Abstract
Bakgrunn
Sirkulasjons endotelceller og mikropartikler har prognostisk verdi i kreft, og kan være prediktorer for respons på kjemoterapi og antiangiogenic behandlinger. Vi har undersøkt den prognostiske verdien av sirkulerende endotelceller og mikropartikler hos pasienter behandlet for avansert ikke-småcellet lungekreft.
Metodikk /hovedfunnene
Perifere blodprøver ble tatt fra 60 pasienter før første linje, platina-basert kjemoterapi +/- bevacizumab, og etter den tredje syklus av behandlingen. Blodprøver fra 60 friske frivillige ble også oppnådd som kontroller. Sirkulerende endotelceller ble målt ved hjelp av en immunomagnetisk teknikk og immunfluorescens-mikroskopi. Fosfatidylserin-positive mikropartikler ble evaluert ved flow cytometri. Mikropartikkel-mediert prokoagulerende aktivitet ble målt ved hjelp av Endogen trombindannelse assay. Resultater: pre- og etter behandlingsperioden nivåer av markører var høyere hos pasienter enn hos kontrollgruppen (p 0,0001). Forhøyede nivåer av mikropartikler var forbundet med lengre overlevelse. Forhøyede forbehandling nivåer av sirkulerende endotelceller var assosiert med kortere overlevelse.
Konklusjon /Betydning
sirkulerende nivåer av mikropartikler og sirkulerende endotelceller korrelerer med prognose, og kan være nyttig som prognostiske markører hos pasienter med avansert ikke-småcellet lungekreft
Citation. Fleitas T, Martínez-salg V, Vila V, Reganon E, Mesado D, Martín M, et al. (2012) Sirkulasjons endotelceller og Mikropartikler prognostiske markører i Avansert ikke-småcellet lungekreft. PLoS ONE 7 (10): e47365. doi: 10,1371 /journal.pone.0047365
Redaktør: Rossella Rota, Ospedale Pediatrico Bambino Gesu «, Italia
mottatt: 20 april 2012; Godkjent: 11 september 2012; Publisert: 15 oktober 2012
Copyright: © Fleitas et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble støttet delvis av en bevilgning på Fundación para la INVESTIGACION, Hospital Universitario La Fe – Bancaja. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser. Følgende bransjer: Roche Pharma, Amgen, Lilly, MSD, og Bayer bidratt finansielt til kjøp av reagenser og for å ansette en laboratorietekniker i henhold til prosedyre for stiftelsen av Hospital La Fe for donasjoner, uten noen form for interesse i resultatene av studien, og de har ikke deltatt i noen andre aspekter i study.This endrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
Lungekreft er en av de ondartede svulster med høyest forekomst over hele verden. Ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) representerer mer enn 80% av lungekreft tilfellene, og de fleste av dem har avansert eller metastatisk sykdom ved diagnose [1].
Platinum-basert kjemoterapi er standard behandling for avansert lungekreft. Flere platina dubletter brukes i dag med tilsvarende effekt, men ulike toksisitetsprofilene [2]. Fremskritt i forståelsen av kreft biologi har drevet utvikling av legemidler mot spesifikke molekylære mål, så som epidermal vekstfaktor-reseptor (EGFR) og vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF) og dens reseptorer (VEGFRs). Noen cytotoksiske midler og målrettede legemidler er tryggere eller mer effektive i bestemte histologiske subtyper, og dermed gir mer personlige behandlinger [3]. Bevacizumab, en humanisert antistoff mot VEGF, har vist en beskjeden økning i progresjonsfri overlevelse (PFS) og total overlevelse (OS) i NSCLC når kombinert med kjemoterapi. Imidlertid er bruken begrenses til pasienter med ikke-plateepitel histologi [4]. Til tross for disse fremskrittene, bare en brøkdel av pasienter har nytte av behandlingen, og de fleste av dem dør innen 2 år etter diagnose. Derfor er det et behov for biomarkører som lar identifisere pasienter som er mer sannsynlig å svare på behandling.
