Abstract
Bakgrunn
Familien til sink finger holdig GATA transkripsjonsfaktorer spiller kritiske roller i cellen avstamning spesifikasjon under tidlig embryoutvikling og orgel dannelse. GATA4 og GATA6 ble funnet å være ofte tapt i eggstokkreft, og tapet er foreslått å redegjøre for dedifferentiation av kreftcellene.
Metodikk /hovedfunnene
Vi undersøkt videre uttrykk for GATA4 og GATA6 i eggstokkene overflaten epiteliale lesjoner og histologiske subtyper av eggstokkene karsinomer ved farging. GATA4 og GATA6 ble funnet å være fraværende i høye prosentandeler (80 til 90%) av serøs, klar celle, og endometroid eggstokkreft undersøkt. I motsetning til dette, ble begge funnet positive i 11 av 12 tilfeller av mucinkjertler karsinomer, noe som tyder på at ekspresjon av de Gata faktorene kan skille mucinous kreft fra andre histologiske subtyper. GATA4 ofte ble tapt i preneoplastiske lesjoner som morfologisk normale inklusjons cyster og epiteliale hyperplasi ved siden av ondartede celler. Tapet av GATA6 korrelerer tett med neoplastisk morfologisk transformasjon av eggstokkene overflate epitel. I kultur, ble GATA4 uttrykk gradvis redusert på aging primær eggstokkoverflate epitelceller som korrelerte med endringer i histone modifisering av GATA4 locus. En redusert GATA6 genet dosering som i GATA6 (+/-) mus ført til økt pre-neoplastiske endringer og inkluderings cyster i eggstokkene, noe som tyder på tap av GATA6 bidrar til eggstokkreft utvikling.
Konklusjon /Betydning
Denne studien tyder på at uttrykket status for GATA4 og GATA6 kan diktere forskjellige patologiske veier fører til serøs eller mucinkjertler eggstokkene karsinomer. Den lett tap av GATA4 uttrykk gjennom endringer i kromatin konformasjon antyder en mulig ikke-fenotypiske innledende hendelsen, som fører til påfølgende tap av GATA6, morfologisk transformasjon, og ultimate tumorigenesis
Citation. Cai KQ, Caslini C, Capo- chichi CD, Slater C, Smith ER, Wu H, et al. (2009) Tap av GATA4 og GATA6 Expression Angir eggstokkreft Histologiske Subtyper og Precedes neoplastiske Transformasjon av ovarial Surface epitel. PLoS ONE 4 (7): e6454. doi: 10,1371 /journal.pone.0006454
Redaktør: Sudhansu Kumar Dey, Cincinnati Children forskningsfond, USA
mottatt: 24 april 2009; Godkjent: 23 juni 2009; Publisert: 31.07.2009
Copyright: © 2009 Cai et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Disse studiene ble støttet av midler fra tilskudd R01 CA095071, CA79716 og CA75389 til XX Xu, og midler fra Ovarian Cancer SPORE P50 CA83638 (RF Ozols, PI), og Core Grant # CA006927. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
ovarian epitelial kreft er generelt antatt å oppstå fra cølomepitelet dekker eggstokkreft overflaten [1], [2] eller fra inklusjons cyster som også antas å stamme fra eggstokkene overflaten epitelet [3], [4 ]. Det er imidlertid også sterke argumenter at i det minste noen av de ovarian epitelisk cancer stammer fra andre kilder enn av overflaten epitel-celler [5], [6], [7]. Flere forskjellige histologiske subtyper kan klassifiseres basert på celle morfologi: disse er serøs, mucinous, klare celle, og endometroide subtyper [8], [9]. En idé å forklare de forskjellige histologiske subtyper er at ovarialt overflate-epitelceller gjennomgår metaplasi til å ta i bruk en rekke histologiske karakteristika i løpet av transformasjonen [2], [8]. En annen idé er at eggstokkreft kan oppstå fra restene av Mullerian duct strukturer [6], som er forløpere til egglederne, livmorhals, livmor, etc, og kan presentere som alle histologiske undergrupper i svulster. Faktisk nylige observasjoner fører til den hypotese at en vesentlig del av serøse ovariekarsinomer kan stamme fra egglederne [5], [7], som har serøs som epitelceller.
