Abstract
Bakgrunn
metastaser er en prosess der kreftceller lære å danne satellitt svulster i fjerne organer og representerer den viktigste årsaken til død hos pasienter med solide svulster. NSCLC er den mest dødelige kreft hos mennesker på grunn av sin høye frekvensen av metastaser.
metodikk /hovedfunnene
Mangel på en passende dyremodell har så langt hindret analyse av metastatisk progresjon. Vi har undersøkt c-MYC for sin evne til å indusere metastase i et C-RAF-drevet musemodell for ikke-småcellet lungekreft. c-MYC alene indusert frank tumorvekst først etter lang ventetid på hvilke tids sekundære mutasjoner i K-Ras eller LKB1 ble oppdaget minner om menneskelig NSCLC. Kombinasjon med C-RAF førte til umiddelbar akselerasjon av tumorvekst, konvertering til papillær epitelceller og angiogen bryter induksjon. Videre tillegg av c-MYC var tilstrekkelig til å indusere macrometastasis i lever og lymfeknuter med kort ventetid i forbindelse med avstamning bryter hendelser. Dermed har vi generert den første betinget modell for metastasering av NSCLC og identifisert et gen, c-MYC som er i stand til å organisere alle trinnene i denne prosessen.
Konklusjoner /Betydning
Potensielle markører for deteksjon av metastaser ble identifisert og validert for diagnostisering av menneskelige biopsier. Disse markørene kan representere mål for fremtidig terapeutisk intervensjon som de inneholder gener som Gata4 som er eksklusivt uttrykk under lunge utvikling
Citation. Rapp UR, Korn C, Ceteci F, Karreman C, Luetkenhaus K, Serafin V, et al. (2009) Myc Er en metastaser Gene for ikke-småcellet lungekreft. PLoS ONE 4 (6): e6029. doi: 10,1371 /journal.pone.0006029
Redaktør: Syed A. Aziz, Health Canada, Canada
mottatt: 29 april 2009; Godkjent: 25 mai 2009; Publisert: 24 juni 2009
Copyright: © 2009 Rapp et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av Deutsche Krebshilfe – Mildred Scheel Foundation (tilskudd 106 253) og ved DFG (tilskudd TR17). Emanuele Zanucco ble støttet av en bevilgning på den tyske Excellence Initiative til Graduate School of Life Sciences, University of Würzburg. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
metastaser er en kompleks multistep prosess der cellene i den primære svulsten blir i stand til å gå inn og forlate blodkar, bosette seg i fjerne områder, og til slutt vokse til makroskopiske sekundære svulster [1]. Det er generelt antatt at metastatisk konvertering er en mutasjon drevet prosess. Et antall gener og genprodukter har blitt identifisert som positivt eller negativt påvirke sannsynligheten for etablerte humane tumorcellelinjer for å metastasere [2], [3], [4]. Genprodukter omfatter vekstfaktor-reseptorer og elementer av deres intracellulære signaloverførings kaskader. Regulatorer av celle polaritet representerer en annen klasse av gener som kan fremme metastase [5], [6]. Ved bruk av mus lungekreft cellelinje, har Lewis lungekarsinom (LLC), en tredje kategori av metastase regulatorer nylig blitt beskrevet som understreket betydningen av betennelse som en pådriver [7]. Videre kandidat metastase-induserende eller -suppressing gener har også gener som koder for mikro RNA som regulerer sett av gener assosiert med spredning, invasjon eller migrasjon [8], [9].
Mens arbeidet med humane tumorcellelinjer i mus har vært opplysende, mangel på kunnskap om deres repertoar av kreftgener, så vel som manglende evne til å studere kinetikken til spontan tumorprogresjon i disse modellene begrense deres nytte. Vi har derfor etablert en musemodell for human ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) hvori premaligne adenom induseres ved en
RAF
transgenet spesifikt uttrykt i lunge alveolar type II epitelceller [10]. NSCLC er den hyppigste menneskelig lungekreft og den viktigste årsaken til død av kreft hos mennesker. Generering av sammensatte mus som bærer i tillegg til
RAF
andre transgener som koder for proteiner som modulerer signalveier ofte endres i human NSCLC tillater oss å løse to viktige trinn i prosessen med metastase, induksjon av den angiogene bryter og progresjon til micrometastasis forbundet med omprogrammering av tarmvelger gener [11]. β-catenin ble identifisert som den kritiske bryteren indus for begge trinn og også fremmet invasiv vekst [11].
