Abstract
I spesifikke celletyper som keratinocytter, spiller Notch signale et viktig pro-differensiering og tumor undertrykke funksjon, med down-modulering av Notch1 genet bli assosiert med kreftutvikling. Foruten å være kontrollert av p53, lite annet kjent på regulering av Notch1 genekspresjon i denne sammenheng. Vi rapporterer her at transkripsjon av dette gen er drevet av en TATA-mindre «skarp topp» promoter, og at den minimale funksjonell region av denne promotor, som strekker seg fra -342 bp posisjon til initieringskodonet, er differensielt aktiv i normal versus cancer celler. Dette GC rike regionen mangler p53 bindingsseter, men binder Klf4 og SP3. Dette funnet er sannsynlig å være av biologisk betydning, som Klf4 og, i mindre grad, sp3 blir oppregulert i en rekke kreftceller hvor Notch1 uttrykk er ned-modulert, og Klf4 over-ekspresjon i normale celler er tilstrekkelig til å ned -modulate Notch1 gentranskripsjon. Den kombinerte knock-down av Klf4 og sp3 var nødvendig for den omvendte effekten av å øke Notch1 transkripsjon, i samsvar med de to faktorer utøve en overlappende repressor funksjon gjennom deres binding til den Notch1 promoteren
relasjon:. Lambertini C, Pantano S, Dotto GP (2010) Differential Kontroll av Notch1 gentranskripsjon ved Klf4 og sp3 transkripsjonsfaktorer i Normal versus Cancer-Avledet Keratinocytter. PLoS ONE 5 (4): e10369. doi: 10,1371 /journal.pone.0010369
Redaktør: Joanna Mary Bridger, Brunel University, Storbritannia
mottatt: 24 november 2009; Godkjent: 22 mars 2010; Publisert: 28 april 2010
Copyright: © 2010 Lambertini et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av en bevilgning fra den sveitsiske National Foundation, et stipend fra EU (Epistem, sjette rammeprogram, LSHB-CT-2005-019067), og NIH Grants AR39190 og AR054856 og til GPD Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Notch signalering spiller en sentral rolle i kontrollen av celle skjebne besluttsomhet, vekst og differensiering [1], [2]. Det er også en determinant av karsinogenese, med enten en positiv eller negativ rolle, avhengig av celletype og bestemt kontekst [3], [4]. Den best karakteriserte «kanonisk» -veien av Notch aktivering involverer proteolytisk spaltning og translokasjon av det cytoplasmatiske domene av reseptoren til kjernen, hvor den knyttes til det DNA-bindende protein CSL å omdanne den fra en repressor til en aktivator av transkripsjon [1], [ ,,,0],2]. Mest oppmerksomhet har blitt gitt til kontroll av Notch veien ved det post-transkripsjonelle nivå, inkludert behandling og modning av Notch-reseptorer, aktivering av ligander på celleoverflaten, og proteinmodifisering og degradering [1], [2]. Imidlertid kan en viktigste formen for regulering også være på nivå med gentranskripsjon. Ekspresjon av de fire Notch-reseptor-gener og deres ligander reguleres i bestemte cellulære sammenhenger, og kan bli endret i kreftutvikling [3], [5]. Videre er aktivering av en reseptor mottagelig for påvirkning sin egen ekspresjon, så vel som av andre familiemedlemmer, og kan også støte på en positiv eller negativ måte, ved ligand uttrykk [1], [2].
