Abstract
Bakgrunn
Runt relaterte transkripsjonsfaktor 3 (RUNX3) er en tumor suppressor av kreft og ser ut til å være en viktig del av den transformerende vekstfaktor-beta (TGF-ß ) indusert tumor undertrykkelse veien. Overraskende, fant vi at RUNX3 uttrykket nivå i hode og nakke plateepitelkarsinom (HNSCC) vev, som er en av de mest vanlige typer kreft hos mennesker, var høyere enn i normalt vev av en tidligere utgitt microarray datasettet i vår forstudie. Derfor, her undersøkte vi onkogene rolle RUNX3 i HNSCC. Ble observert
hovedfunnene
Hyppig RUNX3 uttrykk og dens korrelasjon med ondartet atferd i HNSCC. Ektopisk RUNX3 overekspresjon fremmet cellevekst og hemmet serum sult-indusert apoptose og kjemoterapeutisk legemiddelindusert apoptose i HNSCC celler. Disse funnene ble bekreftet av RUNX3 knockdown. Videre RUNX3 overekspresjon forbedret tumorsphere formasjon. RUNX3 Ekspresjonsnivået var godt korrelert med metylering status i HNSCC-celler. Videre RUNX3 uttrykk var lav på grunn av metylering av sin promoter i normale orale epitelceller.
Konklusjon /Betydning
Våre funn tyder på at i) RUNX3 har en onkogen rolle i HNSCC, ii) RUNX3 uttrykk observert i HNSCC kan være forårsaket delvis av demetylering under kreftutvikling, og iii) RUNX3 uttrykk kan være en nyttig markør for å forutsi ondartet adferd og effekten av cellegifter i HNSCC
Citation. Tsunematsu T, Kudo Y, Iizuka S, Ogawa jeg, Fujita T, Kurihara H, et al. (2009) RUNX3 Har en onkogen rolle i hode- og halskreft. PLoS ONE 4 (6): e5892. doi: 10,1371 /journal.pone.0005892
Redaktør: Torbjørn Ramqvist, Karolinska Institutet, Sverige
mottatt: 04.02.2009; Godkjent: 15 mai 2009; Publisert: 12 juni 2009
Copyright: © 2009 Tsunematsu et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Forskningen ble støttet med tilskudd-i-hjelp fra departementet for utdanning, vitenskap og kultur i Japan (YK og TT) og Satake utdanning og forskningsstipend (YK). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
RUNX3 /AML2 /PEBP2C /CBFA3 er en transkripsjonsfaktor og en av de Runt relaterte (RUNX) familie. Tre medlemmer av Runx familiens gener,
RUNX1
,
RUNX2 Hotell og
RUNX3
, og beslektede gener,
CBFB /Pebpb2
, er alle kjent som utviklings regulatorer og har vist seg å være viktig i kreft hos mennesker [1]. RUNX3 ble opprinnelig klonet som AML2 og er lokalisert på kromosom 1p36.1 [2]. RUNX3 har flere funksjoner, og ble først rapportert å korrelere med genesis og progresjon av menneskelig magekreft som en tumor suppressor [2]. Runx3-null-mus oppviser hyperplasi av mageslimhinnen som et resultat av stimulert proliferasjon og undertrykket apoptose av epitelceller i [3]. Faktisk er RUNX3 inaktivert i mer enn 80% av menneskelig magekreft av genet Slå og protein mislocalization [4]. Dessmagekreft, er det blitt rapportert at redusert ekspresjon av RUNX3 ble observert i en rekke kreftformer, inkludert blære, lever, kolorektal- og lungekreft [5] – [8]. I disse svulstene ble redusert uttrykk for RUNX3 ofte forårsaket av CpG island hypermethylation [9]. Videre punktmutasjoner av
RUNX3
ble observert i visse typer kreft hos mennesker, inkludert mage og blære kreft [3], [5]. Til sammen RUNX3 fungerer som en tumor suppressor i ulike kreftformer.
