Abstract
Genistein har vist seg å hemme kreft både in vitro og in vivo, ved å endre uttrykket av flere microRNAs (miRNAs ). I denne studien har vi fokusert på tumorsupressorproteinene mirnas regulert av genistein og undersøkt deres funksjon i prostatakreft (PCA) og målet veier. Ved hjelp av miRNA microarray analyse og real-time RT-PCR vi observert at Mir-574-3p var signifikant oppregulert i PCA celler behandlet med genistein i forhold til kjøretøykontroll. Uttrykket av MIR-574-3p var betydelig lavere i PCA cellelinjer og kliniske PCA vev sammenlignet med normale prostataceller (RWPE-1) og tilstøtende normalt vev. Lav uttrykk nivå av MIR-574-3p var korrelert med avansert tumor stadium og høyere Gleason score i PCA prøver. Re-uttrykk for MIR-574-3p i PCA celler betydelig hemmet celledeling, migrasjon og invasjon in vitro og in vivo. MIR-574-3p restaurering indusert apoptose gjennom å redusere BCL-xL og aktivere caspase-9 og caspase-3. Bruke GeneCodis programvare analyse, ble flere veier som berøres av MIR-574-3p identifisert, slik som «Pathways i kreft», «Jak-STAT signalveien «, og» Wnt signalveien». Luciferase reporter-analyser viste at MIR-574-3p direkte binder til 3′-UTR av flere målgener (så som Rac1, EGFR og EP300) som er komponenter av «Pathways i kreft». Kvantitativ real-time PCR og Western-analyse viste at mRNA og protein uttrykk nivåer av de tre målgener i PCA cellene var betydelig nedregulert med MIR-574-3p. Tap-av-funksjon studier viste at de tre målgener betydelig innvirkning celleproliferasjon, migrasjon og invasjon i PCA cellelinjer. Våre resultater viser at genistein opp-regulerer tumor suppressor MIR-574-3p uttrykk rettet mot flere cellesignalveier. Disse funnene øke forståelsen av hvordan genistein regulerer med miRNA ved PCA
Citation. Chiyomaru T, Yamamura S, Fukuhara S, Hidaka H, Majid S, Saini S, et al. (2013) Genistein Up-Regulerer Tumor lyddemper mikroRNA-574-3p i prostatakreft. PLoS ONE 8 (3): e58929. doi: 10,1371 /journal.pone.0058929
Redaktør: Burton B. Yang, University of Toronto, Canada
mottatt: 16 oktober 2012; Godkjent: 08.02.2013; Publisert: 12 mars 2013
Copyright: © 2013 Chiyomaru et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne forskningen ble støttet av Nasjonalt Senter for Forskningsressurser av National Institutes of Health gjennom Grant Numbers R01CA160079, R01CA138642, T32DK007790 og VA Merit anmeldelse og VA Program prosjektet. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser. Medforfatter Rajvir Dahiya er en PLoS ONE Editorial styremedlem. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
Den vanligste diagnosen type kreft blant menn i 2012 er prostatakreft (PCA) som ventes å stå for 29% (241 740) av alle nye krefttilfeller. PCa rangerer andre til lungekreft i kreftrelaterte dødsfall og forventes å utgjøre 9% (28 170) av alle mannlige kreftdødsfall i 2012 [1]. Metastatisk PCa er ikke kureres, og fortsetter å være den viktigste årsaken til kreft dødsfall [2]. Lindring kan oppnås ved hormon deprivasjonsterapi imidlertid etter en utmerket innledende reaksjon, i ca. 2 til 3 år de fleste av disse PCas vil tilbakefall til kastrering motstandsdyktig form av sykdommen [3] med døden vanligvis forekommer i løpet av flere år, [4]. Det er ingen vellykkede behandlinger for androgen-uavhengig PCa. En bedre forståelse av biologiske mekanismer for androgen-uavhengig PCa kan føre til nye måter å behandle svarer PCa mer vellykket.
