Abstract
Laver produsere ulike unike kjemikalier som kan brukes til farmasøytiske formål. Å screene for romanen lichen sekundære metabolitter som viser hemmende aktivitet mot lungekreft cellemotilitet, testet vi aceton ekstrakter av 13 lichen prøver samlet i Chile. Physciosporin, isolert fra
Pseudocyphellaria coriacea plakater (Hook f . Taylor) D.J. Galloway P. James, ble identifisert som en effektiv forbindelse og viste signifikant hemmende aktivitet i migrasjon og invasjon analyser mot humane lungekreftceller. Physciosporin behandling redusert både protein og mRNA nivåer av N-cadherin med samtidige nedgang i nivåene av epiteliale-mesenchymale overgang markører som sneglen og vri. Physciosporin også undertrykkes KITENIN (KAI1 C-terminale samspill tetraspanin) -mediert AP-1 aktivitet både i fravær og nærvær av epidermal vekstfaktor stimulering. Kvantitativ real-time PCR-analyse viste at ekspresjon av metastase suppressorgen, KAI1, ble øket mens det av den metastase enhancer-genet, KITENIN, ble dramatisk redusert med physciosporin. Spesielt ble aktiviteten av 3′-ikke-translaterte området av KITENIN redusert med physciosporin. Videre ble Cdc42 og Rac1 aktiviteter redusert med physciosporin. Resultatene viste at lav annenhånds metabolitten physciosporin hemmer lungekreft cellemotilitet gjennom nye virkningsmekanismer
Citation. Yang Y, Park SY, Nguyen TT, Yu YH, Nguyen TV, Sun EG, et al . (2015) Lichen Sekundær metabolitt, Physciosporin, Hemmer Lung Cancer Cell motilitet. PLoS ONE 10 (9): e0137889. doi: 10,1371 /journal.pone.0137889
Redaktør: Zhiqian Zhang, Peking University Cancer Hospital Institute, KINA
mottatt: 14 juni 2015; Godkjent: 24 august 2015; Publisert: 15.09.2015
Copyright: © 2015 Yang et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Denne studien ble støttet av National Research Foundation of Korea (NRF-2013R1A1A2004677, MRC-2011-0030132) på og av Korea National Research Resource Center Program ( NRF-2014M3A9B8002115). Denne studien har også fått støtte fra et forskningsstipend finansiert av Sunchon Research Center for Naturmedisin. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Forkortelser : DMSO, dimetylsulfoksyd; EGF, epidermal vekstfaktor; HPLC, væskekromatografi; KITENIN, KAI1 C-terminal samspill tetraspanin; NMR, kjernemagnetisk resonans; PBD, p21 bindende domene; TLC, er AvTynnsjiktkromatografi
Innledning
Lungekreft er den vanligste kreft og den ledende årsak til kreft dødsfall hos mennesker over hele verden [1, 2]. Det var om lag 1,8 millioner nye tilfeller av lungekreft diagnostisert i 2012, sto for 12,9% av det totale antallet tilfeller av kreft [1, 2]. På grunn av mangelen på effektiv behandling for fremskreden sykdom, er prognosen for lungekreft fremdeles dårlig, med mindre enn 15% overlevende 5 år etter diagnose [3]. Når lungekreft er diagnostisert til presentasjon med symptomer, bærer det en svært dårlig prognose, med en samlet 5 års overlevelse på 16% i USA og mindre enn 10% i Storbritannia [4]. I lungekreft, er metastase den ledende dødsårsaken, og rakne mekanismen for tumorprogresjon og metastasering er derfor av stor betydning [5]. I den første delen av lokal invasjon, de signalveier som styrer cytoskeletal dynamikken i tumorceller, ble omsetningen av celle-matriks og celle-celle kryss aktivert [6]. Derfor er utvikling av nye kjemiske midler som hemmer kreftcelle migrering og invasjon ved å målrette den ovenfor angitte signal er nødvendig for behandling av avansert kreft.
laver fremstille diverse sekundære metabolitter som viser en rekke biologiske aktiviteter, inkludert anti-kreft-aktivitet [7]. Hittil har nesten tusen sekundære metabolitter av laver blitt oppdaget, og noen av disse unike lichen metabolittene er effektiv mot ulike
in vitro
kreftmodeller [8]. Imidlertid, selv om laver er en kilde for screening av anti-cancer aktive forbindelser, bare et lite antall forbindelser er blitt testet i [9]. Derfor er denne studien undersøkte den hemmende aktiviteten av 13 chilenske lavarter mot migrering og invasjon evne til humane lungekreftceller og videre undersøkt de mulige molekylære mekanismer som ligger under deres anti-metastatisk aktivitet for å identifisere potensielle nye anti-metastase midler.
