Abstract
Kreft har blitt avslørt for å være svært heterogen når det gjelder hyppighet og typer av mutasjoner stede i celler fra forskjellige ondartede svulster. Således er det sannsynlig at ensartet klinisk behandling er ikke optimal for alle pasienter, og at utviklingen av individuelle terapeutiske regimer kan være fordelaktig. Vi beskriver generering av flere, unike små peptider ni til trettifire aminosyrer i lengde som, når de er merket med radioisotopen
32P, bind med vidt forskjellig effektivitet til cellelinjer avledet fra forskjellige kolon adenokarsinomer. I tillegg er den mest effektive av disse peptidene overfører permanent
32P radioisotopen til tykktarmskreftcelleproteiner i løpet av to timer med en hastighet som er mer enn 150 ganger høyere enn i cellelinjer avledet fra andre kreftformer eller fra normale vev som ble testet. For tiden er de to eneste FDA-godkjente radioimmunotherapeutic midler som er i bruk både anvender antistoffer rettet mot B-celle-markør CD20 ved behandling av non-Hodgkins lymfom. Ved å anvende fremgangsmåten beskrevet heri, kan et stort antall ulike
32P-merkede peptider lett fremstilles og analyseres mot et bredt spektrum av krefttyper. Denne rapporten foreslår utvikling og bruk av
32P-merkede peptider som potensielle individualiserte peptid-binding terapi for behandling av kolon adenokarsinom pasienter
Citation. Abraham JM, Cheng Y, Hamilton JP, Paun B, Jin Z, R Agarwal et al. (2008) Generation of Small
32P-merkede peptider som en potensiell tilnærming til tykktarmskreft Therapy. PLoS ONE 3 (6): e2508. doi: 10,1371 /journal.pone.0002508
Redaktør: Edathara Abraham, University of Arkansas, USA
mottatt: 24 april 2008; Godkjent: 06.05.2008; Publisert: 25 juni 2008
Copyright: © 2008 Abraham et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd 2RO1CA095323-14, 2RO1CA077057-09, 1R01CA001808-05 og 7R21 /R33CA106763 fra National Cancer Institute
konkurrerende interesser:.. forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
introduksjon til
Nye landemerke funn overbevisende dokumentert omfattende genetisk heterogenitet blant kreft hos mennesker, særlig kolorektal tumorer, ved å etablere eksistensen av et lite antall ofte muterte genet «fjell» og et mye høyere antall genet «åsene» mutert ved langt lavere frekvenser [1], [2]. Denne høy grad av mangfold blant menneskelige kolorektal kreft tyder på at individualiserte behandlingsstrategier holde store løftet i vellykket klinisk intervensjon. Flere kreftimmunterapi er i bruk, inkludert Herceptin, Rituxin, og Avastin, et monoklonalt antistoff rettet mot VEGF (vaskulær endotelial vekstfaktor) som er godkjent for kolorektal kreft behandling [3] -. [9]
radioimmunterapi (RIT) er en ny teknologi med hittil bare to FDA-godkjente protokoller, både rettet mot non-Hodgkins lymfom (NHL). Hver protokoll benytter et monoklonalt antistoff rettet mot CD20 B-cellemarkør og kan gi
90Y (Zevalin) eller
131I (Bexxar), som hver genererer elektroner (beta-partikler) som skader DNA, som resulterer i celledød [10], [11]. For tiden er det ikke RIT ennå ikke blitt godkjent for behandling av kolorektal cancer [12].
Vi har nylig rapportert et sett av ni forskjellige dekapeptider, som hver varierer fra de andre ved kun én til tre aminosyrer, som når de er merket med beta-emitter
32P, bundet til og permanent levert, i varierende grad, denne radioisotopen til cellelinjer avledet fra et panel av forskjellige kolorektale adenocarcinomer [13]. Den mest effektive
32P-merket dekapeptidet resulterte i permanent inkorporering av radioisotoper i tykktarm adenokarsinomceller cellulære proteiner med en hastighet over 100 ganger større enn i cellelinjer avledet fra en rekke andre krefttyper eller fra normal tykktarm, nyre eller spiserøret.