Selv om noen karakteristikker av forløpercellene kan beholde, er forskjellsbehandling av kreftceller fra forløper celler tydelig, og flere kjennetegn på neoplastiske celler har blitt anerkjent [10]. Unike genetiske mutasjoner er grunnlaget for de neoplastiske fenotyper [11] – [13], og i tillegg kreftceller forekommer ofte i en feilaktig differensiert fase, og begrepet «dedifferentiation» er ofte brukt [14] – [16]. Fenotypen beskrevet som «udifferensierte» eller «dedifferensieres» for ovarial cancer refererer ofte til den åpenbare endringer av kreftceller mot et mindre epitel-lignende morfologi eller drift fra forløpercellene. For å tilveiebringe en molekylær forståelse av «dedifferentiation» av kreftceller, kan man tenke konseptet med celledifferensiering avstamning fremtredende i utviklingsbiologi, hvori en ur-celle gjennomgår endringer i sin globale genekspresjon profil mot et spesifikt ferdig celletype. Ved analogi, kan dedifferentiation av kreftceller være forårsaket av tap av ett eller flere kritiske gener som er viktige i å indusere differensieringen av en opprinnelig celletypen for å gi de ovarian overflate epitelceller. Nylige studier tyder på at tapet av transkripsjonsfaktoren GATA6 og GATA4 i eggstokkreft kan forklare tap av epitel-egenskaper, og kan være den underliggende mekanisme «dedifferentiation» av eggstokkreft celler [17], [18].
De Gata transkripsjonsfaktorer binde en konsensus A /TGATAA /G sekvens i arrangører og er bevart i insekter og virveldyr, fra fly til mennesker [19]. GATA4 og GATA6 er uttrykt i de fleste organer, og spiller avgjørende roller i utvikling av disse organene [20], [21]. GATA4 og GATA6 først til uttrykk under dannelsen av extraembryonic endoderm differensiert fra de pluripotente embryonale stamceller i den indre cellemassen under tidlig embryoutvikling [22] – [25]. Gata faktorer er ikke vev-spesifikk, men heller funksjon i beskrivelsen og differensiering av celler i rett linje innenfor et organ, slik som en differensiering av epitelceller avstamning fra stromale celler. GATA4 og GATA6 er uttrykt i humane ovarie flate epitel-celler [17], [18], og antagelig, GATA4 og GATA6 er viktige for dannelse og opprettholdelse av den differensierte tilstand av ovarian overflate epitelceller. GATA4 og GATA6 er ofte tapt i eggstokkreft celler [17], [26], og det er spekulert i at tapet av disse utviklings viktige transkripsjonsfaktorer kan være den underliggende mekanismen for dedifferentiation [17], [18].
Enten GATA6 er viktig for dannelsen av eggstokkene overflaten epitelet er ukjent, siden lite er kjent om avledning av ovarian overflaten epitelceller. Begge GATA4 og GATA6 proteiner er uttrykt i eggstokkene overflaten epitelceller men fraværende i de fleste eggstokkreft celler [17], [18], [26]. Vi fant av Chip analysen at histon H3 og H4 acetylering av GATA4 locus redusert kraftig i kreftceller sammenligner til GATA4-positive ikke-kreftceller [18]. I motsetning til dette ble histon H3 og H4 acetylering av den GATA6 locus i mange kreftceller ikke redusert, og spor av GATA6 mRNA kan påvises ved hjelp av RT-PCR, noe som indikerer at GATA6 genet ikke er transkripsjonelt stilnet, men meldingen blir undertrykket ved en annen mekanisme (r ) [18].
Få transkripsjons mål for de Gata faktorer har blitt identifisert, og funksjonshemmede-2 (DAB2) er en kjent transkripsjon mål av GATA6 [27]. DAB2 ble også funnet tapt i eggstokk-kreft [28], å korrelere med fravær av GATA6 og morfologisk transformasjon [18]. DAB2 mangel hos mus fører til tidlig embryonisk dødelighet [29] – [31], og heterozygote DAB2 mutante mus utvikler pre-neoplastiske lesjoner fra ovarial flate epitel [32]. DAB2 er en adapter protein som er involvert i endocytic menneskehandel, og DAB2 spiller en rolle i å etablere epithelial polaritet og overflate posisjonering [33]. Tap av DAB2 antas å forårsake morfologisk transformasjon av ovarial flate epitel [34], [35]. Dermed er en spekulasjon at tap av GATA6 vil føre til tap av DAB2 og neoplastisk morfologisk transformasjon av eggstokkene overflate epithelia.