Som 50% av menneskelig NSCLC bære mutasjoner i gener som koder aktivatorer av den mitogen kaskade (RAS-RAF- MEK-ERK) [12] og dette kaskade er kjent for å indusere en target gen av ß-catenin, c-MYC [13], bestemte vi oss for å direkte undersøke muligheten for c-MYC å fremme tumorprogresjon hos våre RAF-drevet murine kreft modell lunge. Videre MYC var en kandidat fordi det var kjent for å påvirke omprogrammering i tumorer basert på våre tidligere funn av RAF /MYC samarbeid i murine hematopoetiske system [14], [15]. Hos mennesker, ble amplifisering og rearrangementer av myc-gener finnes i en brøkdel av NSCLC [16]. Flere grupper har begynt å vurdere c-MYC i musemodeller av NSCLC. Endogen c-MYC er involvert i ikke metastatisk K-Ras-indusert NSCLC som ble vist ved anvendelse av et dominant negativt c-MYC-mutant [17]. Induserbar ekspresjon eller funksjon av transgene c-MYC demonstrert samarbeid med mutant K-Ras i tumorprogresjon i varierende grad [18], [19], men ingen modell ga opphav til metastaser. Her viser vi at konstitutiv eller induserbar ekspresjon av c-myc i tillegg til C-RAF i type II celler som er tilstrekkelig for å indusere hurtig metastasering til leveren og lymfeknuter. Kombinere c-myc og C-RAF transgener forårsaket utseendet på en fenotypisk bryter fra cuboidal til Alveolar papillær /søyle epitelceller (APECs) som er de raskest voksende kreftceller og også dominerer i levermetastaser. Videre c-MYC induserer produksjon av VEGF av tumorceller som fører til svulsten vaskularisering med uvanlige fartøy som er mosaikk inneholder PECAM-1 positive og PGP 9.5 positive endotelceller. PGP 9.5 var tidligere kjent som en markør for umodne nevroendokrine celler [20]. Metastatisk konvertering av c-MYC kan rekonstrueres i cellekultur ved hjelp av ikke-metastatisk A-549 NSCLC celler og infeksjon med en MYC transduseretrovirus.
Resultater
c-MYC samarbeider med C- RAF i forårsaker kreft dødsfall
for å teste om C-RAF og c-MYC samarbeide i transformasjon av lunge epithelial type II celler in vivo, ble SPC-C-RAF BXB mus krysset med SPC-c-MYC transgene mus. Observasjon i en periode på ≥2 år demonstrert akselerert død i forbindelse (SPC-C-RAF Xb /SPC-c-MYC) mus (figur 1A), selv om graden av akselerasjon var mindre enn tidligere har sett i det hematopoetiske system med MYC /RAF retrovirus [21]. Likevel sammensatte mus hadde en median ventetid som vesentlig forskjellig fra enkelt SPC-c-MYC transgene mus ved log-rank-analyse. Histologisk undersøkelse ved ulike tidspunkt avslørt at enkeltgene mus skilte seg i svulst overlevelse. Mens SPC-C-RAF BXB eller sammensatte mus var jevnt svulst positive ved to ukers alder, SPC-c-myc enkle transgene mus utviklet svulster sent og med ufullstendig pene indikerer at c-MYC ikke er hastighetsbegrensende for spredning av type II celler og /eller at det responsive celler elimineres ved apoptose (figur 1B).