hode og hals plateepitelkarsinom (HNSCC) er en av de mest vanlige typer kreft hos mennesker, med en årlig forekomst av mer enn 500.000 tilfeller på verdensbasis [ ,,,0],10]. Som de fleste epiteliale cancere, utvikler HNSCC gjennom oppbygging av flere genetiske og epigenetiske forandringer i en flertrinnsprosess [11]. Overraskende, fant vi at RUNX3 uttrykket nivå i HNSCC vev var høyere enn i normalt vev av en tidligere utgitt microarray datasett av 41 HNSCC pasienter og 13 friske kontrollpersoner i vår innledende studie [12] (figur 1A). Interessant, det nylig er blitt rapportert at RUNX3 overekspresjon ble observert i basal cellekarsinom i huden [13]. Derfor tenkte vi at RUNX3 kan ha en onkogen rolle i HNSCC samt i basalcellekarsinom av huden. I denne studien undersøkte vi uttrykket og roller RUNX3 for HNSCC utvikling
A:. Total RNA fra 41 primær HNSCC og 13 normale vev ble merket og hybridisert til Affymetrix U133A Gene Chips som tidligere rapportert. Grafen viser gjennomsnittet av signalintensiteten RUNX3 i 41 HNSCC og 13 normalt vev i microarray analyse. RUNX3 Ekspresjonsnivået i HNSCC er høyere enn den til normale vev. B: Uttrykk for RUNX3 mRNA i 14 HNSCC cellelinjer (HSC2, HSC3, HSC4, Ca9-22, Ho-1-N-1, Ho-1-U-1, ZA, HOC719-PE, HOC719-NE, HOC621, HOC119, HOC313, TSU og OMI) ved RT-PCR. GAPDH ble anvendt som en kontroll. C: Uttrykk for RUNX3 mRNA i ulike kreftcellelinjer inkludert tykktarmskreft (RKO og HCT116), magekreft (MKN-en og MKN-45), leukemi (HL60), lymfom (U937) og brystkreft (MCF7 og SK-BR3 ). GAPDH ble anvendt som en kontroll. D: Uttrykk for RUNX3 mRNA i 18 HNSCC tilfeller av RT-PCR. GAPDH ble anvendt som en kontroll. E: Expression of RUNX3 protein i 6 HNSCC cellelinjer (HSC2, HSC3, HSC4, Ca9-22, Ho-1-N-1 og Ho-1-U-1) ble undersøkt med Western blot analyse. Cul1 uttrykk ble brukt som en lasting kontroll.
Materialer og metoder
Reagenser
transformerende vekstfaktor SS1 (TGF-ß), grunnleggende fibroblast vekstfaktor (bFGF ) og blodplateavledet vekstfaktor-AA (PDGF-AA) ble oppnådd fra R 5′-CAGAAGCTGGAGGACCAGAC-3 «og revers primer; 5»-TCGGAGAATGGGTTCAGTTC-3 «. GAPDH ble anvendt som en kontroll. Alikvoter av total-cDNA ble amplifisert med Go Taq® grønne Master Mix (Promega), og amplifikasjoner ble utført i en PC701 termosykler (Astec, Fukuoka, Japan) i 30 sykluser etter en første 30 sek denaturering ved 94 ° C, varmebehandlet i 30 sek ved 60 ° C, og forlenget i 1 min ved 72 ° C i alle primere. Amplifikasjonsreaksjonen produkter ble løst på 1,5% agarose /TAE gels (Nacalai tesque, Inc., Kyoto, Japan), elektroforese ved 100 mV, og visualisert ved ethidium-bromide farging.
Western blot analyse
Western blotting ble gjennomført som vi beskrev tidligere [14]. En anti-RUNX3 monoklonalt antistoff (R3-5G4, vennlig levert av Dr. Ito, Institutt for molekylær og cellebiologi, Singapore), anti-FLAG monoklonalt antistoff (M2, Sigma) og anti-Cul1 polyklonale antistoff (Zymed) ble brukt. Tretti ug protein ble underkastet 10% polyakrylamidgel-elektroforese etterfulgt av elektroblotting på et nitrocellulosefilter. For påvisning av immuno-komplekset, ECL western blotting deteksjonssystem (Amersham) ble brukt.