Sirkulasjons endotelceller (CECs) er markører for vaskulær skade [5] som kan ha klinisk relevans i kreft [6 ] – [7]. CEC telling økes hos kreftpasienter [8] – [9] og korrelerer med tumorprogresjon [10]. Det har blitt foreslått at kvantifisering av CECs er nyttig for å identifisere pasienter som kan dra nytte av angiogeneseinhibitorer og for overvåkning av behandling reaksjon [11]. I avanserte pasienter med kolorektal kreft, er en høy baseline CEC teller forbundet med en kortere median PFS [12] – [13]. Hos pasienter med brystkreft og med NSCLC, er et høyt nivå av CEC teller forbundet med en forlenget PFS [11], [14].
Mikropartikler (MPS) er små vesikler (100 nm-1 um) som direkte bud fra plasmamembranen [15] – [16]. De er utgitt av forskjellige celler, inkludert blod, endotel- og tumorceller [16] – [17]. Eksponeringen av fosfatidylserin på den ytre overflate av membranen er en spesifikk karakteristisk for MPS [18]; deres tilstedeværelse øker i betydelig grad den prokoagulerende aktivitet av MP’er ved å fremme sammenstillingen av komponentene i koagulasjonskaskaden. Videre tumorceller genererer et oppriss av MP’er som uttrykker vevsfaktor [19] – [21], som gir dem et prokoagulerende potensiell [22]. I denne forbindelse er det blitt rapportert at nivåer av sirkulerende MP’er er korrelert med Endogen trombindannelse (ETG) [23]. MP’er er forhøyet hos kreftpasienter, og de spiller en rolle i cancer hyperkoagulerbarhet [20] – [21], [24] – [26]. I tillegg utslipp av mikrovesikler, slik som exosomes og MPS, har viktige patologiske roller i tumorprogresjon, og letter frigjøring og spredning av kreftceller for å generere metastaser [27]. Parlamentsmedlemmer hentet fra perifert blod av kreftpasienter kan gi relevant informasjon om prognose og behandlingsrespons.
Formålet med denne studien var å vurdere CECs, parlamentsmedlemmer og MP-mediert prokoagulantaktiviteteten hos pasienter med avansert NSCLC, før og etter standard kjemoterapi, for å analysere deres prognostiske verdi og å etablere sin mulig sammenheng med kreftsvulster.
Materialer og metoder
studie~~POS=TRUNC og pasienter
Denne prospektive studien inkluderte påfølgende pasienter med NSCLC behandlet ved Medical Oncology Department of La Fe universitetssykehus med førstelinjebehandling av platinabaserte dubletter. Bevacizumab ble lagt til behandling når indikeres. For å bli inkludert i studien ble pasientene nødvendig for å oppfylle følgende kriterier: alder 18 år; stadium IIIB eller stadium IV histologisk bekreftet NSCLC; levealder ≥12 uker; ECOG performance status (PS) ≤2 og tilstrekkelig nyre-, lever- og benmargsfunksjonen.
Staging ble bestemt av bryst og buk computertomografi (CT) og kroppen proton emission tomography (PET) skanning. Tre uker etter den tredje syklus av behandling, ble CT-basert klinisk vurdering utført ved hjelp av Response evalueringskriterier for solide tumorer (RECIST) [28]. Etter behandling ble pasientene vurderes hver tredje måned. Blod biomarkører ble evaluert ved start og tre uker etter den tredje syklus av behandlingen. Kontrollgruppen bestod av friske personer matchet i kjønn og alder med pasienter. Pasienter og kontroller gitt skriftlig informert samtykke. Denne studien ble godkjent av institusjonelle Biomedical forskningsetiske komité.
Biomarker Evaluering
Blodprøver ble innhentet av cubital ikke-traumatisk vene punktering, og samlet inn Vacutainer ™ plastrør (BD Diagnostic) med to forskjellige antikoagulanter: K3 EDTA (4,3 mg) for CECs, og natrium-citrat (129 mM) ved et forhold på 1:09 (v /v, natriumsitrat /blod) for MPS og ETG. Prøvene ble oppbevart ved 4 ° C og behandlet mellom 2 og 4 timer etter innsamling. Citrat blodprøver ble sentrifugert ved 1500 x g i 30 minutter ved 4 ° C for å oppnå blodplate-fritt plasma, og deretter lagret ved -80 ° C for å tillate senere satsanalyse.