et eksempel på dette komplekset modusen for regulering av Notch uttrykk har blitt gitt av studier i keratinocytter, hvor denne veien spiller en nøkkelrolle i å fremme differensiering og undertrykke tumorigenesis [3]. I basallaget av epidermis, har gjensidig negativ regulering mellom ligander på Delta familien og Notch-reseptorer blitt foreslått å kontrollere balansen mellom antatte keratinocytt stamcellepopulasjoner og celler forpliktet til differensiering [6]. På den annen side har positive feedback regulering mellom Notch-reseptorer og ligander av taggete familien blitt antydet som en mulig mekanisme for synkronisering av keratinocytt overgang fra den basale prolifererende til suprabasal differensierende lag av epidermis [7]. Mens både Notch1 og Notch2 reseptorer er uttrykt i interfollicular epidermis, deres regulering og funksjon er bare delvis overlappende. Spesielt, mens Notch2 nivåer er jevnt forhøyet i de unike lag av epidermis, blir ekspresjon av Notch1 avstengt i de ytterste lagene [7]. Dette kan være av funksjonell betydning, siden forhøyet Notch1 aktivitet, samtidig som kreves for engasjement og inntreden i differensiering, kan deretter undertrykke de siste trinnene i denne fremgangsmåten [7], [8]. Tilsvarende, i keratinocytt-avledet svulster, som kutane plateepitelkarsinom (SCCS), basalcellekreft (BCC) [9], [10] og sent stadium livmorhals karsinom [11], er Notch1 uttrykk redusert til en vesentlig større grad enn Notch2 . Dette er sannsynligvis av funksjonell betydning som, selv i nærvær av Notch2, delesjon av Notch1 genet er i seg selv tilstrekkelig til å fremme keratinocytt-tumor utvikling [9], [11], [12].
Overraskende er lite vet om kontroll av Notch1 genuttrykk. I keratinocytter, bindes endogen p53 til Notch1 promoteren, øker dens transkripsjon, og kompromittert p53-funksjon kan forklare, i det minste delvis, det tumorassosierte ned-modulering av Notch1 uttrykk [9], [13], [14]. Tilsvarende redusert p53-nivåer via virus-E6-avhengig nedbrytning kan forklare den allerede nevnte nedregulering av ekspresjon Notch1 i HPV-positive cervical carcinoma celler [14]. Kontroll av Notch1 uttrykk av p53 er også av betydning for keratinocyte respons på UV-lys, en stor agens av hudens aldring og kreft [13], [14]. I tillegg til keratinocytter, og deres ondartede motstykker, er Notch1 uttrykk under positivt p53 kontroll i lunge og prostata kreft celler, på andre celletyper som økte hakk aliserte årsaker veksthemming [15], så vel som i B-celle kronisk lymfatisk leukemi-celler, der Notch signale forbedrer celleoverlevelse [16]. I mange av disse tilfellene ble p53 funnet å være spesielt involvert i kontrollen av den Notch1 genet med liten eller ingen effekt på andre familiemedlemmer [9], [14], [15]. Interessant nok var ingen slik regulering som finnes i tykktarm carcinoma-celler, til tross for bindingen av p53 til Notch1 promoteren selv i disse cellene, som peker til den sannsynlige samspillet mellom p53 og andre hittil uidentifiserte faktorer som bestemmer Notch1 gentranskripsjon [9].
Sp /KLF familie av transkripsjonsfaktorer består av proteiner med tre svært konservert DNA-bindende sink finger domener, som anerkjenner GC /CACCC bokser stede i mange GC-rik arrangører [17]. Disse faktorene spiller en viktig rolle i transkripsjon av husholdningsgener samt gener med mer begrensede spesifikke funksjoner celletype [18]. Blant KLF familiemedlemmer, har Klf4 tilt siste oppmerksomhet på grunn av sin evne, sammen med andre faktorer, for å omprogrammere celle skjebne besluttsomhet [19], samt fremme eller undertrykke kreftutvikling i en kontekst avhengig måte [20]. Vi rapporterer her at i keratinocytter Klf4 binder seg til Notch1 promoter og, sammen med sp3, fungerer som en negativ regulator av Notch1 gentranskripsjon, påvirker rekruttering av den PolII preinitiation komplekset gjennom en egen mekanisme fra p53. Inhibering av Notch1 ekspresjon ved Klf4 er i samsvar med de grunnleggende rolle Klf4 i de sene stadier av keratinocytt-differensieringen [21], hvor ekspresjon av genet Notch1 må være slått av [7]. Imidlertid kan den samme reguleringsmekanisme også bidra til down-modulering av Notch1 uttrykk i keratinocytt-avledet svulster, hvor Klf4 kan være abnormt over-uttrykk.