Heri rapporterer vi en klasse av litt større peptider (opp til 34 aminosyrer lange) som inneholder vidt ulike peptidsekvenser, noe som resulterer i et bredt område av cellulære bindings og radio-isotopopptak egenskaper. Hver 34 aminosyre peptid inneholder en ni aminosyre- kjerne ved dens amino-ende for å muliggjøre
32P merking av proteinkinase A, en åtte aminosyre kjerne ved sin karboksy-ende, og opp til 17 flere aminosyrer som dramatisk endre både dens bindings til celler og dets permanente inkorporering av radioisotoper i tykktarmskreft cellulære proteiner. Disse resultatene støtter videre utforskning av denne strategien for å utvikle potensielle nye individualiserte terapeutiske regimer mot tykktarmskreft.
Resultater
Produksjon av
32P-merkede peptider og binding til tykktarm adenokarcinomceller
Tidligere rapporterte vi oppdagelsen av ni forskjellige
32P-merket dekapeptider, hver varierende fra hverandre ved hjelp av kun én til tre aminosyrer, som oppviste vidt ulike evner til å binde seg til og overføring av radioisotoper permanent til proteiner i cellelinjer etablert fra et panel av kolon adenokarsinomer. Den mest effektive av disse
32P-merkede dekapeptider permanent levert radioisotop til tykktarmskreftceller mer enn 100 ganger mer effektivt enn i cellelinjer avledet fra andre kreftformer eller de normale vev som ble testet. Heri, rapporterer vi produksjon og identifikasjon av en ny serie av peptider, opp til 34 aminosyrer i lengde, som har aminosyresekvenser dramatisk endre deres evne til å binde til og permanent lette
32P-inkorporering i celler. Figur 1 er en skjematisk fremstilling av eksperimentell design som illustrerer kloning av et DNA-fragment inneholdende 17 tilfeldig genererte kodoner inn i BamHI-restriksjonsenzymsete av pGEX-2TK. Etter bakteriell transformasjon, ble individuelle kloner utvalgt og ekspandert for å frembringe et variert sett av
32P-merkede peptider. Hvis ingen stopp-kodoner var tilstede i den tilfeldige DNA-sekvensen, og deretter en 34-rest peptid ble generert, flankert ved dens amino-ende av den 9-resters protein kinase A merking motiv og ved sin karboksy-terminus av et 8-resters sekvens. Som forventet i flere kloner, ble et stoppkodon er satt inn, noe som resulterer i trunkerte peptider; Men alle disse avkortede peptidene inneholdt proteinkinase A substrat del. Disse forskjellige peptider ble inkubert med flere forskjellige cellelinjer i to timer, adherente celler ble vasket tre ganger, og radioaktiviteten som forble bundet til celler, ble analysert enten umiddelbart, eller etter inkubering over natten i komplett medium.
Et PCR-produkt innehold 17 tilfeldige kodoner ble innført i BamHI-setet av pGEX-2TK produsere forskjellige glutation-S-transferase fusjonsproteiner som ble bundet til glutation-sefarose, og merket med
32P ved hjelp av protein-kinase A. Etter vasking og trombin fordøyelse, den merkede peptidene ble inkubert med flere forskjellige cellelinjer og analysert.
Figur 2 viser den dramatiske variasjonen i nivået av faste
32P inkorporering i kolon adenocarcinom linje Caco2 etter vasking og natten over inkubering medium. Vi har tidligere vist at celler med hell binding dekapeptider etter to timers inkubering sluppet opp til 88% av opprinnelig bundet
32P inn i mediet etter inkubering over natten, men fremdeles være permanent innlemmet høye nivåer av radioisotopen i sine proteiner. Nitten ulike peptider i figur 2 er utpekt MA (Modified Adjuvant) 10 gjennom 28. Elleve av disse 19 inneholde fullstendige 17-rester innsatser, med MA18 permanent overføre
32P til Caco2 celler over 37 ganger mer effektivt enn MA26. Den mest effektive faste radioaktiv isotop-inkorporering i Caco2-celler skjedde etter inkubasjon med MA27, som inneholder bare en tilfeldig innsatt aminosyre oppstrøms for et stoppkodon. Peptider MA16 og MA17 ble kodet for av det opprinnelige rekombinante ekspresjonsvektor, som fører til lave nivåer av radioaktiv isotop inkorporering.