(A) Kaplan-Meier-plott for SPC-C-RAF Xb (n = 24), SPC-c-MYC (n = 52 ), forbindelse (n = 35) og villtype (n = 28) littermate kontrollmus. Log-rank analyse for prosent overlevelse for sammensatte mus vs SPC-C-RAF BXB = p 0,05; SPC-C-RAF BXB vs SPC-c-MYC = p 0,0001; sammensatte mus vs SPC-c-MYC = p 0,0001. n: antall dyr. (B) Tumor forekomst i SPC-C-RAF Xb (n = 51), SPC-c-MYC (n = 30), forbindelse mus (n = 109) og villtype-kull kontrollmus (n = 58). Log-rank analyse for svulst overlevelse for SPC-C-RAF BXB vs SPC-c-MYC = p 0,0001; sammensatte mus vs SPC-c-MYC = p 0,0001; villtype vs SPC-c-MYC = p 0,0001. n: antall dyr. (C) Kinetikk av tumorprogresjon. Representative lungetumorsnitt farget med hematoksylin og eosin (H E). Den gule boksen og pilene streker cuboidal celle adenom (innfelt) i SPC-C-RAF BXB mus; den røde boksen og pilene indikerer pleomorphic celler (innfelt) i SPC-c-myc mus og de hvite boksene viser et søyle celle adenom (innfelt) i sammensatte mus. For evaluering av invasivitet ved tumor-stroma grensesnitt, blir eske områdene av det tredje panel forstørret i bunnfeltet. Genotyper og alder på mus som angitt. Isolerte små tumorcelleklynger rundt hoved svulsten ble markert med røde piler. Skala: 100 mikrometer. (D, E) H .. 70% av trinn II og IIIA tumorer [32] i vår NSCLC modell, hoveddelen av tumorceller som er negative for dette deubiquitinating enzymet i alle faser uavhengig av genotyper (data ikke vist) i stedet farging synes å markere fartøy i de primære svulster i SPC-c-MYC enkelt transgene og sammensatte mus (sammenlign figur S6D). Faktisk co-farging av tumorsnitt med PGP 9.5 og PECAM-en viste colocalisation av disse markørene i samme fartøy (Figur S6E). For å undersøke om PGP 9.5 er en markør for patologisk angiogenese, vi også farget villtype lunge seksjoner hvor farging ble funnet utelukkende i store fartøy, men ikke i kapillærene (figur S6E) i tråd med en fersk publikasjon viser uttrykk for PGP 9.5 i menneskelig carotis [33]. Våre funn er den første rapporten om forekomsten av slike endotelceller i svulsten blodkar.
angiogene bryter ble antagelig ikke ledsaget av typiske epitel mesenchymale overgang (EMT) på tumor kantene som vi ikke påvise celler dobbelt positive for pro SP-C og vimentin eller pro SP-C og N-cadherin (figur S8B). Videre E-cadherin veikryssene columnar celler i svulsten forble intakt (figur S8A). Konsekvent vi ikke observere invasive fronter i papillærtumorer (figur 1C). I stedet isolerte grupper av kreftceller ble funnet i nærheten av de primære svulster som minner om kollektiv migrasjon [34] (figur 1C).
Lange ventetid svulster i SPC-c-myc mus er positivt for
K -Ras
eller
LKB1
mutasjoner
som kinetikken av tumorutvikling ble forsinket i SPC-c-myc mus sammenlignet med SPC-C-RAF BXB eller sammensatte mus og antall sene svulster per lunge var lavere (figur 3A) vi søkte på videregående mutasjoner. Mot dette målet, ble et panel av gener (Tekst S1) som ofte endres i menneskelig NSCLC undersøkt i en tilfeldig samling av svulster fra ti mus som førte til identifisering av hyppige punktmutasjoner i
K-Ras Hotell og
LKB1
gener (Figur 3B). De fleste
K-Ras
mutasjoner var i ekson 1 og var heterozygote. Det var ett tilfelle av en ekson 2 mutasjon (figur 5B) og i tre tilfeller ingen mutasjoner ble funnet i
K-Ras
eller andre gener i panelet unntatt
LKB1 plakater (Figur 3B) . Faktisk mutasjoner i exon 6 av denne tumor suppressor som er mutert i 34% av human NSCLC [35] ble funnet i hver av tre
K-Ras
negative SPC-c-myc lungesvulster (figur 3B). Bare i ett tilfelle var
LKB1
– og
K-Ras Anmeldelser – mutasjoner funnet å eksistere. I dette eksempel ble det observert en forskjellig mutasjon fra
LKB1
som var til stede på begge allelene (figur 3B). I alle andre tilfeller,
K-Ras
mutasjoner eller tilstedeværelse av onkogene C-RAF var gjensidig utelukkende med
LKB1
mutasjon (figur 3B). Dette funnet kan tyde på at K-Ras /C-RAF signalering i type II celler kan normalt føre til inaktivering av tumor suppressor. Et lignende forhold ble funnet mellom
K-Ras
mutasjoner og tilstedeværelse av onkogene C-RAF, i samsvar med gjensidig utelukkende mønster av
RAF Hotell og
RAS
mutasjoner i humane tumorer [36] [37] (figur 3B).
(A) Tumor forekomst per lunge i SPC-c-myc-mus som en funksjon av alder. Animal tallene er 17 for to måneder, 10 for 6 til 10,5 måneder og 15 for 13-17 måneder. Hvert symbol representerer en individuell lunge. Merk at koordinere er foci /cm
2 i motsetning til mm
2 i figur 2. (B) Forekomst av
K-Ras Hotell og
LKB1
mutasjoner i primær lunge svulster. 10 tilfeldig plukket kreft positive mus ble undersøkt for et panel av kandidatgener (
EGFR
,
K-Ras
,
B-RAF
,
C-RAF
,
p53
,
PI3K
,
PTEN
,
Akt Hotell og
LKB1
). Vist her er data for
K-Ras Hotell og
LKB1
, bare gener av panelet der mutasjoner ble funnet. Zygosity er som angitt. Individuelle mus er oppført etter ID-nummer for å legge til rette for sammenligning mellom bordene.