Materialer og metoder
Utarbeidelse av lichen ekstrakter
thalli av lavarter ble samlet inn fra Chile i januar 2009 og 2012 under ekskursjoner i nasjonalparken Torres del Paine, Patagonia, organisert av Dr. Pereira ved Talca University, Talca, Chile. Tillatelsen til å samle lichen prøver fra stedet ble utstedt av administrasjonen av National Forestry Corporation (CONAF) fra Punta Arenas og administrasjonen av nasjonalparken Torres del Paine, Magallanes region og chilenske Antarktis, som er en del av National System of Beskyttet ville Områder i staten Chile. Feltstudiene ikke innebærer noen truede eller vernede arter. Duplikatene ble avsatt på den koreanske Lichen og Allied Bioresource Senter (KOLABIC) i den koreanske Lichen Research Institute (KoLRI), Sunchon National University, Korea.
Tynnsjiktkromatografi (TLC) analyse av lichen materialet
Lichen thalli ble fuktet i 1 ml aceton i 5 minutter i 1,5 ml EP-rør, og den konsentrerte oppløsning ble flekket på silikagel 60 F254 pre-belagte plater (Merck Millipore, Darmstadt, Tyskland) ved anvendelse av en microcap flere ganger. Løsningsmiddel A [Toluen: Dioxin: eddiksyre 180: 45: 5 (v /v /v)], er beskrevet i Culberson forbedrede standardisert metode [10], ble anvendt i denne studien. TLC-platen flekket med prøvene ble anbragt i en tvilling trau kammer på forhånd mettet med løsningsmiddelsystem A og ble fjernet fra kammeret når væskefronten nådde 14 cm fra utgangslinjen. Resultatene ble visualisert ved undersøkelse og merking i dagslys (for pigmenter) og under UV ved 254 og 350 nm. Etter dette ble platene sprayet med 10% vandig svovelsyre og oppvarmes ved 110 ° C for å sikre fullstendig visualisering. Etter forkulling, de spesifikke farger av stoffer, både i dagslys og under UV (350nm), ble notert.
To lavarter
Lethariella cladonioides (Nyl
.
) Krog
(Atranorin) og
Usnea longissimi plakater (usnic syre) ble benyttet som standard kontroll. Basert på den standardiserte metoden [10, 11], relativ R
f verdi ble fastsatt til å identifisere hvert sted [12].
Separasjon og identifisering av physciosporin
Pseudocyphellaria coriacea
(CL090002) ekstrakt ble separert ved hjelp av TLC som beskrevet ovenfor. Spot identifisert som physciosporin ble skrapet av og eluert med aceton. Supernatanten ble tørket og veid etter sentrifugering. Væskekromatografi (HPLC) analyse ble utført for å bekrefte enkel topp i den rensede prøven, og, deretter, strukturen av physciosporin ble bekreftet ved kjernemagnetisk resonans (NMR) analyse (fig A og B i S1-fil).
Cell kultur
Den menneskelige lungekreft celler inkludert A549, H1650 og H1975 ble brukt i denne studien. Celler ble dyrket i RPMI 1640 dyrkningsmedium supplert med 10% føtalt bovint serum, 1% penicillin-streptomycin-løsning under en fuktig 5% CO
2 atmosfære ved 37 ° C i en inkubator.
sårheling assay
A549 celler ble platet ved en tetthet på 2,5 x 10 ~ 3
5-celler /brønn på 6-brønners vevkulturplater (Corning, New York, USA) og dyrket over natten til konfluens. Monolags celler ble skrapet med en steril pipette spiss for å skape et sår. Cellene ble deretter vasket to ganger med serumfritt RPMI 1640 for å fjerne flytende celler og inkubert i RPMI 1640 dyrkningsmedium supplert med 2% FBS med 5 ug /ml av aceton ekstrakt av
P
.
coriacea
eller physciosporin. Fotografier av celler ble tatt ved 0, 24, 48 og 72 timer etter at såret for å måle bredden av såret. For hver prøve, ble i gjennomsnitt fem sår analyser tatt for å bestemme den gjennomsnittlige frekvensen av migrasjon. Forsøkene ble gjentatt minst tre ganger.