Resultater
1. Transkripsjon av den Notch1 genet fra en «skarp topp «TATA mindre promoteren
I tillegg involvering av p53 [9], [13], [14], [22], er lite kjent om kontroll av Notch1 gentranskripsjon . Den menneskelige Notch1-genet er lokalisert på kromosom 9 og strukturert i 34 eksoner, som koder for et stort protein på omtrent 270 kDa. For ytterligere innsikt i transkripsjonen kontroll av dette genet, sammenlignet vi sin oppstrøms ikke-kodende sekvens i det humane versus mus genomer. Flere forutsagte p53-bindingsseter er til stede i 3,0 kb oppstrøms sekvens av muse og humane Notch1 promotorer selv ved forskjellige posisjoner i forhold til initieringskodonet (Fig. 1A). En gradient med økende sekvenshomologi ble funnet mot de humane og mus initiering kodoner, med ved 70% av sekvensidentitet i GC-rike domenet fra posisjon -500 bp til ATG. Nukleotid analyse ytterligere spiss til en antatt TFIID-bindingssetet rundt posisjon -230 bp omgitt av distale sentrale elementer, mens ingen TATA bokser kunne identifiseres (ved hjelp av TESS, Consite eller Genomatix programmer, www.cbil.upenn.edu/cgi-bin /tess /tess, asp.ii.uib.no:8090/cgi-bin/CONSITE/consite;. www.genomatix.de) (figur 1B)
(A) Nukleotidsekvensen sammenligning av 3.0. kb oppstrøms region av det humane og mus Notch1 genene, med økende homologi til det kodende område illustreres ved hjelp av en grå intensitet gradient. Posisjonen av mulige p53-bindingsseter, noe som indikerer en bioinformatikk program (MatInspector, https://www.genomatix.de) er angitt i forhold til initieringskodonet. «Canonical» p53-bindingsseter er sammensatt av to halv-nettsteder med nukleotidsekvensen RRRCA /T-T /AGYYY (med R = purin, og Y = pyrimidin), atskilt med et mellomrom på 0-21 nukleotider. Quarter-sider (RRRCW og WGYYY) kan være til stede i en head to head, eller hode til hale orientering, som indikert med piler (→ eller ←). Tall over og under henviser til den matchende poengsum mellom nukleotidsekvensen av hvert område, og den anslåtte matrise, med en perfekt match = 1,00, og en «god» match 0,80. (B) Kjernepromotorelementer av det humane Notch1 gen med en indikasjon på GC-rik proksimale region, antatte TFIID bindingssetet og distale kjerneelementer (DCE) [53] (som identifisert ved den TESS program) og Notch1 transkripsjonsstartseter ( TSS). (C) Eksperimentell bestemmelse av Notch1 TSS ved 5 «RACE. Humane primære keratinocytter ble anvendt som kilde for total RNA for 5»-RACE-amplifikasjon ved bruk av GeneRacer og en spesifikk revers primer lokalisert i 242 bp fra startkodonet. Kloning og sekvensering av forsterkning reaksjonsprodukt (som vist etter gelelektroforese) pekte på en stor TSS i posisjon -262 og andre i posisjon -259. Sekvensen av overlappende initiator elementer (Py Py A (1) NT (3) Py Py), i vårt tilfelle TCA (1) CT (3) AG for de store TSS, og CTA (1) GT ( 3) GC for andre TSS, er angitt med fet skrift, mens de første nukleotidene av de to TSS er i kursiv.
for å etablere eksperimentelt transkripsjon start hotellet (TSS) av Notch1 transkripsjon i primære humane keratinocytter (HKC), vi klonet og sekvensert produkter av 5′-RACE (Rapid forsterkning av fem «komplementært DNA slutter) reaksjon fra disse cellene (fig. 1C). Resultatene viste til en hoved TSS av det humane Notch1-genet i posisjon -262 bp fra ATG, med en andre mindre TSS på -259 bp. Således blir transkripsjon av den Notch1-genet drevet av et CpG øy promoter, som i motsetning til de fleste promotorer av denne klasse [23], har egenskapene til en «skarp topp «promoter, med nøyaktig TSSs sannsynligvis bestemt av en overlappende initiator (Inr) element [24].
2. Kartlegging av funksjonell Notch1 promoter-regionen i normal versus kreftceller
mRNA uttrykk kan styres på flere nivåer, fra de første trinnene av transkripsjon (initiering /forlengelse) til RNA prosessering og stabilitet [25]. Sanntid RT-PCR-analyse med primere som er spesifikke for den 5 «og 3» regioner av Notch1 transkripsjon og første intron viste at høyere ekspresjon av Notch1 mRNA tidligere rapportert i HKC versus keratinocytt-avledede cancerceller [9], [11] ble opprettholdes uavhengig av de spesifikke regioner av Notch1 transkript som ble analysert (fig. 2).