Utvikling av kjemoterapeutika med lav pasienten toksisitet blir nå etterforsket av mange forskere. Mange av disse midler er avledet fra naturlige planteprodukter. Genistein er et phytoestrogenic isoflavonoid som har pleiotropiske biologiske effekter i en lang rekke av cancere uten noen synlig toksisitet overfor normale celler [5]. Genistein er en protein-tyrosin-kinase-inhibitor og påvirker celleproliferasjon, apoptose, tumor angiogenese, metastase og demper multimedikamentresistens som omfatter hovedkomponentene i signaltransduksjonsveiene [6], [7], [8].
microRNAs (mirnas ) er små ikke-kodende RNA (21-23 nukleotider) som i hovedsak binder ufullkomment til den 3 «ikke-translaterte region (UTR) av mål-mRNA og negativt regulerer genekspresjon post-transkripsjonelt ved translasjonell undertrykkelse og nedbrytning av mål-mRNA [9], [ ,,,0],10]. Siden identifisering av miRNAs i 1993 over 1500 mennesker mirnas har blitt registrert i miRBase database (https://microrna.sanger.ac.uk/). Bioinformatikk viser at mer enn 60% av proteinkodende gener kan bli målrettet av mirnas [11]. mirnas spiller en viktig rolle i mange biologiske prosesser, slik som utvikling, differensiering, proliferasjon, apoptose, angiogenese og metabolisme. I tillegg er de viktige regulatorer i mange sykdommer, inkludert kreft [12] og mirnas kan fungere som onkogener eller tumorsuppressorgener [13], [14]. Effektene av genistein i reguleringen av flere mirnas har blitt rapportert [15], [16], [17]. Vårt laboratorium har vist at genistein hemmer kreft celle vekst rettet mot onkogene mirnas som MIR-21, MIR-151, MIR-221 og MIR-222. I denne studien har vi fokusert på tumor suppressor MIR-574-3p som er regulert av genistein og undersøkt sin funksjon i PCA og målet trasé.
Resultater
Genistein Behandling Øker MIR-574-3p uttrykk som er nedregulert ved PCA
for å bestemme relative uttrykk nivåer av MIR-574-3p i prostata celler, utførte vi kvantitativ real-time PCR ved hjelp PC3 og DU145 cellelinjer og sammenlignet dem med normal prostata epitelceller (RWPE-1). Vi observerte at MIR-574-3p ekspresjon ble betydelig nedregulert i PCA cellelinjer sammenlignet med RWPE-1 celler (PC3 0,68-fold, DU145 0,65-fold) (Fig. 1A).
(A) uttrykk av MIR-574-3p i PCA cellelinjer (DU145 og PC3) og normal prostata epitelceller (RWPE-1). Real-time PCR viste at uttrykket nivåer av MIR-574-3p ble nedregulert i PCA cellelinjer (DU145 og PC3). MIR-574-3p uttrykk ble normalisert til RNU48. Data er presentert som gjennomsnitt ± SE. *, P 0,05. (B) Expression nivåer av MIR-574-3p etter behandling med genistein (25 um og 50 um). MIR-574-3p uttrykk økt med 30-50% i genistein behandlede celler sammenlignet med kontroller. *, P 0,05. (C) MIR-574-3p ekspresjon i kliniske prøver (tilstøtende normalt vev, n = 48; PCa, n = 48). MIR-574-3p ble bestemt ved real-time PCR og normalisert til RNU48. P 0,0001. (D) Real-time PCR viser korrelasjon av clinicopathological egenskaper med MIR-574-3p uttrykk.
For å identifisere mirnas regulert av genistein, gjennomførte vi en miRNA microarray hjelp PC3 celler etter genistein behandling (tabell 1 ). Uttrykket av 33 mirnas var signifikant oppregulert ved hjelp av to konsentrasjoner av genistein (25 mikrometer og 50 mikrometer) med MIR-574-3p å være den mest berørt. Tidligere miRNA uttrykk studier fra vårt laboratorium viste også at Mir-574-3p var signifikant nedregulert i PCA prøvene sammenlignet med ikke-cancerous prostata vev [18]. For å bekrefte uttrykk for MIR-574-3p, utførte vi TaqMan kvantitativ real-time PCR-analyse og observerte at Mir-574-3p uttrykk var signifikant oppregulert med genistein behandling (1,31 til 1,50 ganger) (Fig. 1B).
