftceller klart hadde høy mitokondriell respirasjon i forhold til NOSE007 celler vi ikke observere en betydelig forskjell i luftveisparametere mellom OCCC celler og andre ovarie cancer cellelinjer, noe som tyder på at mitokondrienes oksygenforbruk profilen ikke skille eggstokk-kreft histologiske subtyper. Men ved å bruke denne tilnærmingen vi var i stand til å identifisere OVCA420 celler som har defekt mitokondrienes funksjon, angitt med lav basal OCR og manglende respons på FCCP.
OCCC celler har høy ekstracellulære forsuring hastighet
samtidig med måling OCR lar ekstracellulære flux analyse for vurdering av ekstracellulært forsuring rate (ECAR) av kultur media. Dette anses som en indirekte analyse av glykolytiske hastigheten av celler [19]. OCCC cellelinjer ES-2 og TOV-21-G vist høy basal ECAR, mens andre cellelinjen hadde lavere ECAR, lik NOSE007 (figur 2A). Oligomycin A ble benyttet for å stimulere maksimal ECAR, som slås av ATP-avhengige OCR, effektivt skiftende metabolisme fra oksidativ fosforylering til glykolyse (figur 2B). Forskjellen mellom maksimal og basal ECAR regnes glycolytic reservekapasitet av celler (figur 2C). OVCA420 celler, som viste defekt mitokondriell respirasjon (figur 1), hadde også lav glycolytic reservekapasitet, indikerer disse cellene opererer nær sitt maksimale glycolytic hastighet som en kompensasjon for tap av OCR. Dette tyder på en avhengighet av glykolyse av OVCA420 celler. vises den normale epitelcellelinje NOSE007 den laveste glykolytiske reserve, hvilket antyder at deres kapasitet for glykolyse er lavere enn for de andre kreftcellelinjer.
A. Basal ECAR nivåene ble målt ved hjelp av et ekstracellulært flux analysator (Seahorse Bioscience). B. Maksimal ECAR ble stimulert ved tilsetting av en mikrometer Oligomycin A. C. glycolytic reservekapasitet ble beregnet som differansen mellom maksimal og basal OCR. Data fra en replicative forsøket er vist (n = 5, ANOVA, Tukey innlegg test * p 0,05, ** p 0,01, *** p 0,001, **** p 0,0001 statistisk signifikant sammenlignet NOSE007; # p 0,01, ### p. 0,001 statistisk signifikant sammenlignet OVCA420)
bioenergi profil
for å få et bedre helhetsbilde av bioenergi profilen eggstokkreft cellelinjer studerte vi plottet basal ECAR mot mitokondrie OCR (figur 3A). Dette viser tydelig hvordan de forskjellige cellelinjer som faller inn under flere kategorier Bioenergi. Vi fant 3 forskjellige grupper av cellulære bioenergi profiler. OCCC celler TOV-21-G og ES-2 representerer helt klart svært energiske celler med høy respirasjon og glykolyse. OVCAR3 celler vises tilsvar dette mønsteret. OVCA433, OVCA429 og DOV-13 hadde en mer aerob fenotype, mens NOSE007 og OVCA420 celler var de minst energiske celler, med både lav OCR og ECAR. Det bør bemerkes at i motsetning til OCR, de ECAR målingene var mer variable mellom eksperimentelle dager, som var spesielt tydelig for OVCAR3 og DOV-13 cellelinjer (figur 3a). Interessant, mer aerobe celler OVCA433, OVCA429 og DOV-13 hadde en relativt høy glykolytisk reserve, hvilket antyder at disse cellene er i stand til å rampe opp sin glykolytiske aktivitet når det er nødvendig, som kan være tilfellet i henhold til hypoksiske betingelser (figur 3B). ES-2-celler viste de laveste reservekapasitet, noe som indikerer at denne cellelinjen kan være i drift i nærheten av sin maksimale luft og glykolytisk kapasitet under vanlige kulturbetingelser (figur 3B). Når du vurderer både OCR og ECAR parametere, våre data tyder på at OCCC celler er svært energiske, avhengig av både oksidativ fosforylering og glykolyse å møte sine energibehov. Imidlertid kan luftveier og glykolytiske profiler ikke være tilstrekkelig til å skille OCCC celler fra andre histologiske subtyper, som OVCAR3 celler dele lignende bioenergi egenskaper.