I denne studien har vi ytterligere analysert detaljene GATA4 og GATA6 uttrykk i eggstokkene vev og kreft og undersøkt effekten av reduksjonen av GATA6 i mus på eggstokkene overflaten epithelial transformasjon.
Resultater
uttrykk for GATA4 og GATA6 i ovarialcancer histologiske subtyper
Tidligere både ble observert GATA4 og GATA6 å være sterkt uttrykt i primær eggstokk overflaten epitelceller men fraværende i dyrkede eggstokkreft celler av både Western blot å undersøke protein eller Northern blot for å måle mRNA [17], [18].
med videre utvikling av antistoffer og foredling av flekker prosedyre, gjennomførte vi immunhistokjemisk analyse for uttrykket av GATA4 og GATA6 i et panel av eggstokkene ikke-neoplastiske og kreft vev i vevet microarray (tabell 1). Ytterligere 26 ikke-cancer ovarian vev fra profylaktiske oophorectomies ble også brukt i denne studien. Disse ovarian vev ble oppnådd fra både høy og normal risiko kvinner, men ikke mikroskopiske kreft ble funnet [36]. De 111 informative eggstokkreft karsinom i vevet microarray brukt i denne studien består av 82 serøs, 12 mucinous, 12 klarcellet og 5 endometrioid undertyper (tabell 1). I den normale monolaget eggstokk flate epitel ble alle ovarie overflate epitelceller farget positivt for atom GATA4 og GATA6 (figur 1A). Mens GATA4 og GATA6 flekker er fraværende eller sterkt redusert i de fleste eggstokkreft karsinom (tabell 1). Blant de informative tilfellene ble tap av GATA4 funnet i 81/82 (99%) av serøse karsinomer, 1/12 (8,3%) av mucinkjertler karsinomer, 11/12 (92%) av klare karsinomer, og 5/5 ( 100%) av endometroide karsinomer. Tap av GATA6 ble funnet i 55/82 (67%) av serøse karsinomer, 1/12 (8,3%) av mucinkjertler karsinomer, 10/12 (83%) av klar celle karsinom, og 5/5 (100%) av endometroide karsinomer. Eksempler på immunostainings er vist i figur 1, for en GATA4- og GATA6-negative serøs karsinom (figur 1B), en GATA4-negativ, men GATA6-positive serøs karsinom (figur 1C), en GATA6-negativ, men GATA4-positive serøs karsinom (fig 1 D), og en GATA4 og GATA6-positive mucinous karsinom (figur 1E). Det er også merkbart at noen GATA4 og /eller GATA6 farging er til stede i stromale celler i både normale og fryktsomme eggstokker, selv om de fleste av disse flekker ikke er så intens som de av epitelcellene. I noen tilfeller sett i svulsten vist i figur 1B, noen små stromale celler, sannsynligvis immun og lymfatisk celler, viser sterke kjerne farging av GATA4.
Immunostainings av GATA4 og GATA6 ble utført i 111 eggstokkene karsinomer inkludert 4 histologiske subtyper. Resultatene er oppsummert i tabell 1. A. Normale ovarie overflate-epitelceller er positive for begge GATA4 og GATA6 i kjernen. 200 × forstørrelse. B. Et eksempel på både GATA4- og GATA6-negative serøs karsinom. 40 × forstørrelse. C. Et eksempel på GATA4-negative og GATA6-positive serøs karsinom. 40 × forstørrelse. D. Et eksempel på GATA4-positive og GATA6-negativ serøs karsinom. 40 × forstørrelse. E. Et eksempel på både GATA4- og GATA6-positive mucinous karsinom. 40 × forstørrelse. E, epitel; T, svulst; S, stroma.