MIR-574-3p er betydelig nedregulert ved PCA vevsprøver
Vi har evaluert uttrykk nivåer av MIR-574-3p i menneske PCA vev (n = 48) og tilstøtende ikke -cancerous vev (n = 48). Uttrykket nivået av MIR-574-3p var signifikant lavere ved PCA sammenlignet med normalt vev (P 0,0001, Fig. 1C). For å finne ut om nivåene av MIR-574-3p i tumorvev korrelerer med klinikken-patologiske faktorer, analyserte vi MIR-574-3p uttrykk nivåer i humane tumorprøver. Kliniske demografi studiekohorten er oppsummert i tabell 2. Korrelasjon av 574-3p uttrykk med clinicopathological variable slik som patologisk trinn (PT) og Gleason resultatet er vist i fig. 1D. Disse resultatene viser at tilfeller med lav MIR-574-3p uttrykk økning fra lav karakter, lav patologisk stadium til høy klasse og høy patologisk stadium. Disse resultatene tyder på at MIR-574-3p er betydelig nedregulert ved PCA og kan være en antatt tumor suppressor ved PCA.
Effekt av MIR-574-3p Over-uttrykk på celleproliferasjon, Migration og invasjon ved PCA cellelinjer in vitro og in vivo
for å undersøke de funksjonelle rollene til MIR-574-3p, utførte vi gain-of-funksjon studier ved hjelp av en pre-MIR-574-3p miRNA forløper transfektert i PC3 og DU145 cellene. Uttrykket av MIR-574-3p var markert oppregulert i Pre-Mir miRNA forløper transfektanter (figur 2A;. PC3 316,8 ganger, DU145 307,5 ganger). Celleproliferasjonsanalyse (MTS) og sårheling analyse viste signifikant inhibering i MIR-574-3p transfektanter i både PC3 og DU145-celler sammenlignet med kontroll transfektanter (Fig. 2B og 2C). Invasjon assay (Matrigel) viste også at antallet av invaderende celler ble signifikant redusert i MIR-574-3p transfektanter sammenlignet med de tilsvarende (fig. 2D). For å bekrefte effekten av MIR-574-3p på tumorigenicity in vivo, ble MIR-574-3p og MIR-kontroll-transfekterte DU145 cellene subkutant injisert i nakne mus. Vi observerte at Mir-574-3p over-uttrykk hemmet DU145 celletumordannelse in vivo (Fig. 2E). Disse resultatene tyder på at Mir-574-3p spiller en viktig rolle i tumorceller progresjon.
(A) MIR-574-3p uttrykk nivåer i PCA cellelinjer (PC3 og DU145) ble bestemt ved real-time PCR 72 timer etter transfeksjon av Pre-MIR miRNA forløper. MIR-574-3p uttrykk ble normalisert til RNU48. Data er presentert som gjennomsnitt ± SE. (B) Overuttrykte MIR-574-3p hemmer celle levedyktighet betydelig. Cellenes levedyktighet ble analysert ved MTS-celleproliferasjonsanalyse 1, 2 og 4 dager etter forbigående transfeksjon. *, P 0,05. (C) Over uttrykk for MIR-574-3p hemmer cellemigrasjon betydelig. Etter transfeksjon (48 timer), ble et sår dannet ved skraping og målt etter 6, 12 og 24 timer. Representative bilder av sårtilheling analyse er vist 200 × forstørrelse. **, P 0,0001. *, P 0,005. (D) Over uttrykk for MIR-574-3p betydelig redusert celle invasjon. Representative bilder av invasjonen analysen er vist 200 × forstørrelse. *, P 0,005. (E) Representative bilder av svulster i nakne mus 5 uker etter subkutan injeksjon av transfekterte MIR-574-3p DU145 cellelinjer eller kontrollcellelinjer og tidsforløpet av tumorvekst.
MIR-574-3p Influences Cellular apoptose i PCA Cells
Siden Mir-574-3p restaurering betydelig hemmet celledeling i PCA cellelinjer, vi en hypotese om at restaureringen kan indusere apoptose. Fig. 3A og 3B viste at apoptotiske og tidlig apoptotiske fraksjoner (øvre høyre og nedre høyre i kvadrant bilder, henholdsvis) var større i MIR-574-3p transfektanter sammenlignet med kontroll. Dette peker på en pro-apoptotiske rolle for MIR-574-3p og antyder at det påvirker apoptotiske stier og regulerer tumorigenicity. Derfor undersøkte vi uttrykket av ulike apoptotiske proteiner ved Western blot analyse og funnet ut at Mir-574-3p re-uttrykk fører BCL-xL nedregulering (fig. 3C). Dessuten spaltes caspaser-9 og -3 var oppregulert (Fig. 3C), noe som ytterligere støtter det faktum at mir-574-3p er en pro-apoptotisk miRNA.
