Abstract
Denne studien gir en unik tilnærming for å aktivere bur små interfererende RNA (siRNAs) ved hjelp av indirekte UV lys slippes ut ved nær-infrarødt (NIR) -to-UV oppkonverterende prosess for å oppnå høye romlige og tidsmessige genet interferensmønstre. siRNA-molekyler mot anti-apoptotiske genet
survivin
ble bur av lyssensitive molekyler (4,5-dimetoksy-2-nitroacetophenone, DMNPE), som utførte dem midlertidig ikke-fungerende. NIR-til-UV NaYF
4: Yb, Tm oppskalering nanopartikler (UCPs) fungerte som levering kjøretøy og aktivatorer av bur siRNA-molekyler i murine blære kreftceller (MB49 cellelinje). Upconverted UV-lys ved 355 nm ble sluppet ut fra NIR-bestrålt UCPs, som godt sammenfalt med bølgelengde som trengs for å uncage DMNPE. Følgelig, UV-lys fungerte som en bryter for å uncage den leverte siRNA-molekyl, og derved gjøre fullt ut funksjonell til å utøve sin terapeutiske effekt i blærekreftceller. For å oppnå den høyeste effektivitet RNA-interferens, ble tilstander slik som tid etter cellulært opptak, eksitasjon tid, UCPs konsentrasjon og lasereffekt optimaliseres. Resultatene viste at 200 mikrogram /ml nanopartikkelkonsentrasjonen i kombinasjon med 12 timers inkubering med MB49 celler og eksitasjon med NIR-laser på 100 mW i 15 minutter følger den ideelle interferens effektivitet og sterkeste induksjon av MB49 celledød. Våre funn viser potensialet biologisk anvendelse av UCPs i behandling av blærekreft ved en roman terapeutisk tilnærming
Citation. Guo H, Yan D, Wei Y, Han S, Qian H, Yang Y, et al. (2014) Hemming av Murine blærekreft cellevekst
In Vitro
av Photocontrollable siRNA Basert på Upconversion Fluorescent Nanopartikler. PLoS ONE 9 (11): e112713. doi: 10,1371 /journal.pone.0112713
Redaktør: Yuan-Soon Ho, Taipei Medical University, Taiwan
mottatt: 08.08.2014; Godkjent: 14 oktober 2014; Publisert: 25.11.2014
Copyright: © 2014 Guo et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. Den forfatterne bekrefter at alle data som underbygger funnene er fullt tilgjengelig uten restriksjoner. Alle relevante data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Denne forskningen ble støttet delvis med tilskudd fra Natural Science Foundation National of China (No. 31100688, nr 21471043), International Science Technology Cooperation Program of China (No. 2014DFA31890), den Scientific Research Foundation for den returnerte Overseas Chinese Scholars, State Education departementet, og staten Key Laboratory of Veterinary etiologiske biologi, Lanzhou Veterinær Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences (SKLVEB2013KFKT010). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Blærekreft er den vanligste kreftformen av urogenitalsystem over hele verden. Betydelig forskningsinnsats har vært viet til å utvikle nye og effektive behandlingsformer for blærekreft. I tillegg til konvensjonelle behandlingsmetoder slik som kirurgi, kjemoterapi og radioterapi, genterapi er ansett som et effektivt alternativ for behandling av tumors.Hence, RNA interferens (RNAi), en naturlig forekommende mekanisme i celler for genet Slå, viser sterkt potensiale for behandling av blærekreft [1], [2], [3]. RNAi involverer binding av små interfererende RNA (siRNA) til den RNA-indusert stanse kompleks (RISC), som så dirigerer ødeleggelsen av budbringer RNA (mRNA) som er komplementære til antisens tråd av siRNA. Target-spesifikke RNAi kan slå ned et gen med høy spesifisitet og selektivitet, og gir dermed et viktig verktøy for personlig kreftbehandling.