(A) Organisering av den Notch1 genet, med en angivelse av den åpne leseramme (ORF) med kodende eksoner og mellomliggende introner (svarte tykke blokker og linjer, henholdsvis) og 5 «og 3» uoversatt regioner (UTR). Plasseringen av de forskjellige sett av primere anvendt for sanntids RT-PCR-analyse er også indikert (tynne piler). (B) Total RNA fra primære humane keratinocytter (HKC), livmorhalskreft celler (HeLa, Caski og Siha), og huden (SCC13) og muntlig (SCCO28) plateepitel karsinom celler ble analysert ved real-time RT-PCR med primere som tilsvarer annen region av Notch1 genet som angitt i (A). For denne og alle andre tall, verdier ble normalisert til 36B4 og /eller 18S RNA-nivåer, og uttrykt som relativ til de i primær keratinocytter.
Disse resultatene antydet at transkripsjon av Notch1 genet er forskjellig kontrollert i normal versus kreftcellene allerede på den første delen av transkripsjon. For ytterligere å teste denne muligheten, bestemmes at det er minimale funksjonell region av Notch1 promoteren og vurdert om et slikt område er differensielt aktiv i normal i forhold til kreftceller. For dette formål ble det 2,4 kb region av Notch1 promoter oppstrøms for initieringskodonet klonet inn i et luciferase reporter, etterfulgt av promoter aktivitetsanalyser i HKCs versus HeLa-celler. Testing av en serie av fragmenter med progressivt redusert lengde fra 5′-enden, viste at en 342 bp region fra Initieringskodonet beholder fullstendig promoter-aktivitet i HKCs, mens ytterligere forkortning av Notch1 promoteren til -315 bp og -300 bp regioner resulterte i progressivt redusert aktivitet (fig. 3A). Notch1 promoter-regioner med full aktivitet i HKCs var betydelig mindre aktive i HeLa-celler, noe som reflekterer forskjellene i endogene Notch1 gentranskripsjon, mens forskjellen i promoter-aktivitet ble mindre med kortere Notch1 promotorfragmenter (Fig. 3A).
(A) Forskjellige fragmenter av den humane Notch1 promoteren med avtagende 5′-endene ble klonet inn i et luciferase reporter plasmid, etterfulgt av forbigående transfeksjon inn i primære humane keratinocytter og HeLa-celler (sort og grå søyler, henholdsvis) sammen med en Renilla minimal reporter for normalisering . Promotor-aktiviteten ble målt 48 timer etter transfeksjon. Relativ promoter aktivitet av de forskjellige journalister i HKC versus HeLa ble også beregnet (høyre tabell). (B) Fragmenter av human Notch1 promoteren med partiell eller total delesjon av sekvensen fra TSS til initieringskodonet (som mangler nukleotider -159 til -1, og -262 til -1, respektivt) ble klonet inn i et luciferase reporter plasmid, etterfulgt av forbigående transfeksjon /promoter aktivitetsanalyser i primære humane keratinocytter og HeLa-celler som i forrige panel. Relativ promoteraktivitet i HKC versus HeLa ble også beregnet. (C) Total RNA fra primære keratinocyter og forskjellige kreftcellelinjer, inkludert PC3, Caski, og HeLa fra to forskjellige kilder (HeLa # 1 og 2), ble benyttet for RT-PCR amplifikasjon av 5′-UTR område av Notch 1 gen (primer posisjon -262 /-174). Legg merke til hurtigere migrerende bånd oppnådd med HeLa-prøvene. Kloning og sekvensering av det overlappende genomisk region (fra posisjon -392 bp til -1 av Notch1 promoter) viste en sletting fra posisjon -215 til -202 i HeLa celler. (D) Den samme Notch1 genomiske region pluss /minus den ovenfor sjonen ble klonet inn i et luciferase reporter plasmid, etterfulgt av promoter aktivitetsanalyser i HKC versus HeLa-celler, målt som i (A) og (B).