Et slående trekk ved GATA4 og GATA6 farging er at selv om GATA4 og GATA6 går tapt i de fleste kreft i eggstokkene (hovedsakelig serøs subtype), karsinomer i mucinous subtype er stort sett GATA4 – og GATA6-positive (tabell 1). Dermed uttrykk for GATA4 og GATA6 skiller mucinkjertler karsinom fra andre histologiske subtyper.
Tap av GATA4 forut tap av GATA6 i pre-neoplastisk ovarian overflate og cyste epithelia
GATA4 uttrykk er fraværende i flertallet av serøs eggstokk-kreft, og GATA6 er også fraværende i mange, men også positive i enkelte tilfeller (tabell 1). Negativ GATA6 og positiv GATA4 eksisterer bare i sjeldne tilfeller av eggstokkreft karsinom. Dermed tap av GATA4 synes å være mer utbredt enn tap av GATA6 i eggstokkreft.
Tidligere ble mikroskopiske karsinomer og pre-neoplastiske morfologiske endringer observert i profylaktiske oophorectomies, viser nytten av disse vev i å studere innvielsen av eggstokkreft epitelial kreft [37]. I dagens analyse, ble de 26 tilfeller av eggstokkreft vev fra profylaktiske oophorectomies funnet å inneholde mikroskopiske tumorer, men fikk stille ut morfologisk endret lesjoner avledet fra eggstokkene overflate eller cyste epithelia [36]. I noen åpenlys eggstokkene karsinomer kan morfologisk normale monolag av epitelceller bli funnet ved siden av ondartede celler. Nettopp på grunn av den fysiske nærhet, kan disse morfologiske normale epitelceller dele noen funksjoner med de neoplastiske cellene. Ved farging, fant vi at i de fleste tilfellene GATA4 er fraværende og GATA6 er positiv i ett lag, morfologisk godartede lesjoner, som vist ved et eksempel (figur 2A). I et andre eksempel, eggstokk-epitelceller overflaten er positive for GATA6 og negativ for GATA4, og de epiteliale cyster under overflaten mistet både GATA4 og GATA6 uttrykket (figur 2B).
Hver lysbilder av de 26 prøvene inneholder variable antall lesjoner med varierende grader av morfologiske endringer. Vi har undersøkt om 80 av disse lesjonene til å gjøre flere generelle beskrivelser: GATA4 er negativ i omtrent 80% av overflate epitel, og GATA4 er fraværende i nesten alle åpenbare lesjoner og også omtrent halvparten av morfologisk normale monolagene. GATA6 er generelt til stede (70%) i de epiteliale lesjoner, og tap av GATA6 korrelerer med neoplastiske morfologiske endringer (multiple epitelial lagdeling) i ca 90% av tilfellene. Således GATA4 tap forut ofte GATA6 tap, og tap av GATA4 og GATA6 inntreffer før malign transformasjon av eggstokkene overflate epitelceller.
Farging av GATA4 og GATA6 i morfologisk normale eggstokk-overflate og /eller cyste epitel som finnes i ovarial karsinomer. A. En eggstokkene overflaten epitelet er positivt for GATA6 og negative for GATA4. Positiv farging GATA4 i stroma er notert. B. En eggstokkene overflaten epitelet er positivt for GATA6 og negative for GATA4. Både GATA4 og GATA6 går tapt i cyste epitelceller i tilknytning til overflaten. 200 × forstørrelse. E, epitel; C, cyste; S, stroma.
Tap av GATA4 og /eller GATA6 tett korrelerer med epitelial morfologisk transformasjon
I løpet av årene, samlet vi en samling av 12 ovariekarsinomer som inneholder lesjoner av sammenhengende epitel knytte morfologisk godartede epitelceller til utilslørt kreftceller [35]. Slike lesjoner har også blitt beskrevet tidligere for mucinkjertler og serøs eggstokkene cystadenocarcinomas [38]. Vi antok at tilstedeværelsen av en overgang fra godartet til ondartet kan være nyttig for å bestemme involvering av kandidatgener i eggstokk epitelial tumorigenesis. Faktisk, i alle 12 tilfeller av benign til neoplastiske overganger analysert, tap av GATA4 og /eller GATA6 tett forbinder med neoplastisk morfologisk transformasjon. I det første eksemplet (figur 3A), er GATA4 allerede er fraværende i den godartet monolaget; GATA6 er positiv i monolag-celler, men går tapt i de tilstøtende kreftceller. Tap av GATA6 tett korrelerer med tap av dens transkripsjon target DAB2 (figur 3A). I et annet eksempel er GATA4 og GATA6 uttrykk tapt samtidig, nært forbundet med tap av DAB2 og morfologisk transformasjon (figur 3B). Den forstørrede godartet til neoplastisk overgangen området (figur 3B, lavere paneler) viser at GATA4 er brått borte, og GATA6 er sterkt redusert på overgangen.
