Abstract
Tykktarmskreft er en av de mest vanlige typer kreft med over femti prosent av pasienter på et avansert stadium. Retinsyre er en metabolitt av vitamin A og er viktig for normal cellevekst og avvikende retinsyre metabolisme er innblandet i tumorgenesen. Denne studien har profilert uttrykket av retinsyre enzymer ved hjelp av et godt karakterisert kolorektal kreft vev microarray som inneholder 650 primære kolorektal kreft, 285 lymfeknutemetastaser og 50 normale colonic slimhinneprøver. Immunhistokjemi ble utført på vevet microarray bruker monoklonale antistoffer som vi har utviklet til retinsyre enzymer CYP26A1, CYP26B1, CYP26C1 og lecithin retinol acyl transferase (LRAT) ved hjelp av en semi-kvantitativ scoring ordning for å vurdere uttrykk. Moderat eller sterk ekspresjon av CYP26A1was observert hos 32,5% av kreft sammenlignet med 10% av de normale kolonepitelet prøver (p 0,001). CYP26B1 var moderat eller sterkt uttrykt i 25,2% av svulster og ble betydelig mindre uttrykt i normal kolonepitelet (p 0,001). CYP26C1 ble ikke uttrykt i enhver prøve. LRAT viste også signifikant økt uttrykk i grunnskolen kolorektal kreft sammenlignet med normal kolonepitelet (p 0,001). Sterk CYP26B1 uttrykk var signifikant assosiert med dårlig prognose (HR = 1,239, 95% KI = 1,104 til 1,390, χ
2 = 15,063, p = 0,002). Sterk LRAT var også assosiert med dårligere utfall (HR = 1,321, 95% KI = 1,034 til 1,688, χ
2 = 5,039, p = 0,025). I mismatch reparasjon dyktige svulster sterk CYP26B1 (HR = 1,330, 95% KI = 1,173 til 1,509, χ
2 = 21,493, p 0,001) og sterk LRAT (HR = 1,464, 95% KI = 1,110 til 1,930, χ
2 = 7,425, p = 0,006) ble også assosiert med dårligere prognose. Denne studien har vist at retinsyre enzymer CYP26A1 er CYP26B1 og LRAT betydelig overuttrykt i tykk- og endetarmskreft og som CYP26B1 og LRAT er signifikant assosiert med prognose både i total kohorten og i de tumorer som er mismatch reparasjon dyktig. CYP26B1 var uavhengig prognostisk i en multivariat modell både i hele pasient kohorten (HR = 1,177, 95% KI = 1,020 til 1,216, p = 0,026) og i mismatch reparasjon dyktige svulster (HR = 1,255, 95% KI = 1,073 til 1,467, p = 0,004)
Citation. Brown GT, Cash BG, Blihoghe D, Johansson P, Alnabulsi A, Murray GI (2014) The Expression og prognostisk betydning av retinsyre enzymer i tykktarmskreft. PLoS ONE 9 (3): e90776. doi: 10,1371 /journal.pone.0090776
Redaktør: Natasha Kyprianou, University of Kentucky College of Medicine, USA
mottatt: 21 november 2013; Godkjent: 04.02.2014; Publisert: 07.03.2014
Copyright: © 2014 Brown et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Studien ble finansiert av University of Aberdeen Development Trust (https://www.abdn.ac.uk/giving/) og omfatter (https://www.encompass-scotland.co.uk/). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser. Graeme Murray er en vitenskapelig rådgiver for virveldyr Antistoffer, som bidro til denne forskningen. Ingen økonomisk godtgjørelse har vært eller er mottatt for denne stillingen heller ikke han ingen aksjer i dette selskapet. Beatriz Kontanter og Ayham Alnabulsi er ansatte i virveldyr antistoffer. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
Tykktarmskreft er en av de vanligste kreftformer som har fem års overlevelse er fortsatt på om lag femti prosent til tross for innføringen av tarmkreft screening [1]. Mens den molekylære patogenesen av denne type tumor er i økende grad forstått og definert spesielt de tidlige stadier av tykktarmskreftutvikling hvor de molekylære endringer er avgrenset med en høy grad av detalj [2] – [4]. Men det er fortsatt et klart behov for å identifisere biomarkører for kolorektal kreft, inkludert prognostiske, prediktive og diagnostiske markører [5] -. [15]
Retinsyre (RA) er en metabolitt av vitamin A (retinol), som utfører viktige funksjoner i normal cellevekst og differensiering og dysregulerte retinsyre metabolismen har blitt implisert i tumorgenesen [16], [17]. Retinoider, et begrep som brukes for å beskrive naturlige eller syntetiske forbindelser som viser en strukturell eller funksjonell likhet med retinol, har fremtredende roller i cellevekst, differensiering og apoptose [16]. Den mest aktive formen av RA, all-trans retinsyre (Atrå), har en regulerende funksjon genet og spiller en avgjørende rolle i utviklingen av flere organer. 4-okso-9-cis-retinoinsyre (9-cis-RA) og 4-okso-13-cis-retinsyre (13-cis-RA) er stereo-isomerer av ATRA og spiller også en viktig rolle i RA signale . Noen retinoider har anti-kreft egenskaper som allerede er blitt utnyttet til behandling av flere typer kreft, inkludert livmorhalskreft og promyelocytic leukemi.