Myc er tilstrekkelig til å indusere metastase
Som vi tidligere har sett progresjon til micrometastasis i SPC-C-RAF BXB mus der vi provosert angiogenese ved ablasjon av E-cadherin, undersøkte vi mus for metastaser i ulike aldre. Overrask flere makroskopiske lever- (figur 4A og 4B) og lymfe node- metastaser (Figur 4C) ble observert så tidlig som ti måneders alder i forbindelse (SPC-C-RAF BXB /SPC-c-MYC) og SPC-c- mYC enkelt trasngenic dyr. Sammensatte mus utviklet metastaser vesentlig tidligere, ved høyere forekomst enn SPC-c-MYC enkelt transgene mus (figur 5A). Mens det i lymfeknuter makro- og mikrometastaser ble observert, ble bare makrometastaser i lever. Lymfeknute og levermetastaser var uavhengige hendelser som var makro- og mikrometastaser som tyder på at metastase initiere celler (MIC) kan variere for hver kategori (figur 5A). Foruten SPC-c-myc enkelt transgene mus, DOX induserbar ekspresjon av c-MYC som hurtig gir opphav til papillær lungesvulster på C-RAF BXB bakgrunnen (figur S4) ble kontrollert for generering av metastasering. Disse musene utviklet lungesvulster (fig S9A) og levermetastaser (fig S9C og 9D) består av søyleceller. I samsvar med hyppigheten av metastase i konstitutive mus, i en kohort av 10 induserbare sammensatte mus som ble indusert 11-12 måneder, en mus utviklet makroskopisk leveren metastastasis og en andre dyr var positiv for mikrometastaser i en regional lymfeknute (figur S9B) . En kohort av alder-matchet kontrollgruppe (ikke-indusert) mus som var 14-17 måneder gamle ikke vise metastase (data ikke vist). I likhet med konstitutive mus, seksjoner fra levermetastaser av induserbare sammensatte mus (Spc-C-RAF BXB /SPC-rtTA- /tet-O-c-MYC) var positive for pro SP-C og pan-cytokeratin (figur S9E og S9F). I motsetning til konstituerende mus, levermetastaser i induserbare sammensatte mus provosert en uttalt stromal svar som skiller svulstvev fra normal leveren (figur S9D). Spesielt i denne stroma rike grenseområdet isolerte klynger av kreftceller som var positive for pan-Cytokeratin eller pro SP-C var tilstede (figur S9E og S9F) i samsvar med invasjon av kollektive migrasjon [34]. Ved undersøkelse av den mutasjons status av K-Ras, ble en exon 1mutation som finnes i primærlungesvulster og tilsvarende levermetastaser (data ikke vist).
(A) Kontroll av levermetastaser (venstre) fra en SPC- c-MYC enkelt transgene mus. En normal leveren (til høyre) fra et ikke-metastatisk SPC-C-RAF BXB enkelt transgene mus. (B) H E farging av parafin innebygd leversnitt fra SPC-c-MYC og sammensatte mus. Representative deler av papillær og cystisk metastaser vises. Boxed områdene er vist ved høyere forstørrelse. Aldre og genotyper som angitt. Skala: 100 mikrometer. (C) Farging av lever og lymfeknutemetastaser fra sammensatte mus for markører som angitt. Metastaser fra SPC-c-myc mus ble utvisket sammenlignet med sammensatte mus for samme markører. Sirklet områder i lymfeknuter markere metastaser (M). Skala: 100 mikrometer
(A) Oppsummering av metastase mønster for SPC-c-myc enkelt transgene og sammensatte mus.. Dyr er oppført individuelt ved ID-nummer og gruppert etter genotype. Median debutalder av metastaser mellom gruppene er signifikant (p = 0,03). (B) Fravær av
K-Ras
mutasjon i macrometastasis av RAF /MYC og RAS /MYC lungesvulster. n.m: ingen metastaser. n.d .: ikke gjort. Δ: Sletting. -:. Negative
Hvis akutt uttrykk for c-MYC er tilstrekkelig for metastatisk konvertering deretter innføring i ikke-metastatisk NSCLC celler skal generere metastaserende kloner. For å teste denne muligheten vi ansatt menneskelige A-549 celler. En høy c-MYC uttrykk A-549 celle-klon (A-549 J5-1) (figur 6A) ble injisert subkutant i immunodeficient Rag1
– /- mus. Forekomsten (figur 6B) og frekvensen av lokal tumorvekst (figur 6C) ble økt med MYC ekspresjon i en slik grad at dyrene måtte ofres etter seks uker. På tross av dette begrensede tidsrom av forsøket, ble metastasering til lunge og lever observert ved lav frekvens (figur 6D og 6E). Analyse av lunge seksjoner fra A-549 J5-1 celler inokulert mus viste uttrykk for kylling MYC i lungemetastaser bekrefte opprinnelsen til celler (figur S10). De kombinerte data etablere c-MYC som en sterk metastase indusering av genet for NSCLC.