Nukleotidsekvenser nedstrøms fra transkripsjons-startseter (TSS) spiller også en viktig rolle i kontroll av promoter-aktivitet, er nødvendig for dannelsen av de transkripsjon pre-initierings- og initiering komplekser [26]. I overensstemmelse med betydningen av denne regionen, promotor-aktivitet ble betydelig nedsatt når sekvensen av det Notch1 promotor nedstrøms for TSS til initieringskodonet (fra -262 til -1) var slettet delvis eller fullstendig (med promoter-konstruksjoner som mangler nukleotider -159 til -1, og -262 til -1, henholdsvis) (fig. 3B). Selv i dette tilfellet, egen redusert promotor-aktivitet ble fulgt av en mindre forskjell mellom normale og kreftceller (Fig. 3B).
PCR-amplifisering av genomisk DNA, med sikte på å vurdere sin metylering tilstand som nærmere vist nedenfor, avslørte eksistensen av en liten delesjon i Notch1 promoter-regionen i to forskjellige stammer av HeLa-celler, som ikke var til stede i andre kreftceller som PC3 og Caski (fig. 3C). Ved kloning og sekvensering av denne regionen, kartlagt vi slettingen til -215 til -202 bp posisjon, like nedstrøms for TSS. Funksjonelle promoter aktivitetsanalyser av det klonede promoter regionen promoter i HKC versus HeLa-celler viste at denne 10 nukleotider sletting ikke påvirker promoter aktivitet eller dets differensial regulering i normal versus kreftceller (Fig. 3D).
3. Negativ kontroll av Notch1 gentranskripsjon ved Klf4 og sp3
differensial transkripsjonen aktivitet av GC-rike proksimale område av Notch1 promoter kan være knyttet til en annen metylering tilstand i HKCs versus HeLa-celler. Trekke ned analyser med antistoffer mot metylert DNA etterfulgt av PCR-amplifikasjon pekt på et betydelig nivå av metylering av den første intronic område (mellom nukleotidene + 1168 /+ 1798) i HeLa-celler, men ikke i HKCs, noe som kan bidra til forskjellige transkripsjonen av Notch1 -genet (fig. 4A). Men ingen påviselig metylering ble funnet i Notch1 promoter regionen som kan forklare for sine ulike nivåer av aktivitet i de to cellene. En annen mulighet er at differensial Notch1 promoter-aktivitet er knyttet til transkripsjonsfaktorer som bindes til denne regionen og styrer dens aktivitet. Transkripsjonsfaktorer med høyest sannsynlighet for å binde seg til GC rike domener som den ene som er tilstede i Notch1 promoter proksimale region er zink-finger-proteiner av SP- og KLF familier [27]. Ett eller flere av disse faktorer kan bli uttrykt forskjellig i normalt forhold til kreftceller. Faktisk, sanntids RT-PCR av HKCs versus et panel av livmorhalskreft og keratinocytt-avledede SCC-celler viste at av flere Sp /KLF familiemedlemmer som ble undersøkt, Klf4 var sterkt og konsistent oppregulert i kreftceller (Fig . 4B). Sp1 og sp3 ble også oppregulert i disse celler, selv om i mindre grad enn Klf4, mens ekspresjonen av andre familiemedlemmer, som KLF5, eller KLF10a ble bare svakt påvirket og /eller ned-modulert (Fig. 4B). Lesser forskjeller ble observert på proteinnivå, trolig som følge av post-transcriptional og /eller protein destabiliserende hendelser (fig. 4C).
(A) Kjerne ekstrakter fra primære humane keratinocytter (HKC) og HeLa-celler ble immunoutfelt med antistoff mot metylert DNA, etterfulgt av PCR-analyse av den utfelte DNA med primere som er spesifikke for de angitte regioner av Notch1 promoter og første intronic region. PCR med primere som er spesifikke for en kjent metylert-genet ble anvendt som positiv kontroll. (B) Total RNA prøver fra primære humane keratinocytter (HKC) og de angitte kreftcellelinjer ble analysert ved real time RT-PCR med primere spesifikke for SP1, SP3, Klf4, KLF5 og KLF10a. (C) Primære keratinocytter, HeLa og SCC13 celler ble analysert ved immunoblotting med antistoffer mot SP1, sp3 og Klf4, med β-actin som lik belastning kontroll.