Den intracellulære prosessering av retinol innebærer lecithin retinol acyl transferase (LRAT) som er ansvarlig for forestringen av retinol [18], [19], mens hydroksylering av retinol utføres av retinsyre hydroksylaser (CYP26A1, CYP26B1, CYP26C1) som alle er medlemmer av cytokrom P450 (P450) familien av enzymer [20], [21] .
de tre medlemmene av CYP26 familien er alle i stand til å metabolisere Atrå til mindre biologisk aktive 4-hydroxy-4-oxo, og 18-hydroxy-RA mellom [22] – [24], av som 4-okso-RA er den mest vanlige metabolitten [16]. Selv om tidligere studier har undersøkt P450 uttrykk i tumorer og vist svulst selektiv uttrykk for individuelle P450s mest kjent CYP1B1 [25] den CYP26 familien P450s har fått litt før oppmerksomhet i forhold til uttrykk i tumorer.
Denne studien har profilert uttrykk for retinsyre enzymer CYP26A1, CYP26B1, CYP26C1 og LRAT bruke en godt karakterisert kolorektal kreft vev microarray med monoklonale antistoffer mot CYP26A1 henholdsvis CYP26B1, CYP26C1 og LRAT, som har blitt utviklet og preget for sin bruk av immunhistokjemi på formalin fast voks innebygd vev.
Materialer og metoder
Monoklonale antistoffer
Monoklonale antistoffer mot CYP26A1, CYP26B1, CYP26C1 og LRAT ble utviklet i samarbeid med Vertebrate antistoffer Ltd (Aberdeen, UK ) ved hjelp av syntetiske peptider. Peptider innenfor de antatte proteinsekvenser ble identifisert som var antigene, eksponert på overflaten og er unik for målproteinet. Aminosyresekvensene og plassering på proteinene er angitt i tabell 1. Peptidene ble oppnådd fra Almac Sciences Ltd, (Edinburgh, UK) og konjugert individuelt til ovalbumin for immuniseringene og til bovint serumalbumin for ELISA-testene [26]. Den immunisering av mus, ble produksjonen av hybridomaceller og ELISA-screening utført i det vesentlige som tidligere beskrevet [26], bortsett fra at antigenet ble gitt subkutant. De hybridomer ble klonet ved begrensende fortynning til en enkelt ELISA positiv koloni ble dyrket i en 96-brønners plate. Individuelle cellelinjer ble deretter dyrket ved høy celletetthet for fremstilling av antistoffet lager som ble anvendt senere for deres karakterisering ved immunoblotting og immunhistokjemi.