Invasion analysen
Invasion ble utført i Boyden kamre (Corning, New York, USA). De polykarbonat filtre (8 mikrometer pore størrelse, Corning) pre-belagt med 1% gelatin ble brukt for invasjon analyser. Celler (2 x 10
6) i 120 ul medium (RPMI 1640 inneholdende 0,2% BSA oppløst i PBS) med eller uten 5 pg /ml urene lichen ekstrakter eller physciosporin ble sådd ut i det øvre kammer. Deretter 400 mL medium med 10 pg /ml fibronektin ble tilsatt til det nedre kammer for å tjene som et kjemotaktisk middel. Etter 24 timers inkubering ble cellene i det øvre kammer fiksert med Diff Quik kit (Sysmex). Da cellene er festet i det øvre kammer ble mekanisk fjernet ved bomullspinne. Cellene fester seg til undersiden av filteret ble farget og tellet under oppreist mikroskop (5 felt /kammer). Hver invasjon Analysen ble gjentatt i tre uavhengige eksperimenter.
Western blotting
Celler ble behandlet med 5 pg /ml av aceton ekstrakt av
P
.
coriacea
eller physciosporin i 24 timer ble vasket to ganger med iskald PBS og lysert i lyseringsbuffer [13]. Antistoffene brukte ble kjøpt fra Cell Signaling Technology (N-cadherin, α-tubulin) og BD Biosciences (E-cadherin). Antistoffer ble påvist med pepperrot peroksidase-konjugert sekundært antistoff (Thermo) med Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrat Kit (Millipore) og luminescens imaging (Bilde Quant LAS 4000 mini). Bånd ble målt ved hjelp av fler Gauge 3,0 og deres relative densitet beregnes på grunnlag av tettheten av a-tubulin bånd i hver prøve. Verdier ble uttrykt som vilkårlige densitometriske enheter som tilsvarer signalintensiteten.
Kvantitativ RT-PCR
kvantitativ RT-PCR (QRT-PCR) ble utført som tidligere beskrevet [14]. Kort fortalt ble totalt RNA isolert fra humane lungekreftceller ved hjelp RNAiso Plus (Takara, Otsu, Shiga Shiga 520-2193, Japan) i henhold til produsentens instruksjoner. Total RNA fra hver gruppe av behandlede celler ble konvertert til cDNA ved hjelp av en M-MLV revers transkriptase kit (Invitrogen, Carlsbad, USA) og SYBR grønt (Enzynomics, Seoul, Korea). Primere som brukes for real-time PCR var Snail (fremover) 5′-tcccgggcaatttaacaatg-3 «og (revers) 5′-tgggagacacatcggtcga-3′; Twist (fremover) 5»-cgggagtccgcagtctta-3 «og (revers) 5′-tgaatcttgctcagcttgtc-3′; N-cadherin (fremover) 5»-ctcctatgagtggaacaggaacg-3 «og (revers) 5′-ttggatcaatgtcataatcaagtgctgta-3′; KAI1 (fremover) 5»-gctcatgggcttgggct-3 «og (revers) 5′-gagctcagtcacgatgccgc-3′; KITENIN (fremover) 5»-cggaataaagacggcagagg-3 «og (revers) 5′-tgctccgaggtgcctgtgat-3′; GAPDH (fremover) 5»-atcaccatcttccaggagcga-3 «og (revers) 5′-agttgtcatggatgaccttggc-3». QRT-PCR-reaksjoner og analyser ble utført ved anvendelse av CFX (Bio-Rad, Hercules, USA).
Reporter assay
For AP-1 reporter analysen ble HEK293T-celler transfektert med KITENIN ekspresjonsplasmid og AP1 reporter plasmid. Etter 12 timers transfeksjon, ble cellene behandlet med 5 pg /mL aceton ekstrakter av
P
.
coriacea
eller physciosporin for 48t med eller uten EGF og deretter analysert ved hjelp av en Dual-Luciferase® reporter analysesystem (Promega, Madison, WI, USA). Den Renilla luciferase reporter plasmid (PRL-TK) ble anvendt som en intern kontroll for transfeksjonseffektiviteten. Aktiviteten for TOPFLASH reporter, NF-kB og STAT reporter ble også testet i vårt studium.