RNAi maskiner er vanligvis startes så snart som siRNA kommer inn i cellen, og effektene på genet lyddemping kan observeres like etterpå. Imidlertid hurtig og ukontrollert RNAi begrenser anvendeligheten av genterapi. Derfor innsats har blitt gjort for å utvikle spatiotemporally induserbar RNAi. En lovende tilnærming er «bur» RNAi, som utnytter siRNA modifisert med en fotolabile beskyttelse gruppe som blokkerer aktiviteten. Siden aktiviteten i «bur» siRNA er avhengig av en lys-baserte trigger (for eksempel UV-lys), tillater denne tilnærmingen avstand, timing, og kontroll over graden av genuttrykk, først beskrevet av Kaplan i 1978, har blitt brukt denne metoden i en rekke applikasjoner [4]. I denne studien, valgte vi 4,5-dimetoksy-2-nitroacetofenon (DMNPE), en 2-NB (2-nitrobenzyl) klasse av fotolabile beskyttelsesgruppe, til buret sirnas for minimal og maksimal leakiness uncaging effektivitet.
i de senere år oppkonverterende fluorescerende nanopartikler (UCPs) har blitt stadig mer brukt som fluorescerende markører og for genavlevering. UCPs viser god biokompatibilitet og ingen immunogenisitet som et gen leveringssystem, og kan trygt skilles ut uten å etterlate rester i kroppen. UCPs effektivt kan levere siRNA eller DNA til å målrette celler eller vev mens beskytte dem fra degradering av nukleaser i blodet serum. I tillegg, sammenlignet med tradisjonelle fluorescerende markører, så som organiske fargestoffer og kvanteprikker, UCPs utviser lav toksisitet, god kjemisk stabilitet, høy fluorescens-intensitet, høy stabilitet, og stor Stokes skift når det brukes som fluorescerende markører. UCPs er begeistret av nær-infrarødt (NIR) lys, som påvirkes minimalt av forstyrrelser og scatter av auto-fluorescens fra vev og celler, og dermed tilby lav bakgrunn og høy signal-til-støy-forhold [5].
NIR-lys kan trenge gjennom vev dypere enn synlig lys, og som sådan kan UCPs brukes som fluorescerende markører eller i optisk behandling av dype vev. Derfor UCPs oppviser god prospekt som fluorescerende markører og genavleveringspartikler vektorer i klinisk diagnostisering, behandling og analyse av biologiske molekyler [6], [7], [8], [9]. NaYF4: Yb, Er /Tm viser den høyeste effektivitet fra NIR til synlig /oppskalering fluorescens og kan gi bølgelengder fra ultrafiolett lys for infrarødt lys. Derfor NaYF4: Yb, Tm ble anvendt som en photocaged siRNA bærer i denne studien
Survivin
er en av de sterkeste inhibitorer for proteiner som er involvert i apoptose.. Gitt den store forskjell i sitt uttrykk mellom normale og maligne vev og dets kausal rolle i progresjon av kreft, har Survivin blitt studert som et mål for anticancerterapi, og som en svulst markør [10], [11], [12], [ ,,,0],1. 3]. Her Survivin ble valgt som målgenet for å undersøke effektiviteten av RNAi-basert genterapi for behandling av blærekreft. Nærmere bestemt, Survivin siRNA bur med DMNPE ble kombinert med UCPs som transportør. Aktivering av siRNA ble oppnådd ved bestråling med 980 nm NIR laser og hemming av blærekreft cellevekst, ble målt. Våre resultater gir ny innsikt i bruk av UCPs i genterapi.