Immunoblotting
helcellelysater fra cellene (humane embryonale nyreceller) overekspresjon CYP26A1, CYP26B1, CYP26C1 og LRAT ble brukt som positive kontroller for immunoblotting mens lysatene fra celler som inneholder vektoren bare ble brukt som negative kontroller. Den CYP26A1 cellelysat og dens kontroll ble ervervet fra Abnova (Taipei, Taiwan) mens CYP26B1, ble CYP26C1 og LRAT inneholdende cellelysatene og deres tilsvarende kontroller oppnådd fra (Novus Biologicals, Cambridge, UK). Cellelysater (5 mikrogram protein /kjørefelt) ble løst ved elektroforese på NuPAGE 4-12% bis-Tris gels (Fisher Scientific, Loughborough, UK). Etter proteinoverføring ble membranene blokkert i 1 time ved romtemperatur i fosfatbufret saltvann-Tween-20 (PBST) inneholdende 1% (vekt /volum) skummet melkepulver. Membraner ble inkubert over natten ved 4 ° C med CYP26A1 (1/5 fortynning), CYP26B1 (1/2 fortynning), CYP26C1 (1/2 fortynning) eller LRAT (1/2 fortynning) monoklonale antistoffer fortynnet i PBST. Membranene ble vasket (6 ganger) i 1 time i 1% skummet melk. Membranene ble deretter probet i 1 time med et sekundært antistoff konjugert pepperrot-peroksydase-konjugert anti-mus IgG (1/2000, Sigma-Aldrich, Dorset, UK). Membraner ble deretter vasket (6 ganger) i 1 time i 1% skummet melk og proteinbånd visualisert ved hjelp av forbedret chemiluminescence deteksjonssystem (Fisher Scientific).
Tykktarmskreft vevet microarray
Alle tilfeller av tykktarmskreft inkludert i denne studien ble retrospektivt valgt fra Aberdeen kolorektal svulst bank (nå innlemmet i og governanced ved NHS Grampian Biorepository, Aberdeen, UK). Totalt ble tumorprøver fra 650 pasienter involvert i denne studien, i hvert tilfelle, hadde diagnosen primær kolorektal kreft er gjort, og pasientene hadde gjennomgått elektiv kirurgi for primær kolorektal kreft, i Aberdeen, mellom 1994 og 2009. Ingen av pasientene hadde fått noen form for pre-operativ kjemoterapi eller strålebehandling. Spesielt pasienter med endetarmskreft som hadde fått neoadjuvant behandling inklusive kort kurs strålebehandling ble ekskludert. Dataene for pasientene og deres svulster som inngår i denne studien er beskrevet i tabell S1. Survival informasjon (totaldødelighet) var tilgjengelig for alle pasienter og ved å sensurere pasientdata på utfallet det hadde vært 309 (47,5%) dødsfall. Gjennomsnittlig pasient overlevelse var 115 måneder (95% KI 108-123 måneder).
Svulstene ble rapportert i henhold til The Royal College of Patologer britiske retningslinjer for histopatologisk rapportering av kolorektal kreft reseksjon prøver og som inkorporerer veiledning fra versjon 5 av TNM staging system [27]. Histopatologisk behandlingen av kolorektal kreft eksisjons- prøver er beskrevet i Materialer og metoder S1.
A colorectal cancer vev mikroarray ble konstruert som inneholdt normale tykktarm slimhinneprøver (n = 50), primær (n = 650) og metastatisk kolorektal kreft prøver (n = 285) som tidligere beskrevet [28] – [30]. Detaljer om bygging av vevet microarray er gitt i materialer og metoder S1.
Immunohistochemistry
Immunhistokjemi for hvert antistoff ble utført med biotin frie Dako Envision system (Dako, Ely, UK) ved hjelp av en Dako Autostainer (Dako) som tidligere beskrevet [28] – [30]. Detaljer om immunhistokjemi er gitt i Materialer og metoder S1. Seksjonene ble evaluert ved mikroskopisk undersøkelse lys og intensiteten av immunfarging i hver kjerne vurderes uavhengig av to forskere (GTB og GIM) ved hjelp av et poengsystem som tidligere er beskrevet for vurdering av protein-ekspresjon i tumor mikromatriser [28] – [30]. Intensiteten i farging i hver kjerne ble scoret som negativ, svak, moderat eller sterk. Under cellulær lokalisering (nuclear, cytoplasma eller membran) av farging ble også registrert. Variasjon i farging mellom kjerner i hver sak ble ikke identifisert. Eventuelle avvik i immunhistokjemiske vurdering av vev kjerner mellom de to observatører ble løst ved samtidig mikroskopisk revurdering.