For KITENIN promoter reporter assay human KITENIN promoter (-2344 til + 536) ble amplifisert ved PCR fra genomisk DNA til HEK293T celler ved anvendelse av primere utformet fra den genomiske sekvensen til KITENIN locus (1p13.1). PCR-produktene ble spaltet med
Kpn
I /
Bgl
II og klonet inn i pGL3basic plasmid (Promega, Madison, WI, USA) oppstrøms for luciferase reporter-genet. Byggingen ble bekreftet ved sekvensering. Den KITENIN 3′-untranlated region (3′-UTR) analyse ble utført som tidligere beskrevet [15]. Forsøkene ble utført in triplo, og minst tre resultater fra uavhengige eksperimenter ble inkludert i en analyse. Brett endringer ble beregnet ved hjelp av verdiene normalisert til Renilla luciferase aktivitet.
Affinity-utfelling av cellulære GTPases
De cellulære Rac1 og Cdc42 aktiviteter ble bestemt ved hjelp av GST-RBD /PBD som tidligere beskrevet [16] . I korthet ble cellene lysert i lyseringsbuffer. Lysatene ble inkubert med GST-RBD /PBD perler ved RT i 1 time. Perlene ble deretter vasket fire ganger med vaskebuffer. De bundne Rac1 og Cdc42-proteiner ble påvist ved immunblotting ved å bruke et monoklonalt antistoff mot Rac1 (MILLIPORE 05-389) og Cdc42 (SANTA CRUZ SC-87). Den relative aktivitet av hver GTPase ble bestemt ved å tallfeste hvert band av GTP-bundet GTPase og den totale mengden av GTPase bruker Multi-Gauge 3.0, og verdiene av GTP-bundet bandene var normalisert til at av det totale beløpet. Alle resultater ble bestemt ved hjelp av tre forskjellige eksponeringer fra minst tre uavhengige eksperimenter.
Resultater
Aceton ekstrakter av lav samlet i Chile hemme A549 cellemotilitet
Invasion og migrasjon spille en avgjørende rolle i den metastase av kreftceller. For å finne en inhibitorisk substans fra lichen sekundære metabolitter, sårheling analyser ble utført i A549 humane lungekreftceller som en innledende screening for acetonekstrakter 13 chilenske lav (tabell 1) [17-20]. Som vist i figur 1A,
Rhizoplaca melanophthalma
,
Hypotrachyna sinuosa
,
Pseudocyphellaria coriacea
,
Pseudocyphellaria glabra Hotell og
nefrom sp
. inhiberte migreringen av A549-celler ved en konsentrasjon på 5 pg /ml. Denne konsentrasjonen ble anvendt som ingen cytotoksisitet ble observert ved denne konsentrasjon (data ikke vist). Avstanden mellom kantene av sårene for celler behandlet med de fem lichen ekstraktene var bredere enn de for DMSO-behandlede celler (figur 1B).
(A) Kvantitativ analyse av migrasjons undersøkelser av A549-celler behandlet med 5 mg /ml aceton ekstrakter av
Pseudocyphellaria glabra
,
Pseudocyphellaria coriacea
,
nefrom
sp.,
Physcia
sp.,
Flavoparmelia caperata
,
Hypotrachyna sinuosa
,
Rhizoplaca melanophthalma
,
Rhizoplaca melanophthalma
,
Pseudocyphellaria argyracea
,
Pseudocyphellaria verrucosa
,
Xanthoparmelia
sp.,
Protousnea sp
. og
Xanthoparmelia
sp .. (B) Representative bilder av migrasjon analyser av A549 celler behandlet med ekstrakter av
R
.
melanophthalma
,
H
.
sinuosa
,
P
.
coriacea
,
P
.
glabra Hotell og
nefrom
sp. (C-D) Invasion analyser av A549-celler ble behandlet med 5 pg /mL aceton ekstrakter av
R
.
melanophthalma
,
H
.
sinuosa
,
P
.
coriacea
,
P
.