Eksempler på menneskelig eggstokkreft farget for GATA4, GATA6, og DAB2 i tilstøtende tumorsnitt. A. En ovarian flate epitel som består av en morfologisk normale flate epitel (pilhode) contiguously bindings maligne celler (pil) som enten har invadert inn i stroma eller ekspandert inn i områder rundt eggstokken. GATA4 er negativ i begge morfologiske normale eller neoplastiske epitelceller. Epitelceller i den morfologiske normal epitel er positive for GATA6 og DAB2, og de ondartede cellene er negative for GATA6 og DAB2. Noen spredte celler i stroma er DAB2 positiv, men negativ for GATA6. Disse cellene er makrofager hvori DAB2 uttrykk er ikke GATA6 avhengig. B. I dette ovariekarsinom, epitelcellene i den morfologiske normal epitel er positive for GATA4, GATA6, og DAB2, og de tilstøtende ondartede celler er negative for GATA4, GATA6, og DAB2. Bildene ble tatt under et mikroskop med en 100 × forstørrelse. De stainings for GATA4 og GATA6 i overgangen i panel B er vist i en høyere forstørrelse (400 ×) på nedre paneler. E, epitel; C, cyste; S, stroma; T, tumor.
således tap av GATA6 uttrykk korrelerer nøye med neoplastisk transformasjon av ovarial flate epitel, som observert i sammenhengende ovarial flate epitel som forbinder morfologisk normalt på maligne celler (figur 3). I tidligere studier [18], [35], ovarial overflate epitelet umiddelbart tilstøtende til tumorområdene ble ansett for å være pre-neoplastisk. Disse pre-neoplastiske lesjoner ofte mangler et intakt basalmembran som indikert ved fravær av collagen IV og laminin-farging, såvel som tap av DAB2 uttrykk [35]. I de morfologisk normale epitel i umiddelbar nærhet av tumorområder, både GATA6 og DAB2 er positive. Imidlertid contiguously tilkoblede neoplastiske celler som er negative både for GATA6 og DAB2 farging. De neoplastiske celler i den transformerte epitel som er umiddelbart koblet til morfologisk normale eggstokk-overflate epitelceller er sannsynligvis mest lik den normale, og som derfor anses for tidlig tumorceller. En slik analyse antyder muligheten for at tapet av GATA6 er en av de forårsakende faktorer av ovarial epitel transformasjon.
Observasjonene fra human ovarian cancer vev tyder på at tapet av GATA4 uttrykk ofte går forut for tap av GATA6, og tapet av GATA6, korrelert med tap av DAB2, forbinder med epithelial morfologisk transformasjon.
Reduksjon av GATA faktor uttrykk ved aging av eggstokkene overflate epitelceller i primærkulturer
i løpet av de siste 5 årene i studier av gata faktorer i eggstokkene overflaten epitelceller og kultur celler, fant vi at GATA4 er fraværende i de fleste eggstokkreft cellelinjer og også SV-40-transfektert, «udødeliggjort» eggstokkene overflaten epitelceller [17], [18]. I tillegg GATA4 uttrykk var variabel i primærkulturer av humane eggstokkene overflaten epitelceller. Dermed spekulerer vi at uttrykket av GATA4 er ikke stabil i eggstokkene overflate epitelceller og kan gradvis redusere over tid.