Vurdering av mismatch reparasjon status
Mismatch reparasjon status (MMR) ble vurdert ved immunhistokjemi ved hjelp av antistoffer mot MLH1 og MSH2 som tidligere beskrevet [28], [30]. MMR status ble registrert som enten dyktig eller defekt.
statistikker
Statistisk analyse av data, inkludert Mann-Whitney U test, Wilcoxon signert rank test, chi-squared test, Kaplan-Meier overlevelses analyse, log-rank test og Cox multi-varians analyse (variabler inn som kategoriske variabler) herunder beregning av hazard ratio og 95% konfigurasjons ble utført ved hjelp av IBM SPSS versjon 21 for Windows 7 ™ (IBM, Portsmouth, UK). Den log rank test ble benyttet for å bestemme overlevelses forskjeller mellom de enkelte grupper. En sannsynlighetsverdi av p≤0.05 ble ansett som signifikant. Påvirkningen av forskjellige loddepunkter i forhold til overlevelse ble undersøkt av dichotomizing intensiteten poengsum for hver markør. Gruppene som ble analysert var negativ farging versus noen positiv farging, negative og svake flekker versus moderat og sterk farging og negative, svak og moderat farging versus sterk farging.
Etikk
Prosjektet hadde godkjenning av The North of Scotland forskningsetisk komité (ref. nr. 08 /S0801 /81 og 11 /NS /0015). Den forskningsetisk komité ikke krever skriftlig pasienten samtykke til den retrospektive vevsprøver som var inkludert i kolorektal kreft vev microarray.
Resultater
Monoklonale antistoffer
spesifisitet monoklonale antistoffer mot CYP26A1, CYP26B1, CYP26C1 og LRAT ble bestemt ved ELISA under anvendelse av immunogene peptider og også ved immunblotting (figur 1) ved bruk av helcellelysater fra celler som overuttrykker hvert protein. Et bånd som vandret ved den forventede molekylvekt ble observert for hvert antistoff i et lysat fremstilt fra celler som overuttrykker det aktuelle proteinet, mens ingen bånd ble detektert med den tilsvarende kontroll lysatet.
venstre veibane av hver plate inneholder kontrollcellen lysat mens den høyre fil av hver plate inneholder lysat fremstilt fra celler som overuttrykker den aktuelle protein. 5 mikrogram protein ble lastet per brønn.
Immunohistochemistry
CYP26A1, CYP26B1 og LRAT alle viste immunoreaktivitets i både normal kolonepitelet og primære og metastatisk kolorektalcancer og i hvert tilfelle farging var lokalisert til cytoplasmaet av celler (figur 2). Det var ingen nukleær eller celleoverflatemembran imunoreactivity. I normal kolonepitelet farging ble hovedsakelig er lokalisert overflate epitelceller og ingen intratumour heterogenitet ble observert i enten primære eller metastatisk kolorektal tumorer. CYP26C1 viste ingen farging i noen av vevsprøver undersøkt.
Intensiteten i farging var vesentlig høyere i primære kolorektal kreft sammenlignet med normal tarmslimhinnen for CYP26A1 (p = 0,002), CYP26B1 (p 0,001) (figur 3, tabell 2). Det var ingen forskjell i intensiteten av ekspresjon av enten CYP26A1 eller CYP26B1 mellom Dukes C kolorektal kreft, og deres korresponderende lymfeknutemetastase mens det for LRAT var det en signifikant reduksjon i immunreaktivitet i lymfeknutemetastaser sammenlignet med de tilsvarende primære tumorer (p 0,001 ) (figur 3 og tabell 2)
uttrykk for CYP26A1 var sterkt korrelert med både CYP26B1 uttrykk (χ
2 = 192,2, p. 0,001) og LRAT uttrykk (χ
2 = 89,54, p 0,001), mens CYP26B1 uttrykk også korrelert med uttrykk for LRAT (χ
2 = 144,88, p. 0,001)
Forholdet til klinisk-patologisk parametere
Sammenligninger av uttrykket av CYP26A1, CYP26B1 og LRAT og klinisk-patologisk parametere er oppsummert i tabell 3. CYP26B1 og LRAT begge viste signifikant sammenheng med tumorlokalisering, tumor (T) scenen, ekstramural venøs invasjon og generelle scenen. I kontrast, CYP26A1 viste bare et forhold med svulst området og viste ikke et forhold med noen av de andre klinisk-patologisk parametre som er undersøkt.