(A) Apoptose-analyse ved hjelp av flow cytometri . Representative kvadrant figurer av MIR-kontroll og MIR-574-3p transfektanter i PC3 (øverst) og DU145 (lavere) celler. (B) Stolpediagrammet viser forholdet mellom apoptotiske cellefraksjoner (tidlige apoptotiske pluss apoptotiske celler) i Mir-574-3p transfektanter sammenlignet med kontroller. Data for de apoptotiske cellefraksjoner er uttrykt som den relative verdi for den gjennomsnittlige ekspresjon av MIR-kontroll transfektant. *, P 0,05. (C) immunoblot analyse for apoptotiske markører i MIR-kontroll og MIR-574-3p transfekterte DU145 cellene. GAPDH ble brukt som en lasting kontroll.
Søk etter MIR-574-3p målgener av i silico analyse
For å søke etter mulige målgener av MIR-574-3p, vi brukte TargetScan database. Dette programmet viste at Mir-574-3p har 437 spådd målgener. Vi brukte i silico analyse for å identifisere de biologiske prosesser eller som potensielt regulert av MIR-574-3p. Kandidaten målgener ble tildelt trasé ved hjelp GeneCodis programvare analyse (https://genecodis.cnb.csic.es) [19], [20], [21], og statistisk beriket trasé ble identifisert som «Pathways i kreft» «Jak-STAT signalveien», og «Wnt signalveien «(P 0,05, tabell 3). Vi utførte genuttrykk analyser for alle kandidat målgener involvert i hver av de 9 banene bruker microarray expression data, som ble godkjent av Gene Expression Omnibus (GEO) og fokusert på de «Pathways i kreft «. Fra denne analysen ble flere viktige genet målene identifisert, inkludert tropomyosin 3 (TPM3), vingeløse-type MMTV integrasjon nettstedet familie, medlem 5A (WNT5A), ras-relaterte C3 botulinumtoksin substrat 1 (rho familie, lite GTP bindende protein Rac1) (Rac1), epidermal vekstfaktor reseptor (EGFR), retinoid X reseptor-alfa (RXRA), v-akt murin thymoma virale oncogen homologe 2 (akt2), og E1A bindende protein p300 (EP300).
luciferaserapportørplasmid analyser med vektorer som inneholder 3’UTR binding nettsteder av mulige målgener
for å bekrefte bindingen av MIR-574-3p til 3 «UTR av disse 7 målgener, utførte vi luciferaserapportørplasmid analyser. Hvert mål har en spådd bindingssete for MIR-574-3p (fig. 4A). Vi klonet de antatte MIR-574-3p 3’UTRs målrette inn en luciferase reporter analysen vektor. Luciferaserapportørplasmid analyser viste at Mir-574-3p redusert de relative luciferase aktiviteter Rac1, EGFR og EP300 (Fig. 4B) med unntak av fire andre gener. Mutasjon av den antatte MIR-574-3p bindingsseter i disse 3’UTRs redusert respons på MIR-574-3p indikerer at Mir-574-3p binder direkte til 3’UTRs av Rac1, EGFR og EP300.
(A) Antatte MIR-574-3p bindende og muterte steder i 3’UTR av målgener. (B) luciferaserapportørplasmid analyser ved hjelp av vektorer som koder antatte 3’UTR bindingssteder. PC3 og DU145-celler ble transient transfektert med Pre-MIR miRNA forløper eller negativ kontroll, fulgt av transient transfeksjon med grunnleggende vektor eller villtype 3’UTR rapportør plasmider eller muterte 3’UTR plasmider i 24 timer. 3’UTR reporter-aktivitet ble målt ved hjelp av luciferase-analysen og normalisert til aktiviteten av Renilla luciferase. Data er presentert som gjennomsnitt ± SE. *, P 0,05. (C). De mRNA nivåer i de tre målgener av MIR-574-3p ble bestemt ved kvantitativ real-time PCR-analyser etter transfeksjon med MIR-574-3p ligner og negativ kontroll i PCA cellelinjer (PC3 og DU145). *, P 0,05. (D) Immunanalyse for målgener i MIR-kontroll og MIR-574-3p transfekterte PC3 celler. GAPDH ble brukt som en lasting kontroll.