For å teste denne ideen, vi nøye fulgt passasjer av primær eggstokk overflaten epitelceller i kultur overtid og overvåket uttrykk for GATA4, GATA6, og DAB2 gener. Ovarian overflate-epitelceller ble høstet fra ovarier fra profylaktiske oophorectomies som tidligere beskrevet [17], [18]. Vev ble undersøkt og var fast bestemt på å være morfologisk normale og blottet for mikroskopiske svulster. Cellen dobling tid var om to ukers utgangspunktet og forkortet til en uke til 5 dager i senere passasjer. Vi har gjennomført de passasjer av en slange cellepreparat (ROE 1.005.816) til passasjen 10 over en to måneders periode, og cellene var fortsatt svært proliferative på slutten. Vanligvis kan cellene vokse i kultur i ca 20 passeringer i løpet av en seks måneders periode før under replicative alderdom. Ved hver passasje ble halvparten av cellene høstet og anvendt for ekspresjon analyse, og den andre halvparten ble holdt kontinuerlig i kultur.
Først endringer i morfologien av ovarian overflate epitelcellene var åpenbare. Til å begynne med cellene så ut til å være rund og flat, med en «brostein» morfologi, og i økende grad cellene ble langstrakt og spindel-lignende, og den mest dramatiske endringer ble observert ved passasje 4 (figur 4A). GATA4 mRNA-nivåer ble funnet å reduseres raskt, og ble oppdages av passasje 4 (figur 4B, C). Ekspresjonen av GATA6 og dens transkripsjon mål DAB2, reduseres gradvis over tid, og mRNA-nivåer av begge genene var 20-30% av de opprinnelige celler (Figur 4C). Som en kontroll, hus-holder genet TBP (TATA-boks-bindende protein, tilgangsnummer NM_003194) ekspresjonsnivået hadde ubetydelige endringer i løpet av kulturen, og variasjonen skyldes sannsynligvis omfanget av feil i analysen.
humane ovarie overflate-epitelceller ble isolert fra morfologisk normale humane eggstokker erholdt fra ooforektomi kirurgi. Cellene ble passert 10 ganger i løpet av en periode på 3 måneder, og cellene ble høstet fra hver passasje for mRNA-analyse. A. Morfologi av cellene i passasjen # 1, 2, 4, 6, 8, 10. B. Den totale RNA ble anvendt for kvantitativ sanntids RT-PCR for å bestemme mRNA-nivåer. Resultatene er presentert som en «heat-kart». C. Mengden av mRNA i forhold til passering 1 ble kvantifisert og presenteres som et søylediagram.
Dermed blir alle GATA4, GATA6 og DAB2 mRNA nivåer redusert på aging av primær eggstokkreft overflate epitelceller i kultur. Tapet av GATA4 forut for tap av GATA6 (og DAB2), ligner på observasjon i pre-neoplastiske eggstokkene epitel ved siden av eggstokkene karsinomer, der GATA4 er ofte tapt før GATA6. Tidligere ble det tap av GATA4 og GATA6 i eggstokkreft og epitelceller vist seg å være av mekanismen av hypoacetylation av histoner H3 og H4 og tap av histon H3 /lysin K4 trimethylation på sine arrangører [18]. Genekspresjon er bestemt av mønsteret av tilhørende histone modifikasjon, kjent som histon-koder [39]. Tap av histone acetylering fører til en mer kompakt kromatin konformasjon og tap av transkripsjonen aktivitet [40], og histon H3 /lysin K4 metylering forbinder med aktive gener [41], [42]. Den lett tap av GATA4 og GATA6 uttrykk foreslår ustabilitet i epigenetiske stater /kromatin konformasjon, i samsvar med den tidlige tap av Gata faktorer i eggstokkene tumorigenesis.
Endring av kromatin modifisering på GATA4 locus forbundet med tap av uttrykk på aging av eggstokkene overflaten epitelceller i primærkulturer
for å finne årsaken til reduksjon av GATA faktor uttrykk i primærkulturer, må vi først bestemme uttrykket i et stort panel av eggstokkreft overflate epiteliale celler og kreftceller. Total RNA ble isolert fra 8 preparater av primærSLANGE celler (fra 7 personer, her, C.47 og D.47 ble delt fra de samme SLANGE forberedelser, men ble dyrket av ulike lab ansatte), 6 HIO linjer som er SLANGE celler transfektert med SV40-T-antigent å forlenge dyrking levetid, og 6 linjer med eggstokkreft celler (figur 5). RNA ble underkastet semi-kvantitativ RT-PCR (figur 5A) og sanntids RT-PCR (figur 5B) for å bestemme mRNA-nivåer for GATA4, GATA6, DAB2, og GAPDH eller BHD som lasting kontroller. GATA4 uttrykk er redusert i enkelte SLANGE forberedelser og HiO linjer, og er fraværende i alle kreft linjer som bestemmes av både semi-kvantitativ RT-PCR og real-time RT-PCR (figur 5A, B). Reduksjon av GATA6 og DAB2 uttrykk i HIO og kreft linjer er mer synlig ved real-time RT-PCR (figur 5B).