Immunhistokjemisk farging
Immunhistokjemisk påvisning av RUNX3 i HNSCC tilfeller ble utført på 4,5 mikrometer seksjoner montert på silisium -belagte glass, ved hjelp av et streptavidin-biotin peroksidase teknikk som beskrevet tidligere [14]. Immunhistokjemisk påvisning av Runx3 i menneskelige ulike krefttilfeller blant annet 3 spiserør kreft, 3 mage kreft, 3 tykktarm kreft, 3 endetarm kreft, 3 bukspyttkjertel kreft, 3 leverkreft, 3 lungekreft, 3 nyrekreft, 3 blærekreft, og 4 livmor kreft ble utført ved hjelp av vev microarray (MBL Co. Ltd., Nagoya, Japan). For immunhistokjemiske studien ble en anti-RUNX3 monoklonalt antistoff (R3-6E9, vennlig levert av Dr. Ito, Institutt for molekylær og cellebiologi, Singapore) som brukes. For immunhistokjemisk undersøkelse av musevev, ble et anti-Runx3 monoklonalt antistoff (R3-1E10, MBL Co. Ltd.) anvendt. Ekspresjon av RUNX3 ble gradert som positive (over 5% av tumor eller epitelceller viste immunopositivity) og negative (mindre enn 5% av tumor eller epitelceller viste svak eller fokal immunopositivity eller ingen farging). Tre patologer (Y.K., I.O., og T.T.) gjort alle vurderinger. Mulig sammenheng mellom variabler av de analyserte tumorprøver ble testet for tilknytning av Fishers eksakte test. En
P
verdi 0,05 var nødvendig for betydningen
5-aza-2′-deoxycytidine behandling
HSC4 celler og normale epitelceller ble behandlet med medium som inneholdt 300 nM. 5-aza-2′-deoksycytidin (5-aza-dC, Sigma) i 72 timer. Etter behandling ble cellene oppsamlet og undersøkt ekspresjon av RUNX3 mRNA ved RT-PCR.
Bisulfite modifikasjon og metylering-spesifikke polymerase kjedereaksjon (PCR)
Genomisk DNA fra celler eller vev ble ekstrahert bruker DNeasy Kit (Qiagen, Hilden, Tyskland). Femti mikro liter av supernatanten ble benyttet direkte som en kilde for DNA for natriumbisulfitt behandling. DNA-prøver ble behandlet med sulfitt for å konvertere alle unmethylated cytosines å uraciler mens forlate denaturert cytosines upåvirket. DNA ble denaturert ved NaOH (sluttkonsentrasjon, 0,2 M) i 10 minutter ved 37 ° C. Tretti pl av 10 mM hydrokinon (Sigma) og 520 ul av 3 M natriumbisulfitt (Sigma) ved pH 5,0 både nyfremstilt, ble tilsatt og blandet, og prøvene ble inkubert ved 50 ° C i 16 timer. Modifisert DNA ble renset ved anvendelse av Wizard DNA-rensing resin (Promega) og eluert i 50 ul vann. Modifikasjon ble fullført av NaOH (sluttkonsentrasjon, 0,3 M) behandling i 5 minutter ved romtemperatur, etterfulgt av etanolutfelling. Modifiserte DNA ble amplifisert i en 20 ul reaksjonsvolum inneholdende 2 ul 10 x PCR-buffer med 15 mM MgCl2, 4 mL 5xQ-løsning, 10 pM hver primer, 0,2 mM dNTP og 0,75 U Taq-polymerase (HotStar Taq-DNA-polymerase, Qiagen, Hilden, Tyskland). Etter at blandingen ble oppvarmet ved 95 ° C i 15 minutter, ble PCR utført i et termosykler (GeneAmp 2400, PE-Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) for 35 sykluser med denaturering ved 94 ° C i 30 sekunder, annealing ved 58 ° C i 60 sek, og forlengelse ved 72 ° C i 60 sekunder, etterfulgt av en endelig 10 min forlengelse ved 72 ° C. PCR-produktene ble separert på en 8% ikke-denaturerende polyakrylamidgel. RUNX3 CpG øy og analysert regioner (nr 1-10) er vist i figur 2B. De primersett brukt i denne studien var oppført i tabell S1 (GenBank tiltredelse antall AL023096) [15]
A:. Uttrykk for RUNX3 ble undersøkt i hud epitel (× 100 og × 250, øvre panel), normal oral slimhinne (× 100 og × 250, midtre panelet) og normal oral slimhinne med infiltrasjon av kroniske betennelsesceller (× 100 og × 250, nedre panel). I hud epitel, noen av epidermale celler viste RUNX3 ekspresjon i sine kjerner. I normale orale slimhinnevevet, bare noen epitelceller i basallaget uttrykt RUNX3 i sine kjerner, og de fleste epitelceller uttrykte ikke RUNX3. I normal oral slimhinne med infiltrasjon av kroniske betennelsesceller, lymfocytter infiltrere inn i munnslimhinnen viste RUNX3 uttrykk. B: Uttrykk for RUNX3 ble undersøkt i HNSCC tilfeller (× 100). De fleste kreftceller uttrykt RUNX3 i sine kjerner.