Materialer og metoder
1. Cell
MB49-PSA-celler som ble gitt av Dr. Ratha Mahendran fra Det medisinske fakultet (NUS, Singapore) [7], [9], ble dyrket ved 37 ° C under 5% CO
2 atmosfære i modifisert Eagles medium (MEM, Gibco) supplert med 10% føtalt bovint serum (Gibco) inneholdende 100 enheter /ml penicillin G-natrium (BBI) og 100 ug /ml streptomycin-sulfat (BBI).
to . Amino-modifiserte UCPs og UCPs /siRNA-DMNPE kompleks formasjon
NaYF
4: Yb, Tm nanokrystaller og monodisperse silika-belagt NaYF
4: Yb, Tm (NaYF4: Yb, Tm @ silika, UCPs) ble syntetisert og karakterisert ved å følge metoden beskrevet av Guo et al. (2010) [7] og Qian et al. (2009) [9]. Den UCPs ble modifisert ved hjelp av en aminogruppe ved å følge metoden beskrevet av Guo et al. (2011). DMNPE (Invitrogen) ble brukt til buret sirnas følge produsentens protokoll, og UCPs /siRNA-DMNPE komplekser ble gjort som tidligere beskrevet av Guo et al. (2011) [14]. Forholdet mellom UCPs til siRNA ble bestemt ved måling av zeta-potensialet ved hjelp av Nano-ZS Zen 3600 (Malvern Instruments Ltd., UK) ved 25 ° C. UV absorpsjon spekteret ble samlet inn ved hjelp av BioMate 3S UV-synlig spektrofotometer (Thermo Scientific) ved 25 ° C.
3. Cellulært opptak av UCPs ved forskjellige tidspunkter
MB49-celler ble sådd ut på 6-brønners plater og dyrket i 24 timer. Cellene ble straks behandlet med nanopartikler ved 100 ug /ml, og oppsamlet ved forskjellige tidspunkter (15 min, 1 h, 6 H, og 24 h). -Celler lastet med nanopartikler ble fiksert i 4% paraformaldehyd i 10 minutter ved romtemperatur (RT) og ble deretter vasket to ganger med 1 x PBS i 5 min. Kjernene ble kontra med 0,1 ug /mL DAPI (Sigma) i 5 minutter ved romtemperatur etterfulgt av to vaskinger med 1 x PBS i 5 min hver. Nanopartikler lastet på de faste cellene ble deretter visualisert under en konfokal laser scanning mikroskop (Nikon C1 Confocal) utstyrt med en kontinuerlig bølge 980 nm laser eksitasjon kilde.
4. Kvantifisering av UCPs opptak
Cellene ble sådd på 75 cm
2 kolber på 1 x 10
6 /mL Etter dyrking i 24 timer. Cellene ble straks behandlet med nanopartikler ved 100 ug /ml, og oppsamlet ved forskjellige tidspunkter punkt ved 0 ° C, 15 minutter, 1 time, 3 timer, 6 timer, 24 timer, 48 timer og 72 timer. Intracellulære opptaket av nanopartikler ble vurdert ved å måle den totale mengden av nanopartikler i celler ved hjelp av induktivt koblet plasma optisk Emission Spectrometer (ICP-AES).
5. Transfeksjon av dyrkede celler
MB49-PSA-celler ble transfektert med den UCPs /siRNA-DMNPE kompleks ved å følge metoden beskrevet av Guo et al. (2011) [14]. I korte trekk ble UCPs /siRNA-DMNPE komplekset inkubert med celler for ulike tidspunkt som angitt. ved 37 ° C under 5% CO
2 atmosfære. Ved slutten av inkubasjonsperioden ble cellene spent med eller uten 980 nm laser ved anvendelse av en 980 nm VA-II diode pumpet fast tilstand (DPSS) laserkilde.
6.
In vitro
levedyktighet /cytotoksisitetstester
Celleviabilitet ble vurdert ved hjelp Cell Titer 96 vandig en løsning analyse (Promega, Madison, WI). MB49-celler ble sådd ut på en 96-brønns plate ved en densitet på 5 x 10
3-celler per brønn. Etter en dag i kultur, ble UCPs /siRNA-DMNPE kompleks tilsatt til brønnene. Cellene ble inkubert i forskjellig tidspunkt, som angitt, og deretter eksitert ved hjelp av 980 nm laser eller ikke. Etter inkubering i ytterligere 24 timer ved 37 ° C, ble 20 pl av reagens tilsettes direkte til brønnene, og inkubert i ytterligere 24 timer. Mengde av formazanprodukt som dannes som indikert ved 490 nm absorbans er direkte proporsjonal med antallet levende celler i kultur. Hvert forsøk ble utført i tre eksemplarer. Cellenes levedyktighet (%) i forhold til kontrollbrønnene som inneholdt cellekulturmedium uten nanokrystaller ble beregnet som [
A
]
Expt /[
A
]
kontroll x 100%, hvor [
A
]
Expt er absorbansen til testprøven, og [i]
kontrollen er absorbansen til kontrollprøven.