A. Plotting Basal ECAR og OCR nivåer gir et snap-shot av bioenergi profiler av eggstokkreft cellelinjer studert. OCCC cellelinjer ES-2 og TOV-21-G samt OVCAR3 celler vise høy glykolyse og Oksidativ fosforylering og er derfor klassifisert som svært energisk celler. B. Plotting glycolytic Reserve mot Åndedretts reserve indikerer at noen celler ser ut til å være i drift nær sin maksimale hastighet, for eksempel ES-2 celler, mens andre har høy luftreserve (NOSE007) eller høy glycolytic Reserve (DOV-13, OVCA429). OCCC cellelinjer er merket som svarte trekanter, andre EOC cellelinjer som grå sirkler (OVCA420 som sirkel med X), og den normale epiteliale cellelinjer NOSE007 som en hvit firkant. Dataene i A og C representerer gjennomsnittet av middel OCR og ECAR opplesninger 3-4 eksperimentell replikerer C. spheroid dannelse korrelerer med bioenergetisk underskrift av eggstokkreft celler. Celler ble sådd på ULA plater og størrelse (område spheroid samlet i piksler) plottet (n = 6).
Evnen til å overleve som forankringsuavhengig spheroid samlet spiller en stor rolle i transcoelomic rute of ovarian cancer metastase gjennom IP hulrom. Vi vurderte derfor om en høy bioenergi profil gir en fordel i spheroid formasjon og overlevelse. Interessant, meget energiske celler, ES-2, TOV-21-G og OVCAR3 var i stand til å danne og opprettholde store sfæroide aggregater når sådd ut på ultralave festeflater (figur 3C). Mens OCCC kuler fortsatte å øke i størrelse, begynte OVCAR3 aggregater til disaggregert på dag 9. Cells med en mer aerob fenotype var enten ute av stand til å danne kuler (Dov-13) eller for å opprettholde aggregater henhold forankringsuavhengig vekstvilkår utover dag 4 (OVCA429 OVCA433). NOSE007 og OVCA420 var i stand til å danne meget små sfæroide aggregater, som ikke øker i størrelse og begynte å gå i oppløsning etter dag 4 og dag 9, henholdsvis. Disse data indikerer at en høy Bioenergi signatur (høy OCR og ECAR) kan være forbundet med evnen til å danne kulene, potensielt hjelpe anoikis-motstand og forankrings-uavhengig celleproliferasjon.
Forholdet av Bioenergi til kjemosensitivitet profiler
Gitt identifisering av ulike bioenergi signaturer i vår sett eggstokkreft cellelinjer, ønsket vi å undersøke om dette er prediktive for cellelinje respons på kjemoterapeutika. Cisplatin og Paclitaxel blir ofte brukt midler ved behandling av eggstokkreft. Utviklingen av resistens mot Cisplatin er et felles trekk ved eggstokkreft og OCCC har blitt karakterisert som en svært cisplatin-motstandsdyktig histologisk subtype. Det var derfor overraskende å se en sterk reduksjon i celleviabilitet i ES-2 og TOV-21-G-celler i respons til denne forbindelsen (figur 4A). OVCA429 og OVCA433 cellene hadde den største respons til paclitaxel, etterfulgt av ES-2 og TOV-21g-celler (Figur 4B). Men det var ikke noe klart mønster i forbindelse med Cisplatin og Paclitaxel følsomhet og bioenergi fenotype.