Generering av RUNX3-overekspresjon HNSCC celler
En RUNX3 uttrykk plasmid, pcDNA3 koding FLAG tagget RUNX3 cDNA ble vennlig levert av Dr. Ito (institutt for molekylær og cellebiologi, Singapore). Den RUNX3 /pcDNA3-plasmid eller vektor alene ble innført i HSC3 celler, og deretter G418 (500 ug /ml, Gibco) ble tilsatt til kulturmediet etter 48 timer av transfeksjon. Etter 2 uker med G418 utvalg, vi oppnådd de stabile basseng kloner. Celletransfeksjoner ble utført ved anvendelse av Fugene 6 (Roche) i henhold til fremstilling instruksjon.
Dempe av Lie interfererende RNA
Logaritmisk voksende Ca9-22 celler ble sådd ut ved en tetthet på 10
5cells /6 cm parabol og transfektert med oligos to ganger (på 24 og 48 timer etter replating) ved hjelp Oligofectamine (Invitrogen) som beskrevet [16]. Førti-åtte timer etter den siste transfeksjon ble lysater fremstilt og analysert ved hjelp av SDS-PAGE og immunoblotting. SiRNA er en 19 bp duplex oligoribonukleotid med en følelse tråd som tilsvarer nukleotider 275-293 av menneskelig RUNX3 mRNA sekvens; 5′-ccuucaaggugguggcauu-3 «. En kryptert sekvens som ikke viser signifikant homologi med rotte, mus eller humane gensekvenser ble anvendt som en kontroll.
Strømningscytometrisk analyse
Cell syklus fordeling ble bestemt ved DNA-innhold analyse etter propidiumjodid farging. Celler ble dyrket som beskrevet ovenfor, og fiksert i 70% etanol og lagret ved 4 ° C før analyse. Strømningscytometrisk bestemmelse av DNA-innholdet ble analysert ved hjelp av en FACS calibur (Becton-Dickinson, San Jose, CA) strømningscytometer. For hver prøve ble 20.000 hendelser lagret.
Annexin V og Propidium Iodide Dual-Farging analysen
Etter serum sult eller Dox behandling, cellene ble deretter farget med fluorescein (FITC) -konjugert Annexin V og propidiumjodid (PI), ved hjelp av Annexin V-FITC apoptose Detection kit (Becton Dickinson) i henhold til produsentens instruksjoner. Apoptotiske celler ble identifisert ved dual-farging med rekombinant FITC-konjugert med Annexin V og propidiumjodid (PI). Datainnsamling og analyse ble gjort i en FACSCalibur (Becton Dickinson) strømningscytometer hjelp Cellquest programvare.