Kvantifisering av totalt Mikropartikler
Plasmaprøver prøver~~POS=HEADCOMP som inneholdt MP suspensjoner ble analysert ved hjelp av strømningscytometri. Annexin V-FITC konjugater ble anvendt for å detektere rullestol fosfatidylserin på MP membraner. Ti pl av frosne plasmaprøver ble fortynnet i 500 pl av HEPES-buffer inneholdende 2,5 mM CaCl
2 (pH 7,4). Prøvene ble så inkubert i 60 minutter ved 4 ° C i mørke med en pl FITC-Annexin V (TACS AnnexinV, Trevigen Inc). Oppkjøpet av hendelser ble kvantifisert i en EPICS XL- cytometer (Beckman Coulter) ved høy strømningshastighet i 2 minutter under som 325 mL av denne suspensjonen ble analysert. Standard fluorescerende perler av ulik diameter ble brukt til størrelse kalibrering (0,5-3,0 mikrometer, Megamix, BioCytex) og å sette porten til MP deteksjon ved en diameter 0,5 til 1 pm, etter en konsensus retningslinje på MP måling [29]. Størrelsen på parlamentsmedlemmer korrelert med fremover scatter (FS) og deres detaljnivå med side scatter (SS) parametere. Lese-kanaler FS, ble SS og fluorescens innstilt på logaritmisk gevinst. For å begrense bakgrunnsstøy fra støv og krystaller, ble alle utvannings buffere filtreres med 0,22 mikrometer filtre (Millipore). For å skille MP’er fra hendelser på grunn av støy, MP’er ble identifisert som partikler 0,5 og mindre enn 1,0 mm i diameter, og positivt farget for Annexin V. MP suspensjon i plasma ble fremstilt uten kalsium som en negativ kontroll. Antallet FITC-Annexin V positive parlamentsmedlemmer ble beregnet og uttrykt som hendelser per mL plasma.
trombingenerering Målinger
etg analyser ble utført for å vurdere in vitro trombin kapasitet på plasma ved hjelp av kalibrert automatiserte thrombogram (CAT, Thrombinoscope BV). Åtti ul av frosne plasmaprøver ble fordelt i 96-brønners rundbunnede mikrotiterplater (Greiner Bio-One, ref650061, USA). Hver prøve krever to brønner. Twenty ul standard trombin kalibrator (TS20.00 trombin kalibrator, Thrombinoscope BV) ble satt til én brønn, og 20 mL av fluorogent trombin underlaget med kalsium (TS50.00 Fluka Kit Thrombinoscope BV) ble satt til begge brønnene for å starte ETG med kontinuerlig Sammenlignet med trombin kalibratorreagens. Trombin aktivitet ble målt som fluorescens i en Fluoroskan Ascent leser fluorimeter (Thermo Labsystems) utstyrt med en 390/460 filter sett. Ingen eksogene vevsfaktor eller fosfolipider ble tilsatt. Trombin generasjon Kurver ble beregnet ved hjelp av Thrombinoscope programvare og resultatene ble uttrykt som trombintoppløsning (nM) (høyde av kurven).
Kvantifisering av Sirkulasjons endotelceller
Isolering og kvantifisering av CECs var utført i fullblod ved en immunomagnetisk teknikk, etter en konsensus-protokollen [30]. CECs ble isolert fra fullblod ved 4 ° C med PanMouse M450 Dynabeads (Dynal, Oslo, Norge) belagt med sEndo1 (Biocytex, Marseille, Frankrike), et monoklonalt antistoff hevet mot endothelial antigen CD146. For å unngå ikke-spesifikk binding av leukocytter til CD146 belagte perler ble celler inkubert etter immunomagnetisk isolasjon med FITC-merket Ulex europaeus Lektin-en, (UEA1) (Sigma Aldrich, Inc) i 1 time i mørke, noe som bekrefter den endotelial natur de isolerte celler. Prøvene ble vasket og suspendert i buffer, og cellene tellet under fluorescens-mikroskopi ved anvendelse av en Nageotte kammer. Nuklerte celler 10 mikrometer i lengde, med mer enn fem immunomagnetiske perler festet og positiv UEA1 farging ble ansett som CECs. Konglomerater ble regnet som en celle. Antallet CECs ble uttrykt som celler per ml blod. Reproduserbarhet ble testet ved å utføre seks replikater av ti forskjellige prøver.