Regulering av Target Gene Expression i PCA cellelinjer av MIR-574-3p
kvantitativ real-time PCR-analyse viste at mRNA uttrykk nivåer av de tre målgener i PC3 og DU145 ble undertrykt i Mir-574-3p transfektanter sammenlignet med kontrollene (fig. 4C). De protein uttrykk nivåer av de tre målgener ble også redusert i Mir-574-3p transfektanter sammenlignet med kontrollene (fig. 4D).
Effekt av Target Gene siRNA knockdown på celleproliferasjon, migrasjon og invasjon aktiviteten i PCA cellelinjer
for å undersøke den funksjonelle rolle målgener, vi utførte tap-av-funksjon studier med si-RNA knockdown med PC3 og DU145 cellene. MRNA og protein ekspresjon av Rac1, EGFR og EP300 ble betydelig undertrykt i si-RNA-transfektantene sammenlignet med kontroller (fig. 5A og 5B). Celleproliferasjon analysen (MTS) og sårtilheling analysen viste signifikant hemming i si-Rac1, si-EGFR og si-EP300 transfektanter i begge PC3 og DU145 cellene sammenlignet med (Fig. 5C og 5D) kontroll transfektanter. Invasjon assay (Matrigel) viste også at antallet av invaderende celler ble signifikant redusert i si-Rac1, si-EGFR og Si-EP300 transfektanter sammenlignet med sine motparter kontroll (fig. 5E).
(A) Target genuttrykk nivåer i PCA cellelinjer (PC3 og DU145) ble bestemt ved real-time PCR 72 timer etter transfeksjon av siRNA. Target genekspresjon ble normalisert til GAPDH. Data er presentert som gjennomsnitt ± SE. *, P 0,05. (B) Target genekspresjon i PC3 cellelinjer ble bestemt ved immunoblotanalyse ved 72 timer etter transfeksjon av siRNA. GAPDH ble anvendt som en kontroll lasting. (C) knockdown av Rac1, EGFR og EP300 hemmer cellenes levedyktighet betydelig. Cellenes levedyktighet ble analysert ved MTS-celleproliferasjonsanalyse 1, 2 og 4 dager etter forbigående transfeksjon. (D) knockdown av Rac1, EGFR og EP300 inhiberer cellemigrering betydelig. Etter transfeksjon (48 timer), ble et sår dannet ved skraping og målt etter 6, 12 og 24 timer. Representative bilder av sårtilheling analyse er vist 200 × forstørrelse. (E) knockdown av Rac1, EGFR og EP300 betydelig redusert celle invasjon. Representative bilder av invasjonen analysen er vist 200 × forstørrelse. **, P . 0,0001
Diskusjoner
Mange studier har vist at genistein regulerer kreftcelle spredning, invasjon, angiogenese og metastase ved å målrette flere gener og signalveier [6], [7], [22]. For eksempel genistein hemmet celle invasjon å redusere ekspresjon av MMP2 og MMP9 i human prostata epitelial og metastatiske celler hvor tumorprogresjon er positivt korrelert med ekspresjonen av MMP [23], [24], [25]. Vi har tidligere vist at genistein ned-regulert ekspresjon av MCM2 ved å øke MIR-1296 ekspresjon i PCA-celler [26]. Vi har også rapportert at genistein nedregulert MIR-221/222 uttrykk i PCA celler som resulterer i økt uttrykk av tumorsuppressorgenet ARHI som er målet for MIR-221/222 [16]. Genistein har også blitt rapportert å hemme angiogenese PCa ved undertrykkelse av VEGF-mediert autokrine og parakrine signalbaner mellom tumorceller og vaskulære endoteliale celler [27]. Den EP300 genet har blitt identifisert som en ko-aktivator av HIF1A og spiller en rolle ved stimulering av hypoksi-indusert gener, for eksempel VEGF [28]. Rac1 er også en viktig regulator av VEGF-mediert angiogenese [29] og MIR-151 har en onkogen funksjon å regulere aktiveringen av Rac1 ved å målrette ARHGDIA [30]. Vi har også nylig vist at genistein hemmet PCa cellemigrasjon og oppregulert flere tumorsuppressorgener inkludert ARHGDIA målrettet av MIR-151. I denne studien fant vi at genistein oppregulert MIR-574-3p uttrykk i PCA celler. I silico analyse og luciferaserapportørplasmid analyser viste at Rac1 og EP300 var mulige målgener for MIR-574-3p. Kvantitativ real-time PCR og Western-analyse viste at mRNA og protein uttrykk nivåer av Rac1 og EP300 i PCA cellene var betydelig nedregulert av MIR-574-3p. Derfor genistein kan nedregulerer Rac1 og EP300 med opp regulerende MIR-574-3p.