glabra og nefrom sp
. (C) og kvantitativ analyse av invaderte celletall i hver behandling (D). Kvantitative data ble innhentet fra tre uavhengige forsøk, n = 3. Data representerer gjennomsnitt ± SEM (Standardfeil av middelverdien). *** P. 0,001 sammenlignet med DMSO-behandlede A549 celler
For ytterligere å sjekke om de ovennevnte lichen ekstrakter hadde hemmende aktivitet mot invasjon av A549 celler, ble invasjons analyser utført ved hjelp av gelatin-belagt to- godt kamre. Som vist i figur 1C, celler behandlet med aceton ekstrakter av de fem laver viste færre antall av invaderte celler når sammenlignet med DMSO-behandlet kontrollgruppe. Kvantitativ analyse av dataene viste at forskjellene var signifikante (Fig 1 D). Disse resultatene indikerer at aceton ekstrakter av
R
.
melanophthalma
,
H
.
sinuosa
,
P
.
coriacea
,
P
.
glabra Hotell og
nefrom sp
. utviser hemmende aktivitet mot A549 cellemotilitet.
Physciosporin ble identifisert som en aktiv lichen sekundær metabolitt fra
P
.
coriacea
i hemming av lungekreft cellemotilitet
For å undersøke den viktigste forbindelsen med disse fem kandidat lavarter ble fem lichen aceton ekstrakter individuelt analysert ved TLC (Fig 2A). Basert på den relative R
f-verdier [12],
R
.
melanophthalma
,
H
.
sinuosa
,
og nefrom sp
. har samme hovedkomponent, usnic syre (spot en, figur 2A), mens
P
.
glabra Hotell og
P
.
coriacea
har forskjellige hoved forbindelser (flekk c, fig 2A). Som usnic syre er den mest omfattende studert lichen metabolitt for anti-kreft aktivitet, valgte vi «spot c «for videre studier. «Spot c «ble tydelig observert innenfor
P
.
glabra Hotell og
P
.
coriacea
blant annet
Pseudocyphellaria
slekten som besitter tenuiorin (spot d) og andre ukjente metabolitter som hovedforbindelsen (venstre panel, figur 2B). Som «spot c» i
P
.
glabra Hotell og
P
.
coriacea
delte en identisk TLC R
f verdi med physciosporin i
P
.
granulata Hotell og var blek eller mørk grå i dagslys og ble svart og tettere under UV (venstre og høyre panel, figur 2B), identifiserte vi «spot c «som physciosporin [21-23].
P
.
faveolata Hotell og
P
.
valdiviana
også besitter physciosporin som sin viktigste forbindelsen (høyre panel, figur 2B). Den physciosporin brukt i denne studien ble isolert fra
P
.
coriacea
som mengder av andre physciosporin inneholder laver var begrenset. Renhet og struktur av physciosporin ble bekreftet ved HPLC og NMR-analyse (figur 2C; S1 Fil)
(AB) Tynnsjiktkromatografi (TLC) analyse ved anvendelse av (Toluen:. Dioxin: eddiksyre = 180: 45: 5 , v /v /v) løsningsmiddelsystem for lichen ekstrakter som har inhibitorisk aktivitet på A549-celle motilitet (A), er lav i
Pseudocyphellaria
genus (B). «A» betegner plassering av sted for usnic syre; «B», for atranorin; «C», for physciosporin; «D», for tenuiorin. Lavarter
L
.
cladonioides Hotell og
U
.
longissimi
ble brukt som standard kontroll for atranorin og usnic syre, henholdsvis. (C) Kjemisk struktur av physciosporin. (D-E) Migrering analyse av A549-celler ble behandlet med 5 pg /mL aceton ekstrakt av
P
.
coriacea
eller 5 pg /mL physciosporin (D), og kvantitativ analyse av sår lengde (E). (F-G) Invasion analyser av A549-celler ble behandlet med 5 pg /mL aceton ekstrakt av
P
.
coriacea
eller physciosporin (F), og kvantitativ analyse av invaderte celletall i hver behandlings (G). Kvantitative data ble innhentet fra tre uavhengige forsøk, n = 3. Data representerer gjennomsnitt ± SEM (Standardfeil av middelverdien). *** P. 0,001 sammenlignet med DMSO-behandlede A549 celler
For å sjekke om physciosporin er virkestoffet hemmer A549 cellemotilitet ble physciosporin testet i sårheling analyser og invasjon analyser. Sammenlignet med aceton ekstrakt av
P
.