Ulike
32P-merkede peptider ble inkubert i to timer med 10.000 Caco2-celler, ble vasket tre ganger, og inkubert i komplett medium i 24 timer. Mengden av
32P radioisotopen som forble permanent inkorporert i cellulære proteiner er vist som en prosentandel av opptak av mengden av peptidet tilsatt til hver cellekultur vel (gjennomsnittlig pluss ett standardavvik). Antallet aminosyrer som er tilstede i hver pakning er vist og varierte fra 0 til 17 aminosyrer. Aminosyresekvensen av hver innsats er vist nedenfor det nivå på
32P inkorporering tilskrives hver pakning.
Visualisering av
32P inkorporering av gelen autoradiografi
Fire peptider viser gjennomsnittlig nivå av radioisotop innlemmelse ble valgt for videre studier; triplikat-brønnanalyser av disse peptidene er vist i figur 3. Peptide MA11 største innskuddet inneholdt tre rester oppstrøms av et stoppkodon, noe som resulterer i et peptid bare 12 aminosyrer i lengde. Til tross for sin relativt korte lengden, dette avkortede peptid overført
32P til Caco2 cellene 215 ganger mer effektivt enn til livmorhals svulst avledet cellelinje HeLa på to timer. Etter vasking og inkubering over natten i medium, radioaktivitet tilbakeholdt av Caco2-celler var mer enn 150 ganger større enn det som holdes tilbake av HeLa-celler. Som vist i figur 3, mest
32P bundet til Caco2-celler var til stede i en lav-molekylvekt (LMW) komponent (
fet pil
) ved 2 timer, men ved 24 timer meste av denne radioaktivitet hadde blitt innlemmet i flere forskjellige cellulære proteiner.
Fire av MA (modifisert Adjuvant)
32P-peptider er vist i figur 2 ble inkubert med triplikatbrønner for Caco2 eller HeLa-celler i to timer. Etter vasking ble 100 pl gel lastebuffer tilsatt, og innholdet ble kjørt på SDS-polyakrylamidgeler (betegnet som «2 timers»). Identiske brønner var fullstendig medium tilsatt umiddelbart etter vasketrinnet, og ble inkubert i ytterligere 24 timer, og brønn innholdet ble deretter kjørt på geler (betegnet som «24 timer»). Filmen ble utviklet etter en eksponering over natten som viser den tilsynelatende permanent inkorporering av
32P til cellulære proteiner ved 24 timer (merket med * i MA11 panel). Peptide MA11 bundet til 215 ganger mer kraftig til Caco2-celler enn til HeLa-celler på to timer, og 150 ganger mer ivrig etter 24 timer. Peptide MA20 bundet godt til både Caco2 og HeLa-celler i to timer, men bare Caco2 celler syntes å ha cellemaskineriet for å innlemme
32P i cellulære proteiner. Den tynne Pilen viser posisjonen til
32P-merket peptid, mens den uthevede pilen viser posisjonen til en forholdsvis lav molekylvekt som er merket mellomprodukt som ikke ble sett i HeLa-celler.
Lignende resultater ble observert for peptider MA15 og MA22, som begge inneholdt 17-rester innsatser for en total lengde på 34 aminosyrer, og som begge inkorporeres 23 ganger mer
32P inn i Caco2-celler enn i HeLa-celler etter inkubering over natten (figur 3). Igjen, både MA15 og MA22 viste et intenst radioaktiv LMW bånd (
fet pil
) ved 2 timer som var nesten helt forsvunnet etter 24 timer, med inkorporering av den gjenværende
32P til cellulære proteiner. Opprinnelig antok vi at dette LMW bandet sett på 2 timer (
fet pil
) representert intakt grense
32P-merket peptid. Men de 34 aminosyre peptider MA15 og MA22 identifisert disse intakte 34-aa peptid forløpere til forskjell fra den intense mindre MW bånd (
fet piler
). Dermed har vi konkludert med at mindre bandet var en raskt behandlet liten mellom molekyl, som redusert kraftig de sikrer 24 timer i løpet der
32P ble innlemmet i cellulære proteiner.