Resultater
Meget uttrykk for RUNX3 i HNSCC
Først vi undersøkte uttrykk for RUNX3 i 14 HNSCC cellelinjer (HSC2, HSC3, HSC4, Ca9-22, Ho-1-U-1, Ho-1-N-1, ZA, HOC719-PE, HOC719-NE, HOC621, HOC119, HOC313 , TSU, og OMI). RUNX3 mRNA ble observert i 9 av 14 HNSCC cellelinjer (figur 1B). I visse typer av humane kreftformer, inkludert gastrisk og blære, har det blitt rapportert Det ble observert at punktmutasjoner av RUNX3 [3], [5]. Det ble imidlertid ikke mutasjoner funnet i HNSCC-cellelinjer med RUNX3 mRNA ekspresjon (Ca9-22, Ho-en-U-en og Ho-1-N-1) (data ikke vist). RUNX3 mRNA uttrykk ble også undersøkt i ulike kreftcellelinjer inkludert tykktarmskreft (RKO og HCT116), magekreft (MKN-en og MKN-45), leukemi (HL60), lymfom (U937) og brystkreft (MCF7 og SK-BR3 ) (figur 1C). RKO, MCF7 og SK-BR3 cellene uttrykte ikke RUNX3 mRNA. Som tidligere rapportert, var RUNX3 uttrykk godt korrelert med metylering status, med unntak av SK-BR3-celler [17] – [20]. I SK-BR3-celler, er nedregulering av RUNX3 antatt å være forårsaket av ukjent mekanisme [20]. Vi har også undersøkt uttrykk for RUNX3 mRNA i 18 HNSCC vev. I 13 av 18 (72,2%) HNSCC vev, ble RUNX3 mRNA uttrykk observert (figur 1D). Deretter ble RUNX3 protein uttrykk undersøkt med Western blot analyse i 6 HNSCC celler (HSC2, HSC3, HSC4, Ca9-22, Ho-1-U-1 og Ho-1-N-1) (figur 1E). Blant dem, Ca9-22, Ho-en-U-1 og Ho-1-N-1-celler uttrykte RUNX3 protein, som svarer til mRNA-ekspresjon. Deretter undersøkte vi RUNX3 uttrykk i 9 normale munnslimhinnen vev og 52 HNSCC tilfeller ved immunhistokjemi. Først brukte vi hud epitel og tykktarmsslimhinnen for reaktivitet av RUNX3 uttrykk. Som vist i fersk rapport [13], epidermal cellene viste også RUNX3 uttrykk i sine kjerner (figur 2A, øvre panel). Vi har også undersøkt RUNX3 uttrykk i tykktarmskreft. I tykktarmskreft, er RUNX3 antatt å være et tumorsuppressorgen [18]. Som tidligere rapportert [18], RUNX3 uttrykk ble observert i sine kjerner av normal slimhinne, mens tykktarmskreftceller ikke uttrykke RUNX3 (figur S1). I normale orale slimhinnevevet, bare noen epitelceller i basallaget svakt uttrykt RUNX3 i sine kjerner, og de fleste epitelceller ikke uttrykte (figur 2A, midtre panel). Lymfocytter infiltrere inn i normal munnslimhinnen viste RUNX3 uttrykk (figur 2A, nedre panel). Immunopositivity av RUNX3 i lymfocytter ble anvendt som en positiv kontroll av farging. På den annen side, de fleste kreftceller uttrykt RUNX3 i deres kjerner (figur 2B). Vi bekreftet også at kjernefysisk ekspresjon av RUNX3 ved hjelp av nukleær og cytoplasmiske fraksjon av HNSCC cellelinjer, noe som indikerer ingen protein mislocalization (data ikke vist). RUNX3 ekspresjon ble hyppig observert i 50% (26 av 52) av HNSCC tilfeller (tabell 1). Videre sammenlignet vi RUNX3 uttrykk med klinisk-patologiske funn inkludert differensiering, invasivitet og metastasering. Interessant, RUNX3 uttrykk var godt korrelert med maligne atferd inkludert dårlig differensiering, invasivitet og metastase (tabell 1).
Metylering status for
RUNX3
var godt korrelert med sin mRNA uttrykk i HNSCC
Vi spurte hvordan RUNX3 uttrykk skyldtes i HNSCC. Redusert ekspresjon av RUNX3 er ofte forårsaket av CpG øy hypermethylation i forskjellige typer av kreft [9]. Faktisk ble RUNX3 ekspresjon observert i HSC4 celler uten RUNX3 uttrykk etter 5-aza-2′-deoksycytidin behandling (figur 3A). Homma et al. undersøkte metylering status for flere regioner av
RUNX3
promoter CpG island (3478 bp) innenfor den proksimale promoter (nr 1-10) i mage kreft og fant at metylering i regionen spenner over transkripsjon start stedet (No . 5-8) er kritisk for tap av RUNX3 uttrykk (figur 3B) [15]. For å undersøke
RUNX3
metylering status i HNSCC, analyserte vi metylering av
RUNX3