7. Påvisning av Survivin ekspresjon ved immunoblotanalyse
MB49-celler ble sådd ut på en seks-brønns plate og dyrket til sammenløpet var 80% til 90% (som fant sted etter ca. 24 timer). På dette tidspunktet ble UCPs /siRNA-DMNPE kompleks tilsatt og cellene ble inkubert i forskjellig tidspunkt som angitt. Deretter ble cellene bestrålt med eller uten 980 nm laser og inkubert ved 37 ° C i ytterligere 24 timer. Cellene ble samlet inn ved hjelp kaldt cellelyse reagens (Pierce) i henhold til produsentens protokoll. Proteiner i cellelysater ble separert ved SDS-PAGE på 12% akrylamidgeler ved hjelp av et diskontinuerlig buffersystem. De ble deretter overført til en nitrocellulosemembran (Pierce) i overføringsbuffer (20 mM Tris-HCl, 190 mM glycin, 20% metanol, pH 8,3) ved anvendelse av en Mini Trans-blot-overføringssystem (Bio-Rad) ved 100 V i 1 h. Membranene ble blokkert med 5% ikke-fett tørrmelk i Tris-bufret saltvann inneholdende 0,05% Tween-20 (TBST) ved romtemperatur i 1 time og deretter inkubert med anti-Survivin antistoff (Santa Cruz, 1:200 fortynning) ved romtemperatur i 1 time. Etter tre vaskinger i TBST, ble membranene inkubert med peroksydase-konjugert anti-muse-sekundært antistoff (Sigma, 1:8000 fortynning) ved romtemperatur i ytterligere 1 time. Ytterligere tre vasker i TBST ble utført før NC membranen ble visualisert med ECL-løsning (Pierce).
8. Statistisk analyse
Filmene ble skannet som grå skala 8-bits bilder og tettheten av båndene ble bestemt av ImageJ SOFTWARE.THE data av relative mengden i western blot presenteres og den statistiske analysen av varians mellom gruppene var utføres av SPSS statistikk 19,0 programvare. Signifikant forskjell på alle statistiske tester ble satt til 0,05 (p 0,05)
Resultater
I denne studien NaYF
4. 25% Yb, 0,3% Tm NIR-til- UV UCPs ble anvendt som bærer av bur sirnas, som ble aktivert ved hjelp av NIR-til-UV upconverted lys (fig. 1). Som vist i figur 2B, de syntetiserte nanopartikler besatt en kjerne-skallstruktur sammensatt av et NaYF
4 nanokrystallaget kjerne og et silisiumdioksyd skall. For å feste bur sirnas ble UCPs modifisert med en aminogruppe som gjør overflaten er positiv ladning. De modifiserte nanopartikler som er vist i figur 2C er mer spredt enn de i figur 2B, noe som kan skyldes elektrostatisk frastøtning forårsaket av positive ladninger på nanopartikkeloverflaten. Totalt sett er nanopartikler ble funnet å være godt spredt i vann og danner en klar kolloidal løsning og stille sterke oppskalering fluorescens (figur 2A.)
Fluorescens spektra av umodifiserte nanopartikler (A).; Morfologien av umodifisert nanopartikler (B) og amino-funksjonaliserte nanopartikler (C) som observeres ved TEM.