Peptide MA20 inneholdt også en 17-rester innlegget. Dette peptid var spesielt bemerkelsesverdig, fordi det var den eneste testet som var i stand til å binde til en cellelinje som ikke er avledet fra tykktarm adenokarsinomer og forsynt nøkkel bevis som tyder på en mulig celle behandlingen mekanisme. Som vist i figur 3, MA20 bundet ved høye nivåer til både Caco2 og til HeLa-cellene ved to timer. Men LMV band (
fet pil
) sett med de tre andre peptider i Figur 3 var bare synlig med Caco2 celler, men ikke med HeLa-celler. Etter vask og overnatting inkubasjon Caco2 celler syntes å ha behandlet den LMW mellom band (
fet pil
) i cellulære proteiner, mens HeLa-celler tilsynelatende manglet evnen til å fullføre dette neste trinn (
dvs.
, ingen radioaktive cellulære proteiner ved disse mWs ble visualisert, og alt HeLa bundet radioaktivitet ble fortsatt ved den samme molekylvekt som den opprinnelig ble bundet
32P-merket peptid (
tynn pil
)). De to bånd (
tynne piler
, første kjørefelt av MA20 og MA22 geler) var et resultat av inkubering av
32P-merket peptid i medium inneholdende serum i to timer ved 37 ° C, og viste tydelig delvis proteolyse av peptidet i denne perioden.
Bare tykktarm adenokarcinomceller prosessere bundet radioaktivitet i cellulære proteiner
Figur 4 viser resultatene av incubating peptider MA11, MA20 og MA22 med syv forskjellige carcinoma cellelinjer på 2 timer og etter inkubasjon over natten. Peptider MA11 og MA22 utstilt sterk binding og overføring av
32P bare til de tre kolon adenokarsinom linjer (Caco2, HCT116 og HCT15) og ikke til livmorhals (HeLa), fibrosarkom (1080), bukspyttkjertelen eller lunge adenokarcinomceller. MA20, i motsetning, er bundet kraftig til alle de syv cellelinjer, men dens radioaktivitet ble behandlet i den LMW båndet (
fet pil
) og senere til cellulære proteiner bare ved de tre kolonadenokarsinom linjer (Caco2, HCT116 og HCT15). HCT116-celler konsekvent bundet, så vel som behandles i større-MW bånd, radioaktivitet fra alle tre
32P-merkede peptider (MA11, MA20 og MA22) ved en mye lavere hastighet enn Caco2 og HCT15 celler, men innlemmelse i HCT116 celle proteinene var slutt synlig på lengre eksponeringer (data ikke vist).
32P-merkede peptider MA11, MA20 og MA22 ble inkubert med sju ulike cellelinjer som beskrevet i Figur 3. MA11 og MA22 bundet til og hadde
32P radioisotopen permanent innlemmet ved de tre tykktarm adenokarsinomceller avledede cellelinjer. MA20 i betydelig grad er bundet til alle de syv cellelinjer, blant annet en avledet fra en pankreatisk adenokarsinom og en avledet fra en lunge adenokarsinom, men hadde betydelige nivåer av
32P permanent inkorporert i cellulære proteiner bare ved de tre kolon adenokarsinomer.
tynn pil
viser posisjonen til
32P-merket peptid, mens den
pilen fet
indikerer posisjonen til en forholdsvis lav molekylvekt som er merket mellomprodukt som bare ble sett i colon adenokarsinom celler.
ikke-fosforylert peptid konkurrerer med
32P-merket peptid for binding til Caco2 celler
12-aa peptid MA11 ble kjemisk syntetisert, merket med
32P, og anvendt i en konkurrerende bindingsanalyse med Caco2-celler mot varierende mengder av kald, ikke-fosforylert MA11 peptid. Figur 5 illustrerer at fosforyleringen av dette peptid ikke var nødvendig for å kunne konkurrere for binding til Caco2-celler, og at økende mengder kaldt konkurrent hurtig hemmet mengden av
32P-merket peptid som er bundet til cellene.