alle promotorområdene (nr 1-10) ved metylering spesifikk PCR på panelet av HNSCC cellelinjer (figur 3C og 3D). HNSCC celler med RUNX3 uttrykk viste unmethylation eller delvis metylering på nr 5-8 regionen (figur 3D). HNSCC celler uten RUNX3 uttrykk viste fullt metylering på nr 5 og nr 6 regionen. Dermed metylering status for
RUNX3
promoter-regionen var godt korrelert med RUNX3 mRNA uttrykk i HNSCC cellelinjer
A:. RUNX3 uttrykk ble undersøkt etter 5-aza-2′-deoxycytidine (5 -Aza) behandling. HSC4 celler ble behandlet med medium inneholdende 300 nM 5-aza-2′-deoksycytidin i 72 timer. Etter behandling ble cellene oppsamlet og undersøkt ekspresjon av RUNX3 mRNA ved RT-PCR. B:
RUNX3
CpG island og analysert regioner (nr 1-10) er vist som vertikale barer. Transkripsjonell start hotellet (TSS) ligger innenfor region No. 7. C: Metylering statusen RUNX3 i HNSCC cellelinjer. Genomisk DNA ble ekstrahert fra HNSCC cellelinjer og ble behandlet med bisulfitt. Metylering status av promoter-regionen (nr 1-10) ble undersøkt ved metylering spesifikk PCR-metoden. D: Oppsummeringen av metylering og uttrykk status for RUNX3 i HNSCC cellelinjer. E: Uttrykk for Runx3 i mus tunge epitel av embryo (øvre panel) og voksne (nedre panel) mus ved immunhistokjemi. Tunge vev av mus embryo på embryodag 15,5 og 10 uker gamle BALB /c-mus ble anvendt. F: RUNX3 mRNA-ekspresjon ble undersøkt ved hjelp av RT-PCR i 4 primære dyrkede normale orale epitelceller (# 1- # 4). HSC4 celle ble anvendt som en negativ kontroll og Ca9-22 celle ble anvendt som en positiv kontroll for RUNX3 ekspresjon. GAPDH ble anvendt som en kontroll. G: RUNX3 ekspresjon ble undersøkt etter 5-aza-2′-deoksycytidin (5-Aza) behandling. Primære dyrkede normale orale epitelceller (# 1 og # 2) ble behandlet med medium inneholdende 300 nM 5-aza-2′-deoksycytidin i 72 timer. Etter behandling ble cellene oppsamlet og undersøkt ekspresjon av RUNX3 mRNA ved RT-PCR. H: Genomisk DNA ble ekstrahert fra 4 primære dyrkede normale orale epitelceller (# 1- # 4). Metylering status ved region No. 5-8 ble undersøkt ved metylering spesifikk PCR-metoden. I: Oppsummeringen av metylering og uttrykk status for RUNX3 i normale epitelceller
Siste rapport viser at Runx3 er uttrykt i tungen og ganen epitel museembryoer fra embryonale dag 12,5 til 16,5, og at. Runx3 uttrykk avtar etter embryonale dag 16,5 og forsvinner hos nyfødte mus [21]. Her finner vi også bekreftet at Runx3 ekspresjon ble observert i tunge epitel fra mus embryo (E15.5), men ikke i voksen mus tunge epitel (10 uker gammel) (figur 3E). Disse funnene gjort oss hypoteser om at
RUNX3
kan bli brakt til taushet ved metylering hos voksne orale epitelceller. Munnslimhinnen vev inneholder vanligvis bindevev og infiltrere lymfocytter. Som vist i figur 2A (nedre panel), lymfocytter infiltrere inn i normal munnslimhinnen viste RUNX3 uttrykk. Derfor brukte vi primære dyrkede epitelceller hentet fra normal oral epitel i denne studien for å unngå forurensning av lymfocytter. I likhet med immunhistokjemiske studier (Figur 2A), 4 primære dyrkede epitelceller hentet fra normal oral epitel (# 1- # 4) uttrykte ikke RUNX3 mRNA (Figur 3F), noe som indikerer at uttrykk nivået RUNX3 er lav eller fraværende i voksen normal oral epitel. Vi undersøkte RUNX3 uttrykk etter 5-aza-2′-deoxycytidine behandling. RUNX3 ekspresjon ble oppregulert ved 5-aza-2′-deoksycytidin-behandling i 2 primære dyrkede epitelceller (# 1 og # 3) (figur 3G). Deretter undersøkte vi om
RUNX3
ble brakt til taushet av metylering hos voksne orale epitelceller. Vi utførte metylering-spesifikk PCR i 4 primære dyrkede epitelceller på det område som strekker seg over transkripsjonsstartsetet av
RUNX3
(nr 5-8), som er kritisk for tap av RUNX3 ekspresjon i HNSCC-celler (figur 3C). Interessant, 2 primære dyrkede epitelceller (# 1 og # 2) viste delvis metylering på nr 6 og nr 7 regionen, og en annen 2 primære dyrkede epitelceller (# 3 og # 4) viste fullt metylering på nr 7 og No . 8 regionen (figur 3 H og 3I).