For å vurdere de funksjonelle konsekvensene av økt Klf4 uttrykk på Notch1 transkripsjon, ble to komplementære tilnærminger foretatt. I den første ble det HKCs transient transfektert med en Notch1 reporter; promoter-aktivitet ble undertrykket ved samtidig transfeksjon med en Klf4 ekspresjonsvektor (fig. 5A). Som et andre tilnærming, ble HKC infisert med et retrovirus som uttrykker Klf4. Sanntid RT-PCR, så vel som immunoblot-analyse viste at endogen Notch1 ekspresjon ble betydelig redusert i disse cellene som følge av Klf4 over-ekspresjon (Fig. 5B, C).
(A) Primære keratinocytter ble ko -transfected med en reporter som inneholder den minimale funksjonelle Notch1 promoter (fra -392pGL4) sammen med en ekspresjonsvektor for human Klf4 eller tom vektorkontroll. Renilla minimal reporter ble anvendt for intern normalisering, og promotoren aktiviteten ble målt 48 timer etter transfeksjon. Vist er et resultat av to forskjellige eksperimenter. (B) Primære keratinocytter ble infisert med en retroviral vektor som uttrykker KlfF4 (pMSKlf4) eller en tom vektorkontroll og høstet etter 48 timer, etterfulgt av bestemmelse av Klf4 og Notch1 mRNA ekspresjon ved sanntids-PCR. Effektivitet av infeksjon med pMSKlf4 viruset ble også vurdert av den utbredte morfologiske endringer med utflating av celler (øvre paneler). (C) primære keratinocyter ble infisert med et retrovirus som uttrykker KlfF4 versus en tom vektorkontroll som i det foregående panel, etterfulgt av immunoblot-analyse med antistoffer mot Notch1, Klf4 og γ-tubulin som er lik lasting kontroll. Høyre panel: data ble kvantifisert ved densitometrisk skanning av autoradiogram og uttrykt som vilkårlige enheter etter normalisering for γ-tubulin uttrykk. Lignende resultater ble oppnådd i et andre uavhengig forsøk.
Omvendt, for å teste om Klf4 undertrykkelse fører til Notch1 oppregulering, HKC samt HeLa-celler ble transfektert med sirnas for Klf4. Effektiv ned-modulering av dette gen hadde ingen effekt på Notch1 gentranskripsjon, og tilsvarende mangel på effekter ble observert etter knock-down av sp3 og SP1 (Fig. 6A og data ikke vist). Men den kombinerte siRNA-mediert knockdown av Klf4 og sp3 resulterte i samsvar oppregulering av Notch1 ekspresjon i både HKCs og kreftceller (HeLa og SCC13 celler), med samtidig knock-down av Sp1 å ha ingen tilleggseffekter (Fig. 6B , C og data ikke vist).
(A) Primære keratinocytter ble transfektert med to sett sirnas for Klf4, SP1 eller sp3 parallelt med egge siRNA kontroller i 48 timer, etterfulgt av uttrykket analyse av målrettede gener av sanntids-RT-PCR og immunoblotting (venstre og midtre paneler, henholdsvis) De samme RNA prøver ble også analysert for nivåer av Notch1 uttrykket (høyre panel). (B) Primære keratinocytter, ble transfektert som i forrige panel med to forskjellige sett med sirnas for Klf4 og SP3 (siRNA-1, siRNA-2) (venstre kolonne) eller med sirnas for Klf4, SP1 og SP3 (høyre kolonne), etterfulgt av sanntids-RT-PCR-analyse av Notch1 uttrykk. Vist er den beregnede gjennomsnitt av fire forsøk under anvendelse av 36β4 og 18S RNA for intern normalisering. (C) HeLa og SCC13-celler ble transfektert med to forskjellige sett med sirnas for Klf4 og sp3 (siRNA-1, siRNA-2), etterfulgt av bestemmelse av Notch1 ekspresjon ved sanntids RT-PCR som i det foregående panel. Primære keratinocytter og SCC13 celler ble transfektert med sirnas mot de angitte gener etterfulgt av immunoblot analyse av Notch1 protein uttrykk med γ-tubulin som lik belastning kontroll. Høyre panel: data ble kvantifisert ved densitometrisk skanning av autoradiogram og uttrykt som vilkårlige enheter etter normalisering for γ-tubulin uttrykk
Den nødvendige kombinert knockdown av Klf4 og SP3 for oppregulering av Notch1 uttrykk kan. forklares ved samtidig binding av disse faktorer til Notch1 promoteren. Faktisk kromatin immunpresipitering (chip) analyser viste i HKCs og HeLa-celler, som både Klf4 og sp3 binde GC rike proksimale området av Notch en promoter (fig. 7A-D). Interessant, i HKCs, Sp1 ble også funnet å binde til dette området, men til en mye mindre grad enn til den proksimale delen av den p21WAF1 /Cip1 promoter, et veletablert mål Sp1 [28]. Ingen Sp1 binding til Notch1 promoteren ble funnet i HeLa-celler (Fig. 7B). Lignende Chip analyser ble også utført med antistoffer mot en urelatert GC-bindende transkripsjonsfaktor, Maz [29]. Mens maz1 ble funnet å binde seg til p21-promoteren på samme måte som Sp1, sp3 og Klf4, var det liten eller ingen binding av dette protein til den proksimale delen av den Notch1 promoter (fig. 7B, C).