(A) Immunofluorescens farging av A-549-celler infisert med kylling v-myc uttrykkende J5 virus viser MYC (rød) ekspresjon. Dapi markerer kjerner. Skala: 50 mikrometer. (B) Tumor forekomst av kontroll og MYC uttrykker A-549-celler seks uker etter subkutan injeksjon. Animal tall (n) er som angitt. (C) Overvåking av tumorvekst i løpet av seks uker periode. Svulster ble målt ukentlig. MYC uttrykker cellene ga opphav til statistisk større svulster i Rag1
– /- mus. Verdier representerer SD av gjennomsnittet. *: P 0,05. n = 17 mus i hver gruppe. (D) Analyse av metastaser. Parafin innebygde deler av lungen, lymfeknute og levervev fra transplanterte mus ble screenet for metastase ved hjelp av cytokeratin-7 (CK-7) antistoff. For å demonstrere spesifisiteten av CK-7-ekspresjon i A-549-celler primære tumorer ble farget i fravær (negativ kontroll) eller i nærvær (positiv kontroll) av CK-7 antistoff. For hvert organ minst 3 seksjoner ble farget og nøye undersøkt i det minste av to personer. n = 17 mus i hver gruppe. Skala: 50 mikrometer. (E) Forekomst av metastasering. LN. Lymfeknute
Bruk av mutasjoner i primære svulster i SPC-c-MYC enkelt transgene mus for avstamning sporing av metastaser
Oppdagelsen av hyppige
K-Ras Hotell og
LKB1
mutasjoner i lungesvulster primært av SPC-c-MYC enkelt transgene mus foreslo at vi kan være i stand til å bruke mutasjon data for avstamning sporing. Vi undersøkte derfor DNA av lever- og lymfeknutemetastaser for mutasjoner som er tilstede i de primære svulster. Overraskende i tilfelle av
K-Ras mutasjoner,
fire av de fem tilfellene av c-myc tumormetastaser avledet som kan bli undersøkt på denne måten var negativ for mutasjonen som var det ene tilfellet av en forbindelse som mus hadde en
K-Ras
ekson en mutasjon i primærtumor og metastaser til lymfeknuter (figur 5B). Men en av de fem tilfeller av
K-Ras
positiv c-MYC svulst avledet metastaser var positiv for mutant
K-Ras
. Mutasjonen var identisk med det i lungen tumor. Denne musen hadde flere organmetastaser som inkluderte i tillegg til lever, nyre, pankreas og hjerne. Videre metastaser på forskjellige steder felles uttrykk for lunge markører. Figur S11 viser at spredte pro SP-C-positive celler er til stede i fjerne metastaser i lever, bukspyttkjertel, hjerne og nyre. I tillegg i nyrene, ble Clara celle sekretorisk protein (ccsp) positive tumorceller påvises (figur S11). I ett tilfelle av en
LKB1
-mutant lungetumor som ga opphav til levermetastase, metastasen scoret negativt for mutasjonen. Det faktum at mutasjoner stede i de primære lungesvulster er stort sett fraværende i sine levermetastaser tyder på at metastase er en tidlig hendelse.
Histopatologi av metastaser fra SPC-c-myc enkelt transgene og sammensatte mus
på histopatologiske undersøkelse metastaser fra begge genotyper ble utvisket med unntak av deres overflod (Figur 4A og figur 5A). I begge tilfeller finner vi to typer metastaser i lever og lymfeknuter, papillær og blandet cystisk-papillær (figur 4B). Vanligvis begge former sameksistere i samme målorgan (figur S12). Hvorvidt disse to formene kan interkonverteres eller om cyster er tidlig forløper former for blandet cystisk-papillær metastaser er foreløpig ukjent.