Kompleksdannelse av amino-modifiserte UCPs med siRNA ble undersøkt ved å måle nanozeta potensial. UCPs og siRNA ble blandet i 1 time ved 4 ° C. De UCPs /siRNA-komplekser ble vasket flere ganger med PBS og deretter resuspendert i PBS-buffer. Måling av zeta-potensialet viste at den positive ladningen på UCPs ble gradvis nøytralisert ved den negative ladningen av siRNA med økning i nanopartikkel /siRNA-forhold (fig. 3A). Imidlertid er de overflater av cellene negativt ladet i nøytral tilstand (pH 7,0). Derfor, for å maksimalisere kapasiteten av UCPs for å levere så mye siRNA som mulig og for å oppnå optimal effektivitet cellulært opptak av UCPs /siRNA-komplekset, ble det benyttet en nanoparticle:siRNA forhold på 10:02 (mol:mol) i alt
in vitro
eksperimenter. For å vurdere effektiviteten av siRNA uncaging ved UCPs, ble deres absorbans målt. Som vist i figur 3B, DMNPE-bur siRNA viste et karakteristisk toppen ved 355 nm som DMNPE og som toppen ved 260 nm som siRNA, som viste feste av DMNPE grupper til de siRNA molekyler. For DMNPE-bur siRNA-molekyler, uten bestråling med en 980 nm NIR laser, viste en forvirret spektra. Det anslås at det er interferens mellom utslipp av UCPs og at DMNPE. Imidlertid ble UCPs /siRNA-DMNPE, en betydelig nedgang i den 355 nm topp observert ved bestråling med NIR light.Hence, er det troverdig at NIR-til-UV UCNs kan uncage siRNA-molekyler etter eksitasjon av NIR lys.
(A) Confocal avbildning av oppskalering fluorescensen avgitt av MB49-celler lastet med 100 ug /ml av nanopartiklene. Eksitasjon med 980 nm NIR laser slippes grønn og rød synlig fluorescens. Kjerner ble kontra med DAPI (blå fluorescens). Alle bilder ble oppnådd under de samme innstillinger, som tillot beregning av relativ fluorescensintensitet av forskjellig lastede celler. (B) Intracellulær opptak av nanopartikler i belastede celler ved ICP-AES for yttrium innhold.
For å bestemme nivået på cellulært opptak av UCPs, UCPs /siRNA eller UCPs ble passivt lastet inn MB49 celler ved å inkubere dem med 100 ug /ml nanopartikler for ulike varigheter. Som vist i figur 4A, ble to filtere brukes til å fange grønne og blå fluorescens-utslipp. Kjernene ble kontra med DAPI å vise at nesten alle cellene ble lastet. En progressiv økning ble observert i oppkonverterende fluorescensen avgitt av nanopartikkel-lastet celler med tiden. Men det fluorescerende intensitet av UCPs /siRNA-kompleks i MB49 celler som var sterkere enn den for UCPs alene etter 6 timers inkubering. Dette indikerte at MB49-celler hadde tatt opp UCPs /siRNA komplekser sterkere enn UCPs med tiden øker, noe som kan være på grunn av overflateladningen av nanopartiklene. Videre målte vi den intracellulære opptaket av nanopartikler i belastede celler ved ICP-AES for yttrium konsentrasjon og observert en lignende trend med økning i nanopartikkel-opptak i celler over tid (fig. 4B). Men mengden av UCPs i cellene nådde toppen, og deretter holdt balansen.
(A) Zeta potensialet UCPs /siRNA-DMNPE komplekse på mol /mol forhold på 10:01, 10:02, 10 :3, 10:04, og 10:05; (B) Absorbance spektrofotometri av siRNA, DMNPE-bur siRNA uten bestråling, og UCPs /siRNA-DMNPE aktiveres med eller uten NIR bestråling.