Over-uttrykk for Notch1 fører til induksjon av EMT fenotype og økt uttrykk av MIR-21 [31]. Genistein er blitt vist å inaktivere Notch og pinnsvin signalering [31], [32], og vi tidligere har rapportert at genistein hemmet tumorcellevekst ved å redusere MIR-21 ekspresjon i nyrecellekarsinom [15]. Således genistein har en tumor suppressor funksjon, som regulerer «Notch signalering» ved nedregulering av MIR-21. Genistein kan også redusere celleproliferasjon ved å regulere «Wnt signal» [33], [34], [35] gjennom MIR-574-3p i kreft. I denne studien EGFR, en antatt mål genet for MIR-574-3p, var oppregulert ved PCA og økte i fremskreden kreft [36], [37]. EGFR uttrykk ble korrelert med høy Gleason score, sykdom tilbakefall og hormon-refraktær status [37], [38]. Forskere har rapportert at EGFR er regulert av flere mirnas som MIR-7, MIR-128b, MIR-133, MIR-145, miR146a, MIR-146b-5p, MIR-331-3p, MIR-542-5p [39] – [47]. Genistein oppregulert MIR-146a uttrykk i kreft i bukspyttkjertelen celler og fungerer som en tumor suppressor i kastrering-resistente PCa [44], [45]. Genistein kan nedregulert EGFR nivåer med opptil regulerende MIR-574-3p.
Genistein induserer apoptose ved å regulere indre og ytre signalveier. Pro- og anti-apoptotiske Bcl-2 familien proteiner spiller en avgjørende rolle i å regulere den mitokondrielle apoptotiske sti [48] og nedregulering av BCL-XL av genistein induserer apoptose i PCA celler [49]. I denne veien aktivert kaspase-9 akselererer skarp kaspase-aktivering, inklusive caspase-3, og suksessivt spalter signalmolekyler og cellulære proteiner [49], [50]. I vår studie, MIR-574-3p indusert apoptose og regulert uttrykk for BCL-XL, caspase-9 og caspase-3. Derfor denne studien viser at genistein indusert apoptose i PCA celler skjer ved økt MIR-574-3p uttrykk.
I denne studien har vi fokusert på MIR-574-3p som ble oppregulert av genistein og var en betydelig nedregulert miRNA spesifikke for PCa i miRNA profil [18]. Våre tidligere studier indikerte at Mir-574-3p kan være en tumor suppressor miRNA ved PCA og blærekreft [18], [51], [52]. MIR-574-3p ligger på kromosom 4p14, et ofte slettet kromosom region ved PCA og blærekreftcellelinjer [51], [53]. Su et al rapportert at ekspresjon av MIR-574-3p ble redusert i magekreft og celle proliferasjon, migrering og invasjon ble signifikant hemmet i MIR-574-3p-transfekterte magecancerceller [54]. De fant CUL2 genet for å være et mål av MIR-574-3p ved hjelp av beregnings prediksjon og eksperimentell validering. Vår tidligere studie viste at Mir-574-3p har tumor suppressor funksjon og at onkogene MESDC1 genet er målrettet av MIR-574-3p i blærekreft [52]. I denne studien har vi vist at Mir-574-3p er nedregulert i kliniske PCA prøver og androgen-uavhengig PCA cellelinjer (PC3 og DU145). Nedregulering av MIR-574-3p uttrykk i svulster er relatert til høy tumorstadium og Gleason score indikerer at Mir-574-3p kan brukes som en biomarkør for tumorprogresjon ved PCA.
I konklusjonen, vår resultatene viser at genistein opp-regulerer MIR-574-3p uttrykk som retter seg mot flere cellesignalveier. Disse funnene forbedre vår forståelse av hvordan genistein regulerer miRNA uttrykk ved PCA.