( A) Forut Klf4- og SP1 /SP3 bindingsseter i -340 /-300 bp Notch1 promoter regionen. Vist er nukleotidsekvensen i denne regionen med, på toppen, de forutsagte bindingsseter for Klf4- og Sp1 /sp3. (B og C) Primære keratinocytter (HKC) og HeLa-celler ble behandlet for kromatin immunopresipitering (chip) analyse med antistoffer mot Sp1, sp3 (B), Klf4 (C) eller Maz, som angitt, etterfulgt av amplifisering av to Notch1 promotorområdene ligger mellom bp -740 /-262 (Chip en) og rundt -6600 bp (Chip 2), som inneholder og mangel henholdsvis antatte SP1 /SP3 og Klf4 bindingssteder. Amplifikasjon av den proksimale promoter regionen av p21
WAF1 /Cip1 gen (Chip p21) ble benyttet som positiv kontroll. Un-utfelte kromatin forberedelser ble brukt for parallelle amplifikasjonsreaksjoner som «inngangs» DNA-kontroller. (D) Chip analyser med anti-SP3 og Klf4 antistoffer og ikke-immune IgG som i de foregående platene ble etterfulgt av real time PCR forsterkning av region1 av Notch1 promoter. Mengden av utfelt DNA ble beregnet i forhold til den totale inngangs kromatin og uttrykt som en prosentandel av den totale henhold til den følgende formel [54]: Prosent total = 2ΔCt x 5, hvor ΔCt = Ct (inngang) – Ct (immunpresipitering), og Ct er syklusen terskel.
4. Motsatt kontroll over Notch1 transkripsjon av p53 versus Klf4 /sp3
Et viktig spørsmål er om p53 og Klf4 /sp3 kontroll Notch1 gentranskripsjon gjennom egne eller konvergent mekanismer. Et viktig regulatorisk trinn er transkripsjonsfaktor avhengig rekruttering av transkripsjons pre-initiering kompleks, som inneholder RNA Polymerase II (PolII), for å målrette arrangører [30]. For å vurdere om dette første trinnet av Notch1 transkripsjon er under p53 og Klf4 /sp3 kontroll, ble to komplementære tilnærminger foretatt. I HeLa-celler, hvor p53 nivåer er svært lav på grunn av E6 avhengig nedbrytning, evaluert vi effektene av økt p53 av adenovirus-mediert over-uttrykk. I kontroll HeLa-celler, Chip analyser viste liten eller ingen binding av PolII til promotoren og 3’UTR av Notch1 genet, mens en slik binding var lett påvisbar i celler med økt p53-ekspresjon (Fig. 8A). I HKC, hvor nivåene av Klf4 er normalt lav, vurderte vi effekten av økt Klf4 uttrykk via retroviral infeksjon. Chip-analyser viste binding av PolII til promotoren og 3’UTR av Notch1 genet i kontroll HKCs, mens ingen slik binding var påvisbar i celler med øket Klf4 ekspresjon (Fig. 8B).