Statistical Analysis
Resultatene er gitt som middelverdier ± standardavvik (SD) for kontinuerlige variabler, og som prosenter for kategoriske variabler. Kolmogorov-Smirnov test ble brukt for å vurdere hvorvidt hver parameter fulgte en normalfordeling. Analyse av varians (ANOVA) med Bonferroni post hoc-analyse ble anvendt for å evaluere markør nivåforskjeller mellom prøvetyper (kontroll, forbehandling tilfeller og etter behandling tilfeller). Bivariat korrelasjon ble utført ved hjelp av spearmans korrelasjon test. OS og PFS ble analysert ved hjelp av Kaplan-Meyer-metoden, og overlevelseskurvene for subgrupper ble sammenlignet ved hjelp av log-rank test. Alle statistiske analyser ble utført med SPSS programvare, versjon 15.0 for Windows (SPSS Inc., Chicago, Illinois, USA). Sannsynlighets verdier og 0,05 ble ansett som statistisk signifikant
Resultater
pasientkarakteristika, behandlinger og Outcome
Mellom januar 2009 og september 2010, seksti pasienter og seksti friske personer var. inkludert. Tabell 1 oppsummerer de kliniske karakteristika for studiegruppen. Behandlinger mottatt av pasienter er beskrevet i tabell 2. Det mest bemerkelsesverdige behandlingsrelatert toksisitet var hematologisk, med 15% av grad 3-4 nøytropen feber, og to dødsfall fra denne årsak (både pasienter fikk cisplatin + docetaxel). Bare to pasientene hadde tromboser under behandling: en pasient med lunge tromboembolisme, og en pasient med dyp venetrombose (både pasienter fikk cisplatin + docetaxel). To pasienter presenteres med alvorlig pulmonal blødning, en av dem er relatert til bevacizumab. Når det gjelder effekt, mer enn halvparten av pasientene en objektiv respons (58,3%). Median PSF var 10 måneder (95% KI, 7,9 til 12 måneder) og median OS var 11 måneder (95% KI, 8,8 til 13,1 måneder). Bare 36 pasienter var i live på den tiden planlagt for den andre blod utvinning.
Sirkulasjons Marker Nivåer og korrelasjonsanalyse
Nivåer av CECs, parlamentsmedlemmer og ETG i pasienter og kontroller er vist i tabell 3. De midlere nivåer av CECs og MPS var signifikant høyere (P 0,0001) hos pasienter sammenlignet med kontroller. Imidlertid ble det ikke observert signifikante forskjeller mellom pre- og etter behandlingsperioden nivåer av CECs og parlamentsmedlemmer. Nivåer av ETG ble økt betydelig hos pasienter, bare i forbehandling prøver (P 0,01)
De sammenhenger mellom nivåer av sirkulerende markører viste at MP nivåer positivt korrelert med ETG nivåer, både før (Spearman r. = 0,60, P 0,001) og etter behandling (Spearman r = 0,68, P . 0.001)
sirkulasjons~~POS=TRUNC markører og klinisk resultat
analysen av assosiasjoner mellom sirkulerende markører og klinisk utfall viste at basale politikere nivåer 3278 MP /mL (tilsvarende 99
th persentil i kontroller) var assosiert med bedre PFS (15 vs 9 måneder, p = 0,04) og OS (16 vs 10 måneder, p = 0,04) . Ingen slik sammenheng ble funnet for CECs eller ETG (tabell 4). Videre basalnivåer av CECs 152 celler /ml (tilsvarende 75
persentil hos pasienter) var assosiert med en dårligere OS (16 måneder vs 9 måneder henholdsvis; log rank 4,3; p = 0,04) (Figur 1 )
den øvre referansegrense ble beregnet som verdier av CECs 152 celler /ml (tilsvarende de
th persentil av pasientgruppen) CECs 75:.. sirkulerende endotelceller
Diskusjoner
resultatene fra denne studien viser at CEC, er MP, og eTG nivåer forhøyet hos pasienter med NSCLC sammenlignet med friske kontroller. Kjemoterapi ikke endre nivåene av disse markørene. Vi har også funnet en sammenheng mellom høye MP-nivåer, både før og etter behandling, og overlevelse. Dessuten har vi observert en sammenheng mellom nivåene før behandling av CECs og overlevelse.