Menneskelige eggstokkreft overflate epitelceller ble isolert fra morfologisk normale menneskelige eggstokkene hentet fra oophorectomy kirurgi. Flere Hio linjer ble også etablert ved transfeksjon av primære celler med SV-40 T-antigen for å forlenge levetiden i kulturer. Total RNA isolert fra en samling av primær slange, HIO, og kreftceller ble anvendt for: A. Semi-kvantitativ RT-PCR, og B. Kvantitativ sanntids RT-PCR, for å bestemme mRNA-nivåer for GATA4, GATA6, DAB2, og GAPDH (semi-kvantitativ RT-PCR) eller BHD (real-time RT-PCR) som lasting kontroller. Tilstrekkelig RNA ble oppnådd fra HOSE.96 (eller C.96), passasje # 3; HOSE.47 celler, passasje # 5; og HOSE.63 celler, passasje # 12; for CHIP analysen. C. Plasseringen av primere F3 og R3 på GATA4 genet for PCR i chip-analysen er vist. D. Lysates fra HOSE.96, HOSE.47, HOSE.63, ES2, SKOV3, A2780, OVCAR3, og OVCAR10 var forberedt på CHIP analysen. Kromatin utfellinger av antistoffer mot Ac H3, Ac H4, Me
2H3K4, Me
3H3K4, Me
2H3K9, Me
2H3K27, og HPγ1 ble brukt til å forsterke ved PCR ved hjelp av primere F3 og R3. Inngangssignalet ( «i», 2% av de totale Kromatin anvendt for immunopresipitering), ingen antistoffkontroll ( «nei»), og ingen templat kontroll ( «H
2O») ble inkludert. De lyse felt bilder av de semi-kvantitative PCR-produktene er vist. E. Plasseringen av primere F2 og B2 ved GATA6 genet for PCR i CHIP-analysen er vist. F. Lysate fra HOSE.96, HOSE.47, A2780, OVCAR3, og OVCAR10 var forberedt på CHIP analysen. De lyse felt bilder av semikvantitative PCR produktene vises.
Vi var i stand til å få en tilstrekkelig mengde av 3 primære SLANGE celler (HOSE.96, HOSE.47, og HOSE.63) for videre studiet av endringer i kromatin modifikasjon av GATA4 og GATA6 locus av Chip-analyse under aging av cellene i kultur. Uttrykket nivåer av GATA4 inverst korrelert med passasje antall celler: HOSE.96 (eller C.96) celler, passasje # 3, har høy GATA4 uttrykk; HOSE.47 celler, passasje # 5, har en lavere GATA4 nivå; og HOSE.63 celler, passasje # 12, har en mye redusert uttrykk nivå (figur 5B).
Etter tidligere etablert protokoll for ChIP analyse for GATA4 og GATA6 gener [18], fant vi ut at, ja, på et sted umiddelbart oppstrøms for det GATA4 Exon 1 (figur 5C), reduksjon av GATA4 ekspresjonsnivåer korrelerer med tap av acetylering av Histone H3 og H4 (figur 5D). Ingen signifikante endringer ble sett for di og tri metylering av H3K4, markører for aktive kromatin konformasjon [41], [42]. Men dimetylering av histon H3 på lysin 9 og 27 (Me
2H3K9, Me
2H3K27) og HP1 er fraværende, noe som tyder på forstummet GATA4 genet ikke blir innlemmet i heterochromatin [43].
ved siden av redusert acetylering av histon H3 og H4 i A2780 celler, mønstre av histone modifikasjon på GATA6 locus (figur 5E) er lik mellom SLANGE celler og kreft linjer OVCAR3 og OVCAR10 (figur 5F), noe som tyder på endring av histone modifikasjon på GATA6 locus er ikke en generell hendelse i eggstokkene epiteliale celler og kreftceller.