Survival analyse
Hele pasient kohort.
forholdet uttrykk for CYP26A1, CYP26B1 og LRAT med total overlevelse ble undersøkt ved hjelp av ulike loddepunkter (negativ v svak v moderat v sterke, negative v positiv, negativ /svak positiv v moderat /sterk og negativ /svak /moderat v sterk) av immunhistokjemiske scoring og er oppsummert i tabell 4 og figur 4.
A-D hele pasienten kohort. A. total overlevelse viser individuelle CYP26B1 kategorier. I B-D er vist innvirkningen av forskjellige snitt av punkter. E-H Mismatch reparere dyktig kohort. E. total overlevelse viser individuelle CYP26B1 kategorier. I F-H er vist påvirkning av ulike loddepunkter.
Det var en konsekvent og signifikant sammenheng mellom CYP26B1 uttrykk og utfall (figur 4). Vurderer hver CYP26B1 intensitet gruppe separat, økende intensitet av CYP26B1 immunoreaktivitets var assosiert med dårligere prognose (HR = 1,239, 95% KI = 1,104 til 1,390, χ
2 = 15,063, p = 0,002). For CYP26B1 negative tumorer (n = 242) var gjennomsnittlig overlevelse var 133 måneder (95% KI = 118-148 måneder), for CYP26B1 svak uttrykke svulster (n = 216) var gjennomsnittlig overlevelse var 106 måneder (95% KI = 95-116 måneder), for CYP26B1 moderat uttrykke tumorer (n = 106) var gjennomsnittlig overlevelse var 103 måneder (95% KI = 85-120 måneder) og for sterkt uttrykk for CYP26B1 tumorer (n = 58) var gjennomsnittlig overlevelse var 81 måneder (95% KI = 60-101 måneder).
Sammenligning CYP26B1 negative svulster med svulster som viste noen CYP26B1 immunoreaktivitets deretter dårligere overlevelse var assosiert med CYP26B1 uttrykk (HR = 1,352, 95% KI = 1,054 til 1,735, χ
2 = 5,707, p = 0,017). For CYP26B1 negative tumorer (n = 242) var gjennomsnittlig overlevelse var 133 måneder (95% KI = 118-148 måneder) mens for CYP26B1 positive tumorer (n = 380) var gjennomsnittlig overlevelse var 107 måneder (95% KI = 98-116 måneder ). Sammenligning CYP26B1 negative og svakt positive tumorer med CYP26B1 moderat og sterk uttrykker svulster viste at det var en svært signifikant sammenheng med overlevelse (HR = 1,465, 95% KI = 1,151 til 1,865, χ
2 = 9,832, p = 0,002). Bety overlevelse for de negative /svake tumorer (n = 458) var 125 måneder (95% KI = 115-135 måneder) mens bety overlevelse for moderat /sterk gruppe av tumorer (n = 164) ble 96 måneder (95% KI = 108-124 måneder). CYP26B1 negative /svake /moderate uttrykker svulster sammenlignet med CYP26B1 sterkt uttrykker svulster viste også en svært signifikant sammenheng med overlevelse (HR = 1,737, 95% KI = 1,248 til 2,418, χ
2 = 11,092, p = 0,001). Det betyr overlevelse for CYP26B1 negative /svak /moderat (n = 564) var 119 måneder (95% KI = 111-128 måneder) mens bety overlevelse for CYP26B1 sterke tumorer (n = 58) var 80 måneder (95% KI = 60-101 måneder).
For LRAT var det en signifikant sammenheng med overlevelse (HR = 1,321, 95% KI = 1,034 til 1,688, χ
2 = 5,039, p = 0,025) når immunhistokjemi intensitet ble dikotomiserte inn LRAT negative og svake saker (n = 239) versus LRAT moderate og sterke saker (n = 383) (figur 5). For LRAT negative og svake tilfeller bety overlevelse var 132 måneder (95% KI = 119-146 måneder) mens for LRAT moderate og sterke tilfeller bety overlevelse var 106 måneder (95% KI = 96-116 måneder). Det var ingen sammenheng mellom CYP26A1 og overlevelse i hele pasient kohorten.