Våre resultater viser en sammenheng mellom høy pre- og etter behandlingsperioden nivåer av parlamentsmedlemmer og lengre overlevelse. Til vår beste kunnskap, er dette den første studien som viser en slik sammenheng hos pasienter med NSCLC. Det er økende interesse for karakterisering av parlamentsmedlemmer og i deres potensielle rolle som biomarkører i ulike sykdommer [31]. Hos pasienter med kastrering-motstandsdyktig prostatakreft, ble høye blodplate-avledet MP-nivåer assosiert med en kort overlevelse [32]. En studie av pasienter med respiratorisk distress syndrom viste en positiv sammenheng mellom høye nivåer av leukocytter-avledet parlamentsmedlemmer og overlevelse [33]. Resultater fra en eksperimentell studie med en murin Lewis lungekarsinom modell, viste at lymfocytt-avledet MP’er som utøves antiangiogene og proapoptotiske effekter som førte til inhibering av tumorveksten ved reduksjon av VEGF-nivået [34]. Selv om vi har ikke karakteriserte parlamentsmedlemmer av deres mobilnettet opprinnelse, kan disse funnene gir og forklaring på den positive sammenhengen mellom MP nivåer og overlevelse at vi har funnet i denne studien.
En sterk korrelasjon ble observert mellom MP nivåer og ETG. Dette funnet er i samsvar med tidligere data, noe som indikerer at tilstedeværelse av MPS i plasma i betydelig grad påvirker ETG i både normal [35] og patologiske tilstander [23], [36]. Det økte antallet sirkulerende MPS og deres korrelasjon med høy etg nivåer observert i vårt studium bekrefter rollen til ETG i kreft hyperkoagulerbarhet, som tidligere rapportert [29] – [33]. Videre, som nylig vist, måling av ETG kan identifisere kreftpasienter som har høy risiko for venøs tromboemboli [37].
Vi observerte en sammenheng mellom høye nivåene før behandling av CECs og dårlig overlevelse. Det er ingen konkluderende data for den prognostiske verdi av CECs i kreft. De fleste studier er enig i at høye nivåer av CECs er assosiert med en dårlig prognose [10], [12] – [13]. Imidlertid har andre studier som tilbys kontroversielle resultater [11], [14]. Beerepoot et al. [10] har studert innholdet av levedyktige CECs i pasienter med forskjellige typer kreft; De fant at CEC teller var høyere hos pasienter enn hos friske personer, og at kjemoterapi økt CEC teller. Disse forfatterne definert CECs som CD146 +, med ytterligere farging med CalceinAM å kvantifisere levedyktige celler; ingen andre markører, slik som UEA1, ble brukt til å bekrefte endotelial arten av cellene. Studien av Kawaishi et al. [14] fant en sammenheng mellom økte nivåene før behandling av CECs og god prognose hos pasienter med NSCLC. I denne studien ble den endoteliale markør CD146, DNA-markør DAPI, og aktiverings markør CD105 brukes for å velge CECs, sammen med CD45 for å forkaste hematopoetiske celler. I motsetning til pasienter med kolorektal kreft behandles med kjemoterapi og bevacizumab, Ronzoni et al. [12] funnet hvile CEC teller å være lavere hos pasienter som oppnådde en radiologisk respons sammenlignet med pasienter som ikke oppnår respons. Studien av Matsusaka et al. [13] viste at pasienter med før behandling av CXCR4-positive CECs 20% av mononukleære celler hatt en verre PFS og OS. Disse resultatene er i samsvar med de som ble oppnådd i vår studie, der høye nivåer av CECs var assosiert med dårlig OS. Gitt de ulike teknikker som brukes for kvantifisering av endotelceller arbeides for å identifisere de mest hensiktsmessige cellulære fenotyper for hver klinisk situasjon og til å forklare dagens kontroverser.
Våre funn gi nye data på den prognostiske verdien av parlamentsmedlemmer og CECs hos pasienter med NSCLC. Rollen til parlamentsmedlemmer og CECs som potensielle biomarkører hos pasienter med NSCLC, behandlet med konvensjonell kjemoterapi eller målrettet terapi, garanterer videre studier, siden en bedre forståelse av sin rolle kan åpne nye perspektiver innen diagnostikk og behandling.
takk
forfatterne ønsker å takke Rafael Rosell og Stefano Indraccolo for å gi nyttige kommentarer på manuskriptet. De takker også Josefa Llorens, Ursula Salinas og Adela Mañez for deres teknisk assistanse.