coriacea
, physciosporin viste lignende hemmende aktivitet mot migrasjon og invasjon av A549 celler (fig 2D-2G). Spesielt physciosporin hemmet A549 celle invasjon i en doseavhengig måte (figur 2F og 2G). Interessant, hemningen av den rensede forbindelse var høyere enn for råekstrakter i invasjonen analysen, men noe lavere i migrerings analysen (figur 2E og 2G). Hemmende aktivitet aceton ekstrakt av
P
.
coriaea Hotell og physciosporin på lungekreft cellemotilitet ble også observert i H1650, H1975 celler (fig 3). Cellelevedyktigheten ble ikke forandret ved den gitte konsentrasjon av physciosporin (data ikke vist). Fremfor alt, disse resultatene viste at physciosporin er en aktiv lichen sekundær metabolitt fra
P
.
coriacea
ved inhibering av kreftcellelunge motilitet.
(AB) Invasion analyser av H1650 og H1975 lungekreftceller behandlet med 5 pg /ml av aceton ekstrakt av
P
.
coriacea
eller 5 pg /mL physciosporin (A), og kvantitativ analyse av invadert celletallet i hver behandlings (B). Kvantitative data ble innhentet fra tre uavhengige forsøk, n = 3. Data representerer gjennomsnitt ± SEM (Standardfeil av middelverdien). *** P. 0,001 sammenlignet med DMSO-behandlede A549 celler
Aceton ekstrakt av
P
.
coriacea Hotell og physciosporin redusert nivået på epiteliale-mesenchymale overgang markør
For å undersøke virkningsmekanismen for den hemmende aktivitet av physciosporin mot lungekreft cellemotilitet, effekter av aceton ekstrakt av
P
.
coriacea Hotell og physciosporin ble undersøkt i flere signalveier. Først ble endringer i nivåene av epitel-mesenkymale (EMT) da målt i behandlede celler (fig 4). I vår studie, avtar i uttrykket av N-cadherin var fremtredende i A549 celler behandlet med aceton ekstrakt av
P
.
coriacea
eller physciosporin på både protein og mRNA nivåer (fig 4B og 4C), mens de av E-cadherin forble marginal (fig 4A og data ikke vist for E-cadherin mRNA). I tillegg er uttrykk for sneglen og Twist ble doseavhengig redusert med aceton ekstrakt av
P
.
coriacea
eller physciosporin behandling (fig 4C). Samlet utgjør disse resultatene tyder på at aceton ekstrakt av
P
.
coriacea
og physciosporin ha inhiberende aktivitet mot lungekreft cellemotilitet delvis gjennom hemming av EMT.
(AB) Western blot-analyse av E-cadherin (A) og N-cadherin (B) i A549-celler ble behandlet med 5 pg /mL aceton ekstrakter av
P
.
coriacea
eller physciosporin. (C) Kvantitativ analyse av mRNA-nivåer av N-cadherin, sneglen og vri i A549-celler behandlet med 5 pg /ml av aceton ekstrakter av
P
.
coriacea
eller physciosporin. Kvantitative data ble oppnådd fra minst to uavhengige eksperimenter. Data representerer gjennomsnitt ± SEM (Standardfeil av middelverdien). * P 0,05; ** P 0,01; *** P. 0,001 sammenlignet med DMSO-behandlede A549 celler
Aceton ekstrakt av
P
.
coriacea Hotell og physciosporin trykt KITENIN-mediert AP-1 aktivitet og påvirket uttrykk for KAI1 og KITENIN
Deretter endringer i transkripsjons aktiviteter β-catenin /LSF-en (TOPFLASH), AP -1 (AP-1-luc), NF-kB (NF-kB-luc) og STAT (STAT-luc) ble målt i behandlede celler. I en foreløpig test, ble kun AP-1 aktivitet redusert med aceton ekstrakt av
P
.
coriacea
eller physciosporin behandling på en doseavhengig måte i fravær av ko-aktivator (data ikke vist). I vår tidligere studie viste vi at KITENIN (KAI1 C-terminale samspill tetraspanin) fremmer karsinogent potensial av kreft, og epidermal vekstfaktor (EGF) stimulerer KITENIN-mediert AP-1-aktivering [24]. For ytterligere å teste effekten av aceton ekstrakt av
P
.