RUNX3 overekspresjon forbedret celleproliferasjon og hemmet apoptose
for å vite hvilken rolle RUNX3 i HNSCC, vi stabilt transfektert et uttrykk vektor av FLAG-RUNX3 inn HSC3 celler med lavere uttrykk for RUNX3. Vi fikk stabilt RUNX3 overekspresjon celler (figur 4A). Interessant, RUNX3 overekspresjon forbedret cellevekst (figur 4B). Ved 6 dagers, antall RUNX3 overekspresjon celler var bemerkelsesverdig høyere enn for kontrollceller. Selv om vi undersøkt migrasjon og invasjon, gjorde RUNX3 overekspresjon ikke fremme migrasjon og invasjon (figur S2). Videre økte befolkning svarende til side G1 etter serum sult ble kun observert i kontrollceller, men ikke i RUNX3 overekspresjon celler (Figur 4C). For å demonstrere hvorvidt dette inkrement av sub-G1 detektert i kontrollcellene etter serum sult skyldes apoptose, ble nivået av apoptose vurdert ved hjelp av annexin V-FITC /propidiumjodid-analyser (figur 4D). Annexin V /propidiumjodid dobbel-positive celler ble observert i 1,8% av RUNX3 overekspresjon celler, mens i 21,7% av kontrollcellene, hvilket indikerer at RUNX3 overekspresjon hemmet i sult serum indusert apoptose. For å bekrefte disse fenotyper, undersøkte vi knockdown av RUNX3 i Ca9-22 celler, som viste RUNX3 overekspresjon og var resistente mot serum sult-indusert apoptose. For knockdown av RUNX3, brukte vi tre forskjellige siRNAs (SI-RUNX3-1, si-RUNX3-2 og si-RUNX3-3) og deres cocktail. RUNX3 uttrykk ble bemerkelsesverdig brakt til taushet av si-RUNX3-1 (figur S3A). Derfor brukte vi si-RUNX3-1 for følgende studier. RUNX3 siRNA transfeksjon redusert ekspresjon av RUNX3 mRNA og protein i Ca9-22 celler (figur 5A). Vi undersøkte om siRNA induserte en ikke-spesifikk interferon stressrespons. RUNX3 siRNA behandling fremkalte ikke klassiske interferon-responsive gener, OAS1 og ISG54 mRNA, noe som indikerer at RUNX3 siRNA behandling induserte ikke signifikant interferon respons (figur S3b). Som vi forventet, RUNX3 siRNA hemmet cellevekst (figur 5B). Ved 6 dagers, antall RUNX3 siRNA behandlede celler var bemerkelsesverdig lavere enn for kontrollceller. Videre økte RUNX3 siRNA befolkningen tilsvarer sub-G1 etter serum sult (figur 5C). Annexin V /propidiumjodid- dobbel-positive celler ble observert hos 10,5% av kontrollceller, mens 18,1% av RUNX3 knockdown celler (figur 5D)
A:. Generering av RUNX3 overekspresjon celler. Den RUNX3 /pcDNA3-plasmid eller vektor alene ble innført i HSC3 celler, og de stabile bassenget kloner ble erholdt ved G418-seleksjon etter 2 uker. Eksogent ekspresjon av RUNX3 mRNA og protein ble undersøkt ved hjelp av RT-PCR og Western blot analyse (WB). Cul1 ble anvendt som en kontroll lasting. B: Grafen viser cellevekst av RUNX3 overekspresjon og kontroll HSC3 celler. Celler ble sådd ut på 24 brønners plater, og trypsineres cellene ble tellet ved celleteller (Coulter Z1) ved 0, 2, 4 og 6 dagers. C: RUNX3 overekspresjon hemmet serum sult indusert apoptose. Cellene ble inkubert i 0, 48 og 96 timer etter serum sult og fiksert i 70% etanol. Cellesyklusfordelingen ble bestemt ved DNA-innhold analyse etter propidiumjodidfarging ved hjelp av et strømningscytometer. For hver prøve ble 20.000 hendelser lagret. Vi utførte to uavhengige forsøk. D: Flow-cytometrisk analyse av Annexin V og propidiumjodidfarging i kontroll og RUNX3 overekspresjon celler etter serum sult i 96 timer. Vi utførte to uavhengige eksperimenter