For å finne de optimale forhold for siRNA forstyrrelser etter NIR-laser eksitasjon , forsøk ble satt opp med forskjellige forhold av tidspunkter etter transfeksjon, eksitasjon ganger, konsentrasjon av komplekser, og laserkraft. Som vist i figur 5, øket interferens effektivitet med varigheten av inkubasjonen av nanopartikler med cellene. Cellen levedyktighet sunket betraktelig i UCPs /siRNA-DMNPE behandling etter eksitasjon med NIR ligh. Imidlertid var det nesten ingen endring i cellenes levedyktighet uten NIR eksitasjon (Fig. 5A) På samme måte vil, ved 12 timer etter behandling med eller uten NIR eksitasjon, ekspresjonsnivået av suvivin protein betydelig redusert og forble nesten på samme nivå ved 24 timer som antydet økning i interferens effektivitet (fig. 5B) .Dette kan skyldes økning i cellulært opptak av nanopartikler med tid, og er i samsvar med resultatene vist i figur 4. som vist i figur 6, interferensen effektivitet øker med tiden av eksitasjon. Spesielt redusert Survivin uttrykk betraktelig når cellene ble opphisset av NIR lys i mer enn 15 min. Figur 7 viser at inngrepet effektivitet øker med økning i konsentrasjon av nanopartikler, og dermed forstyrrelser effektiviteten økes også med mengden av siRNA mot Survivin. For å bestemme innvirkningen av lasereffekten på interferens effektivitet, ble cellene inkubert med UCPs eller UCPs /siRNA-DMNPE, som er forskjellig fra de som brukes i det foregående eksperiment. Som vist i figur 8, interferensen effektiviteten økes også med økningen i lasereffekt, særlig ved 500 mW. Men Survivin uttrykk også redusert i UCPs kontrollgruppe på 500 mW, noe som antydet at UCPs kan indusere celle skade når opphisset av NIR lys ved høy effekt. Derfor, på basis av de ovenstående resultater, de optimale betingelsene (12 timers inkubering, 15 min eksitasjon, 200 ug /ml nanopartikkelkonsentrasjon, og 100 mW lasereffekt) ble anvendt for å bekrefte den maksimale forstyrrelser effektivitet.
UCPs /siRNA-DMNPE ble tilsatt til MB49-celler ved UCPs konsentrasjon på 100 mikrogram /ml. Cellene ble eksitert ved hjelp av NIR-laserlys (100 mW) i 15 min ved forskjellige tidspunkter. Cellene ble samlet opp ved 24 timer etter lysbehandlingen. RNAi interferens effektivitet ble bestemt ved immunoblot (A) og MTT-analyse (B). Forsøket ble gjentatt tre ganger med lignende resultater, og resultatet av en representativt eksperiment er vist. Stjernene indikerer signifikante forskjeller mellom prøvene med annen behandling på samme tidspunkt. (* P 0,05, ** P 0,01).
UCPs /siRNA-DMNPE ble lagt inn i MB49 celler ved UCPs konsentrasjon på 100 mikrogram /ml. Cellene ble begeistret bruker NIR laserlys (100 mW) med ulike eksitasjon ganger. Cellene ble samlet opp ved 24 timer etter lysbehandlingen. RNAi effektivitet ble bestemt ved immunoblot (A) og MTT-analyse (B). Forsøket ble gjentatt tre ganger med lignende resultater, og resultatet av en representativt eksperiment er vist. Stjernene indikerer signifikante forskjeller mellom prøvene med liknende eksitasjon ganger (* P 0,05, ** P 0,01)
Forskjellige konsentrasjoner av UCPs /siRNA-DMNPE ble tilsatt til MB49-celler i 12 timer.. Cellene ble eksitert ved NIR laserlys (100 mw) i 15 min. Cellene ble samlet opp ved 24 timer etter lysbehandlingen. RNAi effektivitet ble bestemt ved immunoblot (A) og MTT-analyse (B). Forsøket ble gjentatt tre ganger med lignende resultater, og resultatet av en representativt eksperiment er vist. Stjernene indikerer signifikante forskjeller mellom prøver med lignende konsentrasjon (* P 0,05, ** P 0,01).