coriacea
eller physciosporin på KITENIN-mediert AP-1 aktivitet, AP-1 reporter ble utført i celler co-transfektert med KITENIN. Som vist i figur 5A, KITENIN-mediert AP-1-aktiviteten ble redusert med aceton ekstrakt av
P
.
coriacea
eller physciosporin behandling på en doseavhengig måte, både med og uten EGF stimulering. For å undersøke hvordan aceton ekstrakt av
P
.
coriacea Hotell og physciosporin trykt KITENIN-mediert AP1 aktivitet, vi testet KITENIN nivåer i behandlede celler. KITENIN mRNA nivåer ble redusert med behandling (figur 5B). Den metastatisk suppressor genet, KAI1, er ofte nedregulert i metastatiske tumorceller [25, 26]. Som KITENIN har en invers sammenheng med KAI1 eller andre metastaser suppressor gener [27], testet vi mRNA nivået av KAI1 i behandlede celler og fant en lignende inverse forholdet mellom KITENIN og KAI1 (Fig 5C). Samlet utgjør disse resultatene tyder på at aceton ekstrakt av
P
.
coriacea Hotell og physciosporin sperre A549 cellemotilitet delvis gjennom undertrykkelse av KITENIN-mediert AP-en aktivitet ved å regulere KITENIN og KAI1 uttrykk. For å sjekke hvor mRNA nivået av KITENIN kan endres ved behandling, ble luciferase analyser for KITENIN promoter og 3′-UTR utført. Som et resultat av dette ble aktiviteten av KITENIN 3′-UTR dramatisk redusert etter behandling (fig 5E), mens det av KITENIN promoter forble konstant (figur 5D).
(A) AP-1 luciferase-assay av HEK293T celler transfektert med KITENIN og behandlet med 5 ug /ml av aceton ekstrakt av
P
.
coriacea
eller physciosporin i fravær eller nærvær av epidermal vekstfaktor stimulering. (B-C) Kvantitativ analyse av mRNA nivå av KITENIN (B) og KAI1 (C) på A549-celler ble behandlet med 5 pg /mL aceton ekstrakt av
P
.
coriacea
eller physciosporin. (D-E) KITENIN promoter (D) og 3′-UTR (E) luciferase analyser av HEK293T-celler ble behandlet med 5 pg /mL aceton ekstrakt av
P
.
coriacea
eller physciosporin. Kvantitative data ble oppnådd fra minst tre uavhengige eksperimenter. Data representerer gjennomsnitt ± SEM (Standardfeil av middelverdien). * P 0,05; ** P 0,01; *** P. 0,001 sammenlignet med DMSO-behandlede celler
Aceton ekstrakt av
P
.
coriacea Hotell og physciosporin redusert RhoGTPase aktivitet
Neste, endringer i virksomheten til RhoGTPases ble målt i behandlede celler (figur 6). For å undersøke effekten av aceton ekstrakt av
P
.
coriacea Hotell og physciosporin på aktiviteter til Cdc42 og Rac1, GST rullegardin analysene ble utført ved hjelp av GST-PBD (p21-bindende domene). Resultatene viste at aktiviteten til Cdc42 og Rac1 ble redusert med 20% og 33%, henholdsvis, i nærvær av physciosporin (figur 6A og 6B). RhoA aktivitet ble også redusert med aceton ekstrakt av
P
.
coriacea Hotell og physciosporin (data ikke vist). Samlet utgjør disse resultatene tyder på at aceton ekstrakt av
P
.
coriacea Hotell og physciosporin sperre A549 cellemotilitet blant annet gjennom reduksjon av RhoGTPase aktivitet. Resultatene viser at lav sekundær metabolitt, physciosporin, hemmer kreftcelle motilitet med spesifikke virkningsmekanismer.