Materialer og metoder
Klinisk Prostata Prøver
Alle vev lysbilder ble gjennomgått av et styre sertifisert patolog for identifisering av PCa foci samt tilstøtende normalt glandular epitel. Alle kreftpasienter hadde forhøyede nivåer av prostata spesifikt antigen (PSA) og hadde gjennomgått radikal prostatektomi fra 1998 til 2004. pasientens demografi er vist i tabell 2. Skriftlig informert samtykke ble innhentet fra alle pasienter og studien ble godkjent av UCSF komiteen on human forskning (Godkjenningsnummer nummer~~POS=HEADCOMP: H9058-35751-01).
Cell Culture
Menneskelig PCA cellelinjer, PC3 og DU145 og en ikke-ondartet epithelial prostatacellelinje, RWPE-en, ble kjøpt fra The American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA). PCA-cellelinjene ble dyrket i RPMI 1640 medium supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS) i en fuktet atmosfære av 5% CO2 og 95% luft ved 37 ° C. RWPE-1-celler ble dyrket i keratinocytt-vekstmedium supplert med 5 ng /ml human rekombinant epidermal vekstfaktor og 0,05 mg /ml bovint hypofyseekstrakt (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Subkonfluente celler (60% -70% sammenflytende) ble behandlet med genistein (25 umol /L og 50 umol /l; Sigma, St. Louis, MO, USA) oppløst i dimetylsulfoksid og celler behandlet med vehikkel (dimetylsulfoksid) tjente som kontroll. Medier og genistein ble endret hver dag og cellene ble dyrket i 4 dager.
RNA Utvinning
RNA ble ekstrahert fra FFPE humane prøver ved hjelp av en miRNeasy formalinfiksert parafin-embedded kit (Qiagen, Valencia , CA, USA) etter mikrodisseksjon. Å fordøye DNA, ble det Qiagen RNase-fri DNase sett som brukes. Total RNA ble også hentet fra PCA cellelinjer og en ikke-ondartet epithelial prostatacellelinje ved hjelp av et miRNeasy mini kit (Qiagen) i henhold til produsentens instruksjoner.
mikroRNA Microarray
For miRNA microarray, totalt RNA ble ekstrahert fra PC3-celler behandlet med genistein ved hjelp av en miRNeasy Mini Kit. Den miRNA microarray analyse ble utført og analysert av et kommersielt selskap (Phalanx Biotech, Belmont, CA, USA) ved hjelp av den menneskelige v3 miRNA OneArray plattform som er designet for å inneholde 100% av miRBase Sequence Database Versjons 17,0.
kvantitativ real-time PCR
Hentet total RNA ble revers transkribert til enkelttrådet cDNA ved hjelp av en iScript cDNA Synthesis Kit (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) og en TaqMan mikroRNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Kvantitativ real-time PCR-analyse ble utført med en Applied Biosystems Prism7500 rask rekkefølge Detection System bruker TaqMan universell PCR Master Mix i henhold til produsentens protokoll (Applied Biosystems). Nivåer av RNA uttrykk ble bestemt å bruke 7500 Fast System SDS programvareversjon 1.3.1 (Applied Biosystems). PCR-parametrene for sykling var som følger: 95 ° C i 20 sekunder, 40 sykluser med PCR ved 95 ° C i 3 sekunder og 60 ° C i 30 sekunder. Alle reaksjoner ble gjort i en 10-mL reaksjonsvolumet i tre eksemplarer. Dataene ble analysert med delta-deltaet Ct metode for å beregne fold-endring. TaqMan prober og primere for Rac1 (assay ID: Hs01902432_s1), EGFR (analyse ID: Hs01076078_m1), EP300 (analyse ID: Hs00914223_m1), GAPDH (analyse ID: Hs02758991_g1), MIR-574-3p (analyse ID: 002349), RNU48 (Assay ID: 001 006) ble oppnådd fra Applied Biosystems. GAPDH og RNU48 ble brukt som intern kontroll.