UCPs /siRNA-DMNPE ble tilsatt til MB49-celler ved UCPs konsentrasjon på 100 ug /mL . Cellene ble eksitert ved hjelp av NIR-laserlys med forskjellig kraft i 15 min. Cellene ble samlet opp ved 24 timer etter lysbehandlingen. RNAi effektivitet ble bestemt ved immunoblot (A) og MTT-analyse (B). Forsøket ble gjentatt tre ganger med lignende resultater, og resultatet av en representativt eksperiment er vist. Stjernene viser betydelige forskjeller mellom prøvene med lignende laser makt (* P 0,05, ** P 0,01).
For å bekrefte om alle forholdene er optimale, ble siRNA forstyrrelser eksperiment utført ved hjelp av UCPs og UCPs /siRNA-DMNPE kompleks. Som vist i figur 9, ble nesten ingen reduksjon i Survivin protein som finnes i blindprøven kontrollgruppen etter eksitasjon med eller uten NIR light.Howeve, forstyrrelser effektiviteten av UCPs /siRNA-DMNPE var høy etter eksitasjon med NIR-lys. I tillegg UCPs også påvirket ekspresjon av Survivin til en viss grad, noe som kan skyldes flere faktorer i forbindelse med lasere og nanopartikler.
UCPs /siRNA-DMNPE ble tilsatt til MB49-celler ved UCPs konsentrasjon på 100 ug /mL. Cellene ble spent ved hjelp av NIR-laserlys (100 mW) i 15 min ved 12 timer etter inkubering. Cellene ble samlet opp ved 24 timer etter lysbehandlingen. RNAi effektivitet ble bestemt ved immunoblot (A). Nivåer av Survivin protein i forhold til de av aktin med eller uten NIR-indusert magnetisering er vist. Forsøket ble gjentatt tre ganger med lignende resultater, og resultatet av en representativt eksperiment er vist. Stjernene viser betydelige forskjeller mellom de angitte prøvene (* P 0,05, ** P 0,01)
Diskusjoner
Gene regulering er viktig i levende systemer fordi genuttrykk nivåer spiller viktig. roller i genet funksjoner. Fremgangsmåter for kontroll av genekspresjon (opp- eller nedregulering) revolusjonert innen utviklingsbiologi og genterapi. Den siste utviklingen av photocontrollable genekspresjon har store løftet for økt spatiotemporal kontroll over modulering av genekspresjon. I denne teknikken, er transkripsjonsaktivatorer /plasmid for genekspresjon eller sirnas for RNAi bur med lyssensitive molekyler som gjør dem midlertidig ikke-fungerende. Denne prosess, kjent som photocaging, kan gjøres på en rekke måter, den mest vanlige av disse er modifiserende velger basepar eller kjemiske bindinger i molekylet bur. Ved bestråling med UV-lys, blir den modifikasjon ødelegges, og derved re-aktivering av nukleinsyrer til å gjenvinne sin funksjon [15], [16], [17]. På denne måte kan meget høy romlig og tidsmessig kontroll over genuttrykksmønster oppnås. Imidlertid har de fleste av de nåværende fotoaktive systemer er bare egnet for
in vitro
anvendelser på grunn av UV-lys, noe som er svært skadelig, er nødvendig for uncaging prosessen. UV-lys viser også dårlig vevspenetrasjon dybde, så det er uakseptabelt for
in vivo Hotell og klinisk bruk. I tillegg, selv om bruken av siRNA for RNAi viser et stort potensial for terapi, siRNA lett nedbrytes av RNase i blodserum, og er derfor uegnet for
in vivo
bruk. siRNA nukleotider er relativt små og korte, selv etter kjemisk modifisering for å forbedre siRNA stabilitet. Disse nukleotidene kan utskilles gjennom urinveiene etter absorpsjon i blodet. siRNA også behov for å overvinne endotelceller barrierer for å nå målet celler i ulike organismer. Derfor, utvikle et system for effektiv og sikker levering av siRNA til celler er meget viktig. Hittil har leveringssystemer for siRNA inkludert nonvirus- og virusbaserte leveringssystemer; Den tidligere inkluderer liposomer, nanopartikler, kationiske polymerer, miceller og andre systemer basert på disse skjemaene. Gitt at virusbaserte leveringssystemer utstillingen noen bivirkninger, inkludert potensiell immunogenisitet og tumorigenicity i genterapi, de er uegnet for siRNA levering. Derfor, i dag, nonvirus-baserte avleveringssystemer for siRNA blir undersøkt. I denne studien NaYF