A. Forholdet mellom LRAT og overlevelse i alle kolorektal kreft og B. Forholdet mellom LRAT og overlevelse i mismatch reparasjon dyktige svulster.
Den detaljerte forholdet mellom CYP26A1, CYP26B1 og LRAT uttrykk, patologiske parametere og total overlevelse er vist i tabell S2, S3, S4 og S5.
i multivariat analyse CYP26B1 forble uavhengig prognostisk (p = 0,026) mens det ikke var noen uavhengig prognostisk betydning av LRAT ekspresjon (tabell 5). Hvis multivariate analysemodell inneholder kun de variablene som vil være tilgjengelig fra en biopsi av tykktarmskreft (dvs. ingen informasjon om pT scenen, pN scenen og EMVI) så CYP26B1 er en betydelig uavhengig prognostisk markør (p = 0,017, Tabell S6)
MMR dyktig kohort.
i MMR dyktige svulster var det en konsekvent sammenheng mellom intensiteten av CYP26B1 uttrykk og total overlevelse (tabell 6, figur 4). Økende intensitet av CYP26B1 immunoreaktivitets var assosiert med dårligere prognose (HR = 1,330, 95% KI = 1,173 til 1,509, χ
2 = 21,493, p 0,001). For CYP26B1 negative tumorer (n = 200) var gjennomsnittlig overlevelse var 143 måneder (95% KI = 127-158 måneder), for CYP26B1 svake tumorer (n = 186) var gjennomsnittlig overlevelse var 106 måneder (95% KI = 94-116 måneder ), for CYP26B1 moderate tumorer (n = 87) var gjennomsnittlig overlevelse var 96 måneder (95% KI = 82-112 måneder) og for sterkt uttrykk for CYP26B1 tumorer (n = 49) var gjennomsnittlig overlevelse var 77 måneder (95% KI 56- 98 måneder).
Sammenligning CYP26B1 negative svulster med svulster som viste noen CYP26B1 immunoreaktivitets deretter dårligere overlevelse var assosiert med CYP26B1 uttrykk (HR = 1,604, 95% KI = 1,207 til 2,132, χ
2 = 10,796, p = 0,001). For CYP26B1 negative tumorer (n = 200) var gjennomsnittlig overlevelse var 143 måneder (95% KI = 127-158 måneder) mens for CYP26B1 positive tumorer (n = 322) var gjennomsnittlig overlevelse var 104 måneder (95% KI = 94-114 måneder ). Sammenligning CYP26B1 negative og svakt positive tumorer med CYP26B1 moderat og sterk uttrykker svulster viste en svært signifikant sammenheng med overlevelse (HR = 1,617, 95% KI = 1,242 til 2,105, χ
2 = 12,962, p 0,001). Gjennomsnittlig overlevelse for de negative /svake tumorer (n = 386) var 130 måneder (95% KI = 120-141 måneder) og bety overlevelse for moderat /sterk gruppe av svulster var 92 måneder (95% KI = 79-106 måneder ). CYP26B1 negative /svake /moderate uttrykker svulster sammenlignet med CYP26B1 sterkt uttrykker svulster viste også en svært signifikant sammenheng med overlevelse (HR = 1,948, 95% KI = 1,366 til 2,777, χ
2 = 14,149, p 0,001). Gjennomsnittlig overlevelse for CYP26B1 negative /svak /moderat (n = 473) var 123 måneder (95% KI = 113-132 måneder) og bety overlevelse for CYP26B1 sterkt uttrykker svulster ble 77 måneder (95% KI = 56-98 måneder).
For LRAT var det en signifikant sammenheng med overlevelse (HR = 1,464, 95% KI = 1,110 til 1,930, χ
2 = 7,425, p = 0,006) når immunhistokjemi intensitetspoeng ble dikotomiserte inn LRAT negative og svake saker (n = 198) versus LRAT moderate og sterke saker (n = 326) (figur 5). For LRAT negative og svake tilfeller bety overlevelse var 139 måneder (95% KI = 124-156 måneder) mens for LRAT moderate og sterke tilfeller bety overlevelse var 106 måneder (95% KI = 96-116 måneder). Det var ingen sammenheng mellom CYP26A1 og overlevelse i MMR dyktig pasient kohort.