(A) HeLa cellene ble infisert med en rekombinant adenovirus som uttrykker villtype p53 (Adp53) eller GFP kontroll (AdGFP) og behandlet for chip-forsøk med antistoffer mot RNA polymerase II (α-PolII) og ikke-immune IgG som kontroll. PCR-amplifisering av de angitte områdene av Notch1-genet ble utført i parallell med tilsvarende forsterkning av inngangs kromatin DNA. Høyre panel: for kvantifisering av resultatene, kromatin immunutfelt materiale ble også analysert ved hjelp av sanntids-PCR-amplifisering av de angitte områdene av Notch1 promoter, i parallell med inngangs kromatin DNA, etterfulgt av en beregning av binding i henhold til den samme formelen anvendes i fig. 7D. (B) Primære keratinocytter (HKC) ble infisert med en retroviral vektor over-uttrykker Klf4 (pMSKlf4) eller tom vektor kontroll (Ctrl) i 48 timer etterfulgt av chip analyser for PolII bindende som i forrige panel, inkludert kvantifisering av resultatene av real time PCR (høyre panel).
Funksjonelt, for å vurdere om økt p53 uttrykk og Klf4 /sp3 ned-modulasjon kan synergize ble to komplementære tilnærminger foretatt. I den første, ble HeLa-celler infisert med en p53-uttrykkende adenovirus pluss /minus knock-down av Klf4 og sp3 uttrykk. I den andre, ble HeLa-celler transfektert med sirnas spesifikke for UBE3A protein, en negativ regulator av p53 stabilitet, som en metode for å øke endogen p53-ekspresjon [14]. Økte p53 nivåer ved enten tilnærminger forårsaket den forventede induksjon av Notch1 uttrykk. Den kombinerte knockdown av Klf4 og sp3 forårsaket også en økning på Notch1 uttrykk, men ingen additiv eller synergistiske effekter ble observert ved samtidig økt fra p53 og knock-down av Klf4 og SP3 (Fig. 9A og B).
(A) HeLa-celler ble transfektert med sirnas for sp3 og Klf4 parallelt med egge siRNA kontroller fulgt, 48 timer etter transfeksjon, infeksjon med en p53-uttrykkende adenovirus (Adp53) eller GFP kontroll (AdGFP), i 24 timer. Nivåer av Notch1 mRNA uttrykk ble bestemt ved real-time RT-PCR. De forventede forandringer av p53, sp3 og Klf4 ekspresjon ble også bekreftet ved sanntids RT-PCR, med resultater som ligner de som er vist i foregående figurer. (B) HeLa-celler ble transfektert med sirnas for UBE3A, Klf4 og sp3 alene eller i kombinasjoner som er angitt i parallell med egge siRNA kontroller. UBE3A og Notch1 uttrykk ble undersøkt ved real-time RT-PCR. (C og D) Primære keratinocytter (HKC) (C) og HeLa og SCC13 celler (D var infisert med en Klf4 uttrykker retrovirus eller tom vektor kontroll i 48 timer, etterfulgt av infeksjon med Adp53 eller AdGFP virus i 24 timer. Notch1 mRNA nivåene ble vurdert ved real-time RT-PCR.
for å vurdere om Klf4 kan undertrykke de induktive effektene av p53, HKCs, HeLa og SCC13 celler ble infisert med Klf4 uttrykker retrovirus eller tom vektor kontroll, etterfulgt av infeksjon med p53-uttrykkende adenovirus eller GFP kontroll. økte p53-nivåer forårsaket induksjon av Notch1 ekspresjon i kontroll HKCs samt i HKCs hvor Notch1 genet ble ned-modulert som en konsekvens av øket Klf4 ekspresjon (fig. 9C). en mer omfattende induksjon av Notch1 ekspresjon ble forårsaket av Ad-p53 infeksjon av kreftceller, slik som HeLa og SCC13-celler, som deler en mutert eller stille p53 svei og lave endogene Notch1 nivåer [9], [11]. i disse celler, som uttrykker høyt nivå av endogen Klf4, gjorde videre uttrykk for Klf4 ikke reduseres Notch1 uttrykk og ikke forstyrre med sin induksjon av p53 (fig. 9D).
Dermed p53 og Klf4 sammen på kontroll av Notch1 gentranskripsjon ved første trinn av PolII rekruttering, med p53 induksjon oppstår gjennom en egen mekanisme fra Klf4 /sp3 undertrykkelse.
Diskusjoner