i hver brønn inneholder Caco2 celler ble tilsatt 0,005 mikrogram
32P-merket MA11 peptid og indikerte mengde kald, ikke-fosforylert MA11. Etter en times inkubasjon ble adherente celler vasket og de bundne radioaktive tellinger bestemmes.
diskusjon
nitten forskjellige små peptider opp til 34 aminosyrer i lengde er rekombinant fremstilt, hvert inneholder et innstikk opptil 17 rester lang, noe som kan merkes på et konservert ni aminosyre underlaget med
32P og protein kinase A. Disse
32P-merket peptider binde med unike slektskap til cellelinjer etablert fra ulike kolon adenokarsinomer og permanent overføre radioisotop til cellulære proteiner etter to timers inkubering. De mest effektivt bindende peptid resulterer i permanent opptak av
32P etter kolon kreftcellene mer enn 150 ganger høyere enn fra cellelinjer avledet fra andre kreftformer eller normale vev. I tillegg er en
32P-merket peptid bundet til alle cellelinjene som ble testet, men
32P ble behandlet og permanent innlemmet bare av cellelinjer avledet fra tykktarm adenokarsinomer, noe som tyder på at bare denne typen kreft celle besitter maskiner som er nødvendig for denne behandlingstrinn. Nitten forskjellige peptider er vist i figur 2, ble valgt ut fra en innledende screening panel som inneholder bare 25 peptider. Denne overraskende høy hastighet for å oppnå vellykkede peptider øker sannsynligheten for at denne strategien for individualisert behandling utviklingen vil være gjennomførbart. Til slutt, en konkurrerende bindingsanalyse ved bruk av kald og
32P-merket syntetisk peptid MA11 demonstrert at ikke-fosforylerte peptid konkurrerer meget effektivt for binding til Caco2-celler.
De fleste for tiden godkjent cancerimmunterapeutiske regimer bruke et antistoff rettet mot en kjent celledelt molekyl, og kan også bli koblet til en tumor-ablating middel, slik som en radioisotop eller et toksin [14] – [18]. Bare to radioimmunotherapeutic (RIT) behandlinger er for tiden FDA-godkjent; begge er rettet mot non-Hodgkins lymfom utnytte
131I (Bexxar) eller
90Y (Zevalin) via celle-drapet aktivitet slippes ut elektroner.
32P radioisotopen er en ren beta-emitter, og som vist i tabell 1, har den mange egenskaper som sammenligner gunstig til
131I og
90Y, i tillegg til å være lett tilgjengelig og relativt billig. En fordel med å bruke betapartikler for å drepe tumorceller, er at deres vei rekkevidde på opp til 5 mm resulterer i et stort antall celler bli gjennomtrengt av hver enkelt elektron, som fører til en kumulativ «bystander effekt» på grunn av kryssild fra nabo merkede celler.
Et meget aktivt område av biomedisinsk forskning fokuserer på kobling av radioisotop til peptider, så vel som dens anvendelse i diagnostiske og terapeutiske anvendelser [19] – [22]. Vår foreslåtte anvendelse av
32P-merket små peptider i peptid-binding terapi foreslår en rekke fordeler fremfor tradisjonelle RIT basert på monoklonale antistoffer. For eksempel er mindre terapeutiske molekyler forventes å gi bedre tumor gjennomtrengning, og den gjennomsnittlige lille peptidet molekylvekt på mindre enn 4000 Da er mindre enn 3% av størrelsen av et antistoffmolekyl [23]. Radioaktive halogener som
131I kan behandles og løslatt tidlig av celler, mens
32P levert av disse små peptider er permanent innlemmet i kreftcelleproteiner [24]. Et lite peptid er mindre tilbøyelige til å fremkalle den type verts anti-protein respons som kan utvikles ved bruk av mye større antistoffene, og fraværet av en Fc-fragment immunoglobulin bør resultere i mindre ikke-spesifikk binding av leveren. Den radioisotop
32P har en lang historie med klinisk bruk dateres til tidlig på 1930-tallet, mens i dag er det fortsatt brukes til å behandle polycytemi og essensiell trombocytemi [25]. Det er et klart behov for utvikling av effektive nye behandlinger for tykktarmskreft [26]. Vårt arbeid antyder at et ekstremt stort bibliotek av forskjellige små peptider, hver med unike bindings og
32P overførings evner, kan lett fremstilles enten kjemisk eller biologisk, og dermed øke muligheten for å utvikle individuelle behandlingsregimer for forskjellige pasienter. Kreft har vist seg å være en svært heterogen sykdom, og dermed utvikling av disse unike peptid-bindings terapier kan i stor grad lette individuell pasientbehandlinger.