I multivariat analyse CYP26B1 forble uavhengig prognostisk (p = 0,026), mens det var ingen uavhengig prognostisk betydning av LRAT uttrykk (tabell 7). Hvis multivariate analysemodell inneholder kun de variablene som vil være tilgjengelig fra en biopsi av tykktarmskreft (dvs. ingen informasjon om tumorstadium, nodal scenen og ekstra veggmaleri venøs invasjon) så CYP26B1 er en svært viktig uavhengig prognostisk markør (p = 0,001, Tabell S6)
det var ingen sammenheng med MMR defekte svulster med CYP26A1, CYP26B1 eller LRAT uttrykk og total overlevelse.
Diskusjoner
tykktarms~~POS=TRUNC kreft~~POS=HEADCOMP er en av de vanligste typer kreft hvis forekomst fortsetter å stige, og mens de molekylære hendelser som karakteriserer den tidlige fasen av kolorektal kreft utvikling er blitt beskrevet i detalj, er det likevel klart behov for å identifisere, karakterisere og validere biomarkører for kolorektal kreft [4] – [6] [12].
Denne undersøkelsen har definert uttrykket profil av retinsyre enzymer CYP26A1, CYP26B1 og CYP26C1 som er medlemmer av P450 familie av enzymer og LRAT i en stor kohort av godt karakteriserte kolorektal kreft. Det er også etablert den prognostiske betydningen av uttrykket av disse retinsyre enzymer
P450s er en stor gruppe av NADP avhengige hydroksylaser klassifisert i familier, under familier og enkeltmedlemmer [31] -. [34] . Det er to forskjellige funksjonelle grupper i P450s basert på deres substrat spesifisitet for enten xenobiotika eller endogene forbindelser. CYP1, CYP2 og CYP3 er de dominerende familiene som er involvert i metabolismen av xenobiotics mens andre familier fra CYP4 oppover er involvert i metabolismen av bestemte grupper av biologisk aktive endogene forbindelser inkludert eikosanoider, steroidhormoner, gallesyrer og vitaminer som vitamin A og D [ ,,,0],35] – [42]. De har flere transkripsjonen og post-transkripsjonsregulerende mekanismer [43]. De xenobiotiske metaboliserende former av P-450 har blitt omfattende studert i tumorer og mange individuelle medlemmer har blitt vist å være overuttrykt i spesifikke typer av tumorer spesielt CYP1B1 som har vist seg å ha økt ekspresjon i et bredt spekter av tumorer [25], [44 ] – [52]. Svulsten selektiv ekspresjon av P-450 har vært foreslått som et terapeutisk mål, spesielt for P450 mediert promedikament-aktivering [51] – [57]. De P450s involvert i endogen forbindelse metabolismen har generelt fått mye mindre studie i svulster med unntak av de P450s som er involvert i sex hormon (østrogen og testosteron) metabolisme i forhold til mål i bryst og prostata cancer henholdsvis [58] -. [60]
Strukturelt de P450s viser størst aminosyre mangfold ved deres C-termini som er den hydrofile komponent av proteinet i motsetning til den N-terminale ende, som er den mest lipofile komponenten av proteinet. Gitt den markerte C-terminale aminosyren variasjon og dets hydrofilitet bruken av peptider til C-terminalen av individuell P450 som immunogener for å produsere monoklonale antistoffer mot individuelle former av P-450 har vist seg i mange forskningsgrupper, inkludert vår egen å være en svært effektiv strategi å utvikle individuelle skjema spesifikke P450 monoklonale og polyklonale antistoffer [30], [61], [62].