Western Analyse
På 72 timer etter transfeksjon ble cellene lysert med RIPA buffer (Pierce, Brebieres, Frankrike) som inneholder proteasehemmere (Sigma). Protein kvantifisering ble gjort ved hjelp av en BCA proteinanalyse kit (Pierce). Protein lysat (30 pg) ble separert på 4% til 20% SDS-polyakrylamidgeler og overført til en PVDF-membran. Antistoffer mot EP300 og BCL-XL ble kjøpt fra Invitrogen og Santa Cruz Bioteknologi (Santa Cruz, CA, USA). Antistoffer mot Rac1, EGFR og GAPDH ble kjøpt fra henholdsvis GeneTex (Irvine, CA, USA). Antistoffer mot kløyvet caspase-3, -9 og caspase-3, -9 ble kjøpt fra Cell Signaling Technology (Danvers, MA, USA). Etter inkubasjon med primært antistoff ble membranen vasket og deretter inkubert med sekundære antistoffer konjugert til pepperrotperoksidase (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA). Spesifikke komplekser ble visualisert med en echochemiluminescence (ECL) deteksjon system (GE Healthcare, Little Chalfont, UK). Membranen ble strippet ved hjelp ReBlot Plus Sterk Antistoff Stripping Solution (Millipore, Billerica, MA, USA). Uttrykket nivå av gener ble deretter evaluert ved hjelp ImageJ programvare (ver 1.43;. https://rsbweb.nih.gov/ij/index.html).
Transfeksjon
Pre-MIR miRNA forløper og negativ kontroll (Applied Biosystems) ble benyttet i forsterknings-av-funksjon eksperimenter. Rac1, EGFR og EP300 siRNA (Sigma) og negativ kontroll siRNA (D-001810-10, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) ble brukt i tap-av-funksjon eksperimenter. PC3 og DU145 cellene ble transient transfektert hjelp Lipofectamine 2000 transfeksjon reagens (Invitrogen), i henhold til produsentens anbefalinger.
Cell Proliferation, migrering og invasjon Analyser
Celleproliferering ble målt ved hjelp av en CellTiter 96 vandige løsning Cell Proliferation Assay (MTS) (Promega, Madison, WI, USA) utført i henhold til produsentens instruksjoner. Celleformering ble bestemt ved absorbansmålinger ved 490 nm ved bruk av Spectramax 190 (Molecular Devices Co., Sunnyvale, CA, USA). Cellemigrering aktivitet ble evaluert ved en sårhelende analysen. Celler ble sådd ut i seks-brønners skåler, og cellemonolagene ble skrapet ved anvendelse av en P-20 mikropipette spissen. Bredden av det første gap (0 h) og den gjenværende gap 6, 12 og 24 timer etter at såret ble beregnet fra mikrofotografier. En celle invasjon analysen ble utført ved å bruke modifisert Boyden kamre som består av Transwell-forbelagt Matrigel membranfilterinnsatser med åtte mikron porer i 24-brønners vevskulturplater (BD Biosciences, Bedford, MA, USA). Minimum essential medium inneholdende 10% FBS i det nedre kammer tjente som kjemoattraktant, som tidligere beskrevet [55]. Alle forsøkene ble utført i tre eksemplarer.
In vivo tumorvekst
Alle dyr omsorg ble i samsvar med retningslinjene i San Francisco Veterans Affairs Medical Center og studien ble godkjent av San Francisco VA IACUC (protokoll nummer~~POS=HEADCOMP: 11-008-01). Animal brukere har fullført opplæringsprogrammer for å håndtere og arbeide med mus gjennom AALAS (American Association for Laboratory Animal Science) før dyreforsøk. For subkutan xenograft mus modell, DU145 celler (2,5 × 10
6) som ble transient transfektert med MIR-574-3p eller MIR-kontroll ble suspendert i 50 mL RPMI 1640 medium og ble subkutant injisert i kvinnelig naken mus (stamme BALB /c nu /nu; Charles River Laboratories, Inc., Wilmington, MA, USA, 5 uker gamle). Totalt 8 nakne mus (4-MIR-574-3p, 4-MIR-kontroll) ble anvendt og tumorvekst ble undersøkt i løpet av 35 dager. Tumorvolumet ble beregnet på basis av bredde (x) og lengde (y):. X
2y /2, der x y
apoptose Assays
fluorescens-aktivert celle- sortering (FACS) analyse for apoptose ble utført 96 timer etter transfeksjon, ved hjelp av Annexin V-FITC /7-AAD Kit (Beckman Coulter, Brea, CA, USA) i henhold til produsentens protokoll. Fargede celler ble umiddelbart analysert med et strømningscytometer (Cell Lab Quanta SC, Beckman Coulter).
Identifikasjon av MIR-574-3p regulert målgener og bioinformatiske analyse
For å søke etter gener som reguleres av MIR-574-3p, brukte vi TargetScan algorism (slipp 6.2, https://www.targetscan.org/).