Materialer og metoder
Produksjon av rekombinant
32P -merkede peptider
Som beskrevet i figur 1, PCR-genererte produkter som består av 17 tilfeldige kodoner flankert av BamHI-setene ble klonet inn i BamHI-setet av pGEX-2TK (GE Healthcare). Etter transformasjon inn i DH5a bakterier, ble isolerte kloner dyrket over natten i LB-amp buljong, fortynnet 1/10 i samme, dyrket i to timer, IPTG tilsatt til 1 mM, og dyrket ved 37 ° C i fem timer. Ti ml av kulturen ble sentrifugert og resuspendert i 1 ml av 1 x TBS inneholdende 100 ug /ml lysozym. Etter to fryse-tine-sykluser, ble lysatet sentrifugert og blandet med 100 ul Sepharose-Glutation i en time, vasket tre ganger med 1 x TBS, og de bundne rekombinante fusjonsproteiner som er merket ved hjelp av
32P-γ-ATP og proteinkinase A i henhold til produsentens instruksjoner (Sigma, St. Louis, MO). Pelleten ble vasket tre ganger med 1 x PBS og den merkede peptidet ble spaltet og sluppet ut i supernatanten ved hjelp av trombin (GE Healthcare). For hver rekombinant peptid fremstilt og analysert, ble DNA-sekvensen til innskuddet i ekspresjonsplasmidet bestemmes.
-analyse av bindingen av
32P-merkede peptider til cellelinjer
Cellelinjer ble dyrket i komplett medium inneholdende 10% varme-inaktivert føtalt bovint serum. I hver brønn av en 96-brønners plate, ble 10.000 celler fra forskjellige cellelinjer dyrket over natten. Ti pl av
32P-merket peptid i 1 x PBS og 90 pl komplett medium ble tilsatt til hver brønn og inkubert ved 37 ° C i to timer. Peptid-mediet ble fjernet og en pl tilsatt til 100 ul gel lastebuffer for scintillasjonstelling for sonden kvantifisering eller kjørt på en 10% -20% polyakrylamid-SDS-gel (Biorad). De adherente celler ble en kort stund og forsiktig vasket med fullstendig medium tre ganger, og noen brønner ble analysert umiddelbart etter tilsetning av 100 ul gel lastebuffer til hver brønn og kjørt på en gel eller tellet i en scintillasjonsteller. Andre identisk behandlede brønner hadde 200 pl komplett medium tilsatt og inkubert ved 37 ° C i ytterligere 24 timer. Mediet ble fjernet, og 100 ul gel lastebuffer tilsatt, og prøvene kjørt på en gel eller tellet som beskrevet ovenfor.
Fremstilling av syntetisk
32P-merket peptid
12 aminosyre peptid MA11 ble kjemisk syntetisert og 0,2 ug ble merket som beskrevet ovenfor, ved bruk av 300 uCi
32P-γ-ATP og 30 enheter proteinkinase A. Etter en fem timers merkingsreaksjonen, ble blandingen microfuged skjønt en Microcon-10 enheten for å fjerne enzym fra følgende bindings-forsøk. For konkurrerende bindingsanalyse, 0.005 ug
32P-merket peptid MA11 ble tilsatt til en brønn inneholdende 10.000 Caco2-celler og en bestemt mengde kald, ikke-fosforylert MA11. Etter inkubasjon i en time, ble de adherente celler forsiktig vasket og brønninnholdet telles.