i denne studien har vi produsert antistoffer som er spesifikke for de enkelte former av CYP26 familien nemlig CYP26A1, CYP26B1 og CYP26C1. Alle tre enzymene CYP26 Hydroksylering av retinsyre og den mest fullstendig karakterisert er CYP26A1 som er den dominerende form som er involvert i retinsyre hydroksylering. CYP26B1 og CYP26C1 er mer nylig identifisert medlemmer av CYP26 familien og er mindre godt karakterisert ved sammenligning med CYP26A1. CYP26C1 ser ut til å ha dominerende, men ikke nødvendigvis eksklusivt uttrykk i bestemte områder av hjernen [22], [23].
kolorektal kreft kan klassifiseres i henhold til deres mikro ustabilitet /MMR status og dette representerer en viktig vei for kolorektal kreftutvikling [63], [64]. I denne studien fant vi prognostisk betydning for CYP26B1 både hele pasienten kohort og i disse svulstene som ble definert som mikro intakt eller stabil. I motsetning de svulster som var MMR defekt viste ingen prognostisk betydning som tyder på at ulike reguleringsmekanismer kan være i drift i MMR dyktig og MMR defekte svulster.
CYP26 enzymer har blitt foreslått som anti-kreft narkotika mål [65 ] og økt uttrykk av CYP26A1 og CYP26B1 i kolorektal kreft vil foreslå at disse enzymene kan være relevante terapeutiske mål i denne type svulster. Flere serier av forbindelser basert på ulike strukturelle egenskaper har blitt syntetisert som hemmer CYP26 [66] – [69]. Disse forbindelser er meget selektive for CYP26 og viser høy inhibitorisk aktivitet (nanomolar potens) mot CYP26A1. Men den hemmende aktivitet av disse forbindelsene mot CYP26B1 og CYP26C1 har ennå ikke blitt evaluert. Epidemiologiske bevis har også foreslått målretting av retinoider og retinsyre trasé for chemoprevention av tykktarmskreft og økt uttrykk av CYP26A1 og CYP26B1 i tykktarmskreft skulle tilsi at målretting disse enzymene kan være en nyttig tilnærming [70] -. [72]
Denne studien fant også økt uttrykk for LRAT i primær kolorektal kreft sammenlignet med normal colonic epitel. Dette funnet ser ut til kontrast med tidligere studier av andre krefttyper, inkludert blærekreft [73], brystkreft [74] og prostata kreft [75] som har foreslått redusert LRAT uttrykk i kreftceller enn i disse studiene et relativt lite antall kreftprøver ble analysert og hovedsakelig biokjemiske analyser av hele tumorekstrakter ble brukt som resulterer i vurderingen av en «gjennomsnittlig nivå» som tumor stroma og nekrotisk vev vil ha blitt inkludert. Det var signifikant sammenheng mellom LRAT uttrykk i både hele pasienten kohorten og MMR dyktige svulster når LRAT skår ble dikotomiserte i negativ /svak /moderat og sterk. Denne foreningen ble ikke så markert for andre loddepunkter og var mindre robust enn observert for CYP26B1 i form av prognostiske betydninger.
Hovedproblemet med de fleste typer kreft, inkludert tykktarmskreft, er metastatisk sykdom og behandling er vanligvis rettet mot metastaser selv fenotypisk vurdering av hvilken behandling beslutninger er ofte laget ved analyse av primære vevsprøver. I motsetning til de veldefinerte molekylære hendelser som fører til utvikling av tykktarmskreft de samme veiene som metastaser har fått mye mindre oppmerksomhet [76]. Denne studien ble utformet for å inkludere vurdering av fenotypisk uttrykk i både primærsvulster og deres tilhørende lymfeknutemetastase. Det ble funnet at det ikke var noen forskjell i ekspresjon i CYP26A1 eller CYP26B1 mellom primære tumorer og tilsvarende lymfeknutemetastase. Imidlertid LRAT viste signifikant reduksjon i ekspresjon i lymfeknutemetastaser sammenlignet med de tilsvarende primære svulster. Dette tyder både primær tumorfaktorer og microenvironmental faktorer er involvert i reguleringen av uttrykket av disse enzymene i metastasering av tykktarmskreft. De potensielle konsekvensene av endret uttrykk for CYP26A1, CYP26B1 og LRAT med metastatisk kolorektal kreft celler og deres bidrag til en pro-metastatisk fenotype er skissert i figur 6.
A.