(AB) Konsentrasjonene av GTP-bundet Cdc42 (A) og Rac1 (B) ble målt i A549 cellene behandlet med 5 pg /mL aceton ekstrakt av
P
.
coriacea
eller physciosporin. GTP-Cdc42 og -Rac1 ble målt ved hjelp av GST-PBD. Den samlede Cdc42 og Rac1 ble vist for å måle relativ aktivitet. Kvantitative data ble erholdt fra tre uavhengige forsøk, n = 3. Data representerer middelverdi ± S.E.M. (Standardfeil av middelverdien). *** P. 0,001 sammenlignet med DMSO-behandlede A549 celler
Diskusjoner
En rekke unike kjemikalier har blitt isolert fra lav som brukes for farmasøytiske formål. I denne studien har en effektiv kjemisk forbindelse physciosporin blitt isolert fra Chile lichen
Pseudocyphellaria coriacea
for sin hemmende aktivitet mot kreft celle lunge motilitet. Physciosporin, en klorert depsidone, ble først isolert i 1977 fra lav
Pseudocyphellaria physciospora
og identifisert som methyl-2-klor-4-formyl-3,8-dihydroksy-l, 6,9-trimetyl-11- okso-11
H
dibenzo [b, e] [l, 4] dioxepin-7-karboksylat (metyl-5-chlorovirensate) [22], men deres biologiske aktivitet ikke har blitt rapportert så langt. I denne studien fant vi følgende: 1) aceton ekstrakt av
P
.
coriacea Hotell og dens underkomponent, physciosporin, hemmer motilitet av lungekreftceller; 2) ekstrakt av
P
.
coriacea Hotell og physciosporin undertrykke EMT; 3) ekstrakt av
P
.
coriacea Hotell og physciosporin redusere KITENIN-mediert AP-1 aktivitet og påvirker uttrykket av KAI1 og KITENIN; og 4) ekstrakt av
P
.
coriacea Hotell og physciosporin redusere RhoGTPase aktivitet.
EMT, en essensiell fenotypiske konvertering under embryonal utvikling, vev ombygging og sårheling, spiller en uunnværlig rolle i tumorinvasjon og metastase [28-30]. Økninger i N-cadherin uttrykk og avtar i E-cadherin nivå (kalt «cadherin switching») er avgjørende i EMT og oppstår i løpet av kreft progresjon [31]. Spesielt, nivået av N-cadherin synes å representere den mesenchymale fenotypen av cellene og en gruppe av transkripsjonsfaktorer, inkludert snegle, Slug, ZEB- og Twist har en avgjørende rolle i kontrollen av EMT [32]. Snail, en sink-finger transkripsjonsfaktor først identifisert i Drosophila, er en viktig EMT regulator [33]. Twist har også en viktig rolle i kreftmetastaser. For eksempel, hemming av Twist ekspresjon av korte interfererende RNA påvirker metastatiske kraft [34], og regulering av Twist-1 kan bidra til motstandsdyktighet mot paclitaxel og antimikrotubulær medikamenter hos kreftpasienter [35]. Vår Resultatet viste at nivåene av N-cadherin, Snail og Twist ble redusert med aceton ekstrakt av
P
.
coriacea Hotell og physciosporin behandling mens de av E-cadherin forble marginal (fig 4). Av notatet er at i noen tilfeller, endringer i E-cadherin nivå er ikke avgjørende for EMT [36] eller metastatisk aktivitet av tumor [37].
KITENIN er en metastase fremmende genet. Nylig identifiserte vi at KITENIN /ErbB4-Dvl2-c-Jun aksen er en ukonvensjonell EGFR-uavhengig nedstrøms signal av EGF og formidler invasivitet og tumorigenesis av kreftceller [24]. I våre resultater, ble KITENIN-mediert AP-1 aktivitet redusert med ekstrakt av
P
.
coriacea Hotell og physciosporin. Spesielt, ble ekspresjonen av KITENIN ble redusert ved behandling, og for dette ble det 3′-UTR-aktivitet av KITENIN dramatisk redusert (figur 5). Få KITENIN målretting microRNAs undertrykke migrasjon og invasjon av cellene via moduler KITENIN uttrykk ble rapportert og MIR-27a, MIR-30b, og MIR-124 er blant eksemplene [15]. Foreløpig vet vi ikke om physciosporin sannsynlig fungerer som microRNAs å undertrykke 3′-UTR aktivitet KITENIN. Men som ukonvensjonelle KITENIN /ErbB4-mediert nedstrøms signal av EGF spiller en av det molekylære grunnlag for utviser resistens mot anti-EGFR-midler, ekstrakt av
P
.
coriacea Hotell og physciosporin kan ha potensial gunstig aktivitet i å overvinne den begrensede kliniske effekten av anti-EGFR terapi.
Rho GTPases, medlemmer av Ras super små GTPases som Rac1, Cdc42, og