ovarian tumor utsatt fenotype av GATA6 heterogene mus
å finne en nær sammenheng mellom tap av GATA6 og epitel transformasjon bedt oss å spekulere i at tap av GATA6 kan være forårsakende i transformasjonen av eggstokkreft overflate epitelceller. De ovennevnte observasjoner tyder også på at tapet av GATA6 kan være mer kritisk enn tapet av GATA4 i å fremme ovarial epitelial transformasjon. For å bestemme konsekvensen for tap av GATA6 i eggstokkene overflaten epithelia undersøkte vi eggstokkreft fenotype av GATA6 (+/-) mus, siden homozygote mus er embryonale dødelig [24], [25]. Vi har oppnådd og opprettholdt en koloni av GATA6 knockout mus i løpet av de siste 2 årene. Ovarian vev ble høstet fra mus på rundt ett års alder, og morfologi av eggstokkene fra kullsøsken av GATA6 (+/-) og villtype ble sammenlignet. Påfallende, alle eggstokker GATA6 (+/-) genotype utstilt noen forandringer (tabell 2): Noen eggstokkene har omfattende proliferativ lesjoner av overflaten epitel (Figur 6A), og de andre har store ovarialcyster som er positive for cytokeratin (Figur 6B ). Den eggstokkreft fenotype ligner de av
DAB2 product: (+/-) mus [32], i samsvar med DAB2 som GATA6 transkripsjon mål og mekler [27].
eggstokkreft morfologi GATA6 (+ /-) og hvete kullsøsken på ca ett års alder ble sammenlignet. Cytokeratin farging ble anvendt som en markør for epitelceller. A. Et typisk eksempel på en hvete eggstokk viser flere follikler i forskjellige utviklingsstadier omsluttet inne i et lag av flate epitel. Et representativt GATA6 (+/-) eggstokk viser tilstedeværelse av utveksten av epitelceller fra overflaten (pil). B. En stor del av GATA6 (+/-) eggstokkene viser også store cyster inne i eggstokkene. Cellene lining cystene er cytokeratin positive (nedre paneler). Alle bildene ble tatt under et mikroskop med en 100 × forstørrelse.
Dermed antyder dette resultatet GATA6 mangel påvirker eggstokkene overflaten epitel, muligens fremme transformasjon om vev spesifikk sletting av GATA6 i eggstokkene overflaten epithelial cellene vil være en bedre test, når GATA6 betinget knockout mus blir tilgjengelige.
Diskusjoner
Denne studien undersøkte uttrykk for GATA 4 og GATA6 i eggstokkene overflaten epitelceller og karsinom i detalj, og funnet at tapet av GATA4 er mer bred spredning og ofte går forut GATA6 i transformasjonen av eggstokkreft overflate epitel. Tapet av GATA6, men korrelerer nøye med morfologisk transformasjon av epitel. Den lett reduksjon av GATA4 og GATA6 uttrykk ved dyrking av eggstokkene overflaten epitelceller foreslår ustabilitet i epigenetisk stat /kromatin konformasjon av GATA4 og GATA6 locus, i samsvar med den tidlige tap i eggstokkene tumorigenesis. Den tidlige tap av GATA4 og GATA6 og nær sammenheng med neoplastisk transformasjon av eggstokkreft overflaten epithelia antyder en utløsende rolle, som er støttet av utbredelsen av eggstokkene epiteliale lesjoner i GATA6 heterozygote mangelfull mus [32].
I kontrast til andre histologiske subtyper, mucinkjertler ovariekarsinomer generelt er positive for GATA4 og GATA6 uttrykk. Faktisk er morfologi mucinkjertler ovariekarsinomer svært unikt i at kreftcellene ser ut til å beholde apikale polaritet og ofte eksistere som monolags epithelia.
raskt tap av GATA4 i aging av primære celler i kultur er spennende. Tapet av GATA4 uttrykk i aging av primære celler i kultur forbinder med tap av H3 og H4 histone acetylering på GATA4 promoter locus. Tapet av GATA4 i kreftcellelinjer vises også formidlet ved reduksjon av H3 og H4 histon acetylering av promoteren locus.