Celler ble behandlet med angitte doser for 72A. Cisplatin, paclitaxel B., C. 2-deoksyglukose (2-DG), D. resveratrol, E. Metformin, F. rotenon, og G. Kombinasjonsbehandling av lavdose rotenon (R; 0,1 mM) og 2-DG (2- mM). Data fra en replicative forsøket er vist (n = 5-6, A-F: ANOVA, Tukey innlegg test * p 0,05, ** p 0,01, *** p 0,001, **** p 0,0001 betydelig mindre celleviabilitet i forhold til NOSE007 ved samme behandling konsentrasjon; G: t-test, statistisk signifikant sammenlignet med hver cellelinje behandling med rotenon alene [* p 0,05, ** p 0,01, *** p 0,001, *** * p 0,0001], eller to-DG alene [# p 0,05, ## p 0,01, ### p 0,001, #### p 0,0001]). Stjernene markere OVCA420 celler, som har defekt mitokondriell respirasjon. H. Ekspresjon av GLUT-1 og HNF-1β melding i eggstokk-kreft-celler, som bestemt ved semi-kvantitativ sanntids RT-PCR. Expression var korrelert til nivåer i NOSE007 celler (n = 3; ND = ingen målbar signal registreres).
Gitt den høye ECAR observert i OCCC celler, var det ikke overraskende at ES-2 og TOV-21-G-celler viste høyest respons til den glykolytiske inhibitoren 2-deoksy-D-glukose (2-DG, figur 4C). OVCAR3 celler var mer resistente overfor 2-DG, som kan være understøttet av deres høye variasjon i ECAR avlesninger (figur 3A). OVCAR3 celler også utstilt noe høyere luftreserve enn OCCC cellelinjer (figur 1i), noe som kan tyde på at disse cellene er i stand til å trappe opp sine oksidativ fosforylering i respons til glykolyse nedstenging mer effektivt. Alternative manipulatorer av glykolyse, inkludert Resveratrol og Metformin resulterte i tilsvarende celle levedyktighet profiler som oppnås ved to-DG (figur 4D E). NOSE007, DOV-13 og OVCAR3 celler var generelt mer resistente overfor disse forbindelser. Som forventet, OVCA420 celler som var følsomme for glykolyse hemming av 2-DG, Resveratrol og Metformin, men dette var ikke vesentlig forskjellig fra OVCA429 eller OVCA433 celler.
I forhold til NOSE007 celler, OVCA429, OVCA433, og den OCCC celle linjer ES-2 og TOV-21-G-celler hadde signifikant reduksjon i celleviabilitet i respons til den mitokondrielle inhibitoren rotenon (figur 4F). Dette kan være forbundet med deres høye avhengighet av mitokondriell respirasjon, som er spesielt tydelig for OVCA429 og OVCA433 celler. NOSE007 og DOV13 celler, som hadde en generelt lavere OCR profilen var mindre følsomme for mitokondrisk inhibering av rotenon i en dose på 1 pM. Interessant nok er dette mønsteret av rotenon følsomhet parallell at av Paclitaxel (figur 4B), noe som tyder på at paclitaxel kan ha sterkere aktivitet på celler med forbedret mitokondriell respirasjon. Foruten medier mikrotubulidynamikk avhengige effekter, har Paclitaxel vist seg å lokke fram sine apoptotiske effekter
via
mitokondriene [25] – [27]. Behovet for funksjonell mitokondrier i å få fram Paclitaxel toksisitet ble også fremhevet av mangel på OVCA420 respons på denne forbindelsen. Celler med økt følsomhet for 2-DG, ble mer effektivt målrettet av kombinasjonsbehandling av lavdose 2-DG (2 mm) og Rotenon (100 nM), med høyest drap observert i in OVCA420, OVCA429, OVCA433 og de to OCCC cellelinjer ES-2 og TOV-21-G (figur 4G).