4: 25% Yb, 0,3% Tm NIR-til-UV UCPs ble anvendt som bærere av bur siRNA. NIR-lys, som ble brukt til å eksitere UCPs, kan trenge inn i biologisk vev mer enn synlig eller ultrafiolett lys, for derved å muliggjøre bruk av UCPs som bærere i dype vev
fotolabile beskyttelsesgrupper kan deles inn i to typer:. I uspesifikke caging gruppe omfatter tilfeldig bur av siRNA fosfatryggraden [18], mens den andre gruppen omfatter spesifikk blokkering av 5′-fosfat av sirnas [19]. Den ikke-spesifikke grupper er mer stabile enn de spesifikke grupper. I tillegg er de ikke-spesifikke gruppene er enkle å syntetisere ved kjemiske eller biokjemiske metoder, for derved å redusere kostnadene ved å produsere bur siRNA. I denne studien ble siRNA bur hjelp DMNPE. DMNPE tilhører to-NB caging konsernet og dets derivater er de mest brukte og godt karakterisert caging molekyler [20]. NIR-til-UV-spektrum UCPs viser en emisjonstopp ved 350 nm, noe som stemmer godt med den bølgelengde som er nødvendig for å uncage DMNPE. I tillegg er NIR lys bare svakt absorberes av biologisk vev, noe som sikrer maksimal NIR lys absorbans av UCPs og øker følsomheten til metoden.
Hvis du vil kontrollere det optimale tidspunktet for NIR magnetisering i celler, cellulært opptak av UCPs ble oppdaget av fluorescerende mikroskopi og ICP-AES. Mengden av UCPs i cellene økes først med tiden men ble redusert etter 24 timer etter inokulering. Dette tyder på at den tidlige fasen av inkubasjon med UCPs er kritisk. Vurderer celle levedyktighet, valgte vi 12 timer etter inkubasjon av UCPs for NIR-indusert eksitasjon. Resultater av våre etterfølgende eksperimenter bekreftet at dette tidspunktet er ideelt for å oppnå høy RNA interferens. Selv om NIR lys er mindre cytotoksisk enn UV-lys, kan bruk av høy laser makt og lang eksitasjon tid indusere betydelig cytotoksisitet og lavere RNAi effektivitet. Derfor ble kun 15 min av eksitasjon tid brukt og laseren makt ble fastsatt til 100 mW. I tillegg, siden UCPs forårsake skader på celler ved høye konsentrasjoner, ble konsentrasjonen av UCPs satt til 200 ug /ml. Den høye RNAi effektivitet observert i studien validert egnetheten av disse parametrene for våre eksperimenter.
Konklusjoner
I konklusjonen, denne studien viser at NIR-til-UV UCPs kan tjene som levering av kjøretøy og aktivatorer av bur nukleinsyrer. Bestråling av UCPs i cellene ved upconverted UV-lys som sendes ut fra NIR førte til uncaging av de lastede molekyler, og dermed gjør dem fullt funksjonell i vertsceller. I tillegg til å utvise godt lys penetrasjon i vev for inngående fotoaktivering, NIR lys-indusert magnetisering nødvendig for NIR-til-UV oppskalering prosessen forårsaket minimal photodamage til biologiske prøver. Den iboende fluorescens egenskapene til disse nanopartikler aktivert utslipp som førte til utgivelsen av bur siRNA og tilrettelegging av genet forstyrrelser. Dermed kan UCPs gi en plattform for applikasjoner som involverer fjernstyring av RNAi og genterapi av kreft. Videre våre funn viser nytten av flerfarget oppskalering luminescens UCPs som en allsidig og kraftig verktøy for avanserte applikasjoner i bildebehandling, biodetection, og genterapi.