A:. RUNX3 stanse av små interfererende RNA. Logaritmisk voksende celler med Ca9-22 RUNX3 ekspresjon ble sådd ut ved en tetthet på 10
5cells /6 cm tallerken og transfektert med oligoer to ganger (ved 24 og 48 timer etter replating). Førti-åtte timer etter den siste transfeksjon, ble cellene samlet og RUNX3 mRNA og protein-ekspresjon ble undersøkt ved hjelp av RT-PCR og Western blot-analyse. B: Grafen viser at cellevekst av RUNX3 siRNA behandlede og kontroll Ca9-22 celler. Celler ble sådd ut på 24 brønners plater, og trypsineres cellene ble tellet ved celleteller på 0, 2, 4 og 6 dagers. C: RUNX3 siRNA forbedret serum sult indusert apoptose. Cellesyklusfordelingen ble bestemt ved DNA-innhold analyse etter propidiumjodidfarging ved hjelp av et strømningscytometer. For hver prøve ble 20.000 hendelser lagret. Vi utførte to uavhengige forsøk. D: Flowcytometrisk analyse av Annexin V og propidiumjodidfarging i kontroll og RUNX3 knockdown celler etter serum sult i 96 timer. Vi utførte to uavhengige forsøk.
I tillegg har vi undersøkt hemming av apoptose etter behandling med kjemoterapeutisk stoff i kontroll og RUNX3 overekspresjon HNSCC (figur 6). Kontroll og RUNX3 overekspresjon HSC3 celler ble eksponert i 72 timer til adriamycin (DOX, 0,5 og 1 pg /ml), som er et kjemoterapeutisk middel som vanligvis brukes ved behandling av HNSCC. Den sub-G1 populasjon av RUNX3 overekspresjon HSC3 celler var 7,49%, mens den for kontrollceller var 44,76% etter behandling med 1 ug /ml DOX (figur 6A). Dessuten, etter behandling med 1 pg /ml av DOX, Annexin V /propidium jodid ble observert dobbel-positive celler i 25,2% av kontrollceller, mens i 8,9% av RUNX3 overekspresjon-celler (figur 6B). På den annen side, Annexin V /propidiumjodid dobbel-positive celler økte med RUNX3 knockdown (figur 6C). Alt i alt tyder på at disse RUNX3 overekspresjon kan være involvert i utvikling HNSCC gjennom å fremme cellevekst og inhibering av apoptose
A.: Adriamycin (Dox, 0, 0,5 og 1 pg /ml) ble behandlet i 72 timer i kontroll og RUNX3 overekspresjon HSC3 celler. Cellesyklusfordelingen ble bestemt ved DNA-innhold analyse etter propidiumjodidfarging ved hjelp av et strømningscytometer. For hver prøve ble 20.000 hendelser lagret. Prosent av sub-G1 befolkningen er indikert. Vi utførte to uavhengige eksperimenter med tredoble brønner per tilstand. Representative data vises. B: Flow-cytometrisk analyse av Annexin V og propidiumjodidfarging i kontroll og RUNX3 overekspresjon celler etter DOX behandling i 72 timer ved de angitte doser. C: Flow-cytometrisk analyse av Annexin V og propidiumjodidfarging i kontroll og RUNX3 knockdown celler etter DOX behandling i 72 timer ved de angitte doser. Vi utførte to uavhengige forsøk.
For å vite hvilken rolle RUNX3 i tumorigenesis, undersøkte vi tumorsphere formasjon ved hjelp av ultra lave festeplater. RUNX3 overekspresjon fremmet tumorsphere dannelse (Figur S4A og S4B). Gjennomsnittlig antall kolonier var 535,6 og 663,3 i kontroll og RUNX3 overekspresjon celler, henholdsvis (figur S4B). Videre RUNX3 knockdown hemmet tumorsphere dannelse (Figur S4C og S4D).
